Identyfikacja białek łączących się z fragmentami tryplek-sowymi stanowi kolejny dowód na występowania tych struktur in vwo. Miedzy innymi wyodrębniono dwa białka 7 komórek HeLa, które preferencyjnie wiążą się z trypleksa-mi [25,26]. Istotne w tym kontekście wydaje się wyjaśnienie znaczenia struktur trypleksowych w regulowaniu procesów transkrypcji. Szereg prac wskazuje na aktywność tryplek-sów jako czynników trans-działających miedzy innymi w komórkach myszy, gdzie sekwencje poli(dG) występują po­wyżej (upstream) genów działających jako aktywatory [27], co więcej długość tych sekwencji ma istotne znaczenie dla tego procesu; dG₂₇__3U działa aktywująco, podczas gdy dC₃_ nie daje takiego samego efektu. Rezultatem wprowadzania fu ritro traktów poli(dG) do superhelikalnego plazmidu było utworzenie H-DNA, gdy sekwencje te miały długość co najmniej 32 par zasad, podczas gdy sekwencje krótsze niż dG_3fl nie wywoływały zjawiska H-DNA. Wskazuje to na możliwość tworzenia przez poli(dG) intramolekularnych trypleksów i blokowanie fmns-transkrypcji.

Struktury trójniciowe mogą się tworzyć również przej­ściowo w procesie homologicznej rekombinacji. Wprowa­dzenie sekwencji poli(dG).poli(dC) pomiędzy dwa powtó­rzenia na drodze aktywnej transkrypcji in vivo wywołuje homologiczną rekombinację najprawdopodobniej w wyni­ku powstania *H-DNA i następującego potem powtórzo­nego odtworzenia rozdzielonych sekwencji, stymulującego rekombinację [28], a powstająca w wyniku utworzenia H-DNA pojedyncza nić może działać jako łańcuch inwazyjny w rekombinacji homologicznej [29]. Innym przykładem jest udziai trójniciowego *H-DNA tworzącego się z polimorficz-nych homopurynowo — homopirymidynowych sekwencji niezbędnych do replikacji genomu wirusowego Epsteina-Barra. Udowodniono, że w tym przypadku mutacje punkto­wo hamują zarówno replikację jak i tworzenie *H-DNA [30]. Wskazuje to na istotną rolę w procesie rcplikacji nie tylko sekwencji DNA, ale także struktur trzeciorzędowych wy­woływanych obecnością traktów polimorficznych. Istnieje szereg pośrednich dowodów na występowanie podobnych .struktur między innymi w genomowym DNA człowieka, w którym występują trakty homopirymidynowo-homopury-nowe (Pyr-Pur), stanowiące ponad 'l % całej puli DNA [31].

Tworzenie struktur trypleksowych in vivo nie jest uwa­runkowane obecnością specyficznych białek, ale istnieniem odpowiednio długich traktów purynowo-pirymidynowych [32]. DNA w organizmach eukariotycznych występuje w postaci superhelikalnej, ściśle upakowane w nuklcosomach i jest związane z białkami histonowymi, utrudniającymi tworzenie stabilnych struktur wyższego rzędu, w tym try­pleksów [33]. Kompleksy DNA-białka są strukturami dy­namicznymi, dzięki czemu możliwe jest rozpoznanie heli-kalnego DNA przez specyficzne sekwencje wiążące białka, a także przypuszczalnie przez fragmenty homopurynowe lub homopirymidynowe, prowadzące do przejściowego utworzenia struktur trójniciowych [34]. Wymuszenie two­rzenia takich struktur poprzez wprowadzenie do komórki komplementarnych oligonukleotydów tworzących trypleks (TFO) może znaleźć zastosowanie w biochemii i biologii molekularnej. Wykazano bowiem, że utworzenie struktur trypleksowych w regionach promotorowych powoduje za-

blokowanie dostępu czynników transkrypcyjnych i prowa­dzi do inhibicji aktywacji genów in ińtro, w tym również w komórkach ssaków^r. Zastosowanie TFO stwarza możliwość wyciszenia i korekcji genów poprzez wywołanie trwałych zmian w ich sekwencji. Powstawanie struktur tryplekso­wych wywołanych wprowadzeniem TFO na metabolizm DNA oraz potencjalne możliwości korekcji genów rekom-binantowych i procesów naprawczych in ińtro oraz in rwo są przedmiotem intensywnych badań [35,36]. W roku 200U wykazano po raz pierwszy, że TFO mogą indukować muta­cje w określonych obszarach genomu w komórkach soma­tycznych dorosłych myszy transgcnicznych posiadających wbudowane plazmidowe geny reporterowe supF i c/7 [37]. Wynik ten stanowił potwierdzenie, że procesy kontrolo­wanej modyfikacji genomu spowodowane utworzeniem struktur trypleksowych mogą być przeprowadzone w orga­nizmach zwierzęcych, co stanowi istotny krok w kierunku zastosowań medycznych i rozwoju terapii genowej [38,39].

Wiadomo obecnie, że znacząca część sekwencji pirymidy-nowo — purynowych, zdolnych potencjalnie do tworzenia struktur trypleksowych (H-DNA) w genomie organizmów eukariotycznych jest zlokalizowana w regionach 5' genów globulin p i y, genu receptora interleukiny-2 oraz genu c-myc [40,41]. Ponadto struktury trypleksowe odgrywają także znaczącą role w organizowaniu się chromosomów. Trakty purynowo-pirymidynowe mogą tworzyć pętle DNA, które powstają w miejscu tworzenia się trypleks u na zasadach nu­kleinowych [42], Stwierdzono, że liniowy in nitro plazmid, zawierający rozdzielone trakty homopurynowe i homopi­rymidynowe może in vivo tworzyć pętle cykliczne lub w kształcie litery O, będące najprawdopodobniej rezultatem tworzenia trypleksu [43].

STRUKTURY CZTERONICIOWE - TETRAPLEKSY

Bogate w reszty guaninowe sekwencje DNA mogą two­rzyć trwałe struktury, będące rezultatem oddziaływań czterech reszt guaninowych, tworzących tzw. tetradę G (G-tetrapleks) w fizjologicznych warunkach stężenia jed-nowartościowych kationów sodu lub potasu. Szczególnie dużo uwagi poświęcono strukturze i funkcjom sekwen­cji telomerowych znajdujących się na końcach liniowego chromosomalnego DNA [44], odpowiedzialnych m. in. za ochronę końców chromosomów przed uszkodzeniami ge­nów i nieprawidłową rekombinacją, uczestniczących w kontroli ekspresji genów i replikacji homologicznej i innych procesach [45,46,47]. Obecnie uważa się, że wiele funkcji telomerów związanych jest ze zdolnością do tworzenia in vivo struktur tetrapleksowych. Wykazano, że szereg białek (np. RAP1, białko represorowo/aktywatorowe z drożdży) o wysokim powinowactwie do fragmentów telomerycTnych DNA wykazuje również powinowactwo do struktur tetra­pleksowych a nawet ułatwia tworzenie takich struktur in vivo, regulując jednocześnie aktywność telomerazy i wska­zując na potencjalne znaczenie terapeutyczne tego procesu w terapii przeciwnowotworowej [48]. W ostatnich latach zidentyfikowano szereg helikaz odpowiedzialnych za roz­platanie G-tetrapleksów, m. in. w Saccharorm/ces cereiusiae {helikaza Sgs1) [49] czy helikaza związana z syndromem Wernera, odpowiedzialna za rozplatanie powtarzających się sekwencji d(CGG) [50], co stanowi dodatkowy dowód

233

Postępy Biochemii 52 (3) 2006

---