klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,doskonalenie szczepów

Doskonalenie szczepów – mutacja

Mutacja - nagłe pojawienie się komórki zmienionej w populacji zdolnej do przekazywania zmienionych cech potomstwu.

Mutant – forma o zmienionym genotypie

Mutageneza – proces, wynikiem którego są mutacje.

Czynniki mutagenne

(5-bromouracyl, 5-bromodeoksyurydyna, 2-aminopuryna)

Chemiczne modyfikacje zasad:

Kwas azotawy – oksydatywna deaminacja zasad, zmiana specyficzności parowania zasad.

Ulepszanie szczepów związane jest z:

- wywołaniem mutacji

- selekcją i ocena mutantów

Selekcja mutantów

Zespół technik, które mają zapewnić szybką i efektywną ocenę efektów mutagenezy i wyodrębnieniem komórek o pożądanych cechach.

Hodowle ze wskaźnikiem chemicznym

Testy wykorzystujące odpowiedni indykator wykazujący zróżnicowanie kolonii. (wskaźnik pH – tworzenie kwasów i zasad, pożywki z celulozą barwioną czerwienią Kongo – enzymy celu lityczne)

Wskaźniki mikrobiologiczne – izolacja mutantów auksotroficznych

Prototrofy – organizmy, które żywią się na pożywkach mineralnych (same mogą syntezować część związków)

Auksotrofy – wymagają pożywek maksymalnych.

Zastosowanie:

Producenci antybiotyków – musi być szczep kontrolny, który jest wrażliwy na działanie antybiotyków. Ustala się słupki i posiewa testowy mikroorganizm

Producenci aminokwasów – podłoże ze szczepem auksotroficznym testowym, który potrzebuje do wzrostu określonego aminokwasu.

Mutanty stosowane w produkcji penicyliny pochodzą od dzikiego szczepu Penicillum chrysogenum Q 176 wprowadzonego do przemysłu w 1945.

Mutanty o zwiększonej produktywności i wybiórczości – produkcja L-lizyny.

2 typy mutantów:

- wyeliminowanie dehydrogenazy homoserynowej

- zmiana charakteru kinazy asparaginowej (zmieniona została wrażliwość na hamowane produkty)

Hybrydyzacja

naturalna hybrydyzacja wiąże się z przekazaniem informacji genetycznej z komórki dawcy do komórki biorcy w wyniku ich fizycznego kontaktu i polega na wymianie fragmentów DNA pomiędzy ich chromosomami albo genoforami.

Badania genetyczne mają sens tylko wtedy, kiedy u organizmów występuje cykl płciowy lub przynajmniej cykl paraseksualny.

Naturalna hybrydyzacja zachodzi z częstotliwością 10-6.

Przeszkody: sztywna ściana komórkowa, ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony komórkowej.

Fuzja protoplastów – fuzja wymuszona

Protoplasty (komórka bez ściany komórkowej)

Sferoplasty (częściowo zachowana ściana komórkowa utrzymuje się na drodze enzymatycznej hydrolizy ściany komórkowej w warunkach zapewniających osmotyczną stabilizację struktury).

Związki wybrane do stabilizacji środowiska osmotycznego.

Pożywienie – toksyczność – nie hamuje

- sole nieorganiczne, sacharydy, alkohole cukrowe w buforze

Protoplasty bakterii:

Gram+ lizozym

Gram - lizozym + EDTA + warunki jonowe

Protoplasty grzybów – sok żołądkowy ślimaka

Najłatwiej otrzymać protoplasty z komórek pochodzących z fazy wzrostu wykładniczego.

Protoplasty mogą łączyć się ze sobą gdy zbliżą się do siebie na odległość mniejszą niż 1nm.

PEG – inicjator fuzji

Podczas fuzji tworzy się układ heterokariotyczny w którym z dużą częstotliwością następuje kariogamia i rekombinacja pomiędzy genoforami. Następnie w procesie samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji następuje segregacja nowych genotypów. Protoplasty hoduje się potem w odpowiedniej pożywce.

Selekcja rekombinantów

Wymaga genetycznie trwałych markerów fizjologicznych. Najczęściej używa się szczepów auksotroficznych o różnych wymaganiach pokarmowych, mutantów oddechowych lub opornych na dany antybiotyk.

Zastosowanie fuzji protoplastów pozwala na rekombinację zarówno wewnętrzną jak i zewnątrzkomórkową oraz rekombinację więcej niż 2 genów.

Technologia rekombinacji DNA – przenoszenie genów z jednego organizmu na drugi. Otrzymuje się komórki zdolne do syntezy określonego białka.

Narzędzia rekombinacji

- restryktazy – endonukleazy restrykcyjne – rozpoznają specyficzne sekwencje palindromowe, sekwencje w dwuniciowym DNA i hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w obu niciach w miejscu rozpoznanej sekwencji lub w niewielkiej odległości od tego miejsca.

- metylazy – towarzyszą restryktazom (system chroniący) – metylują zasady purynowe i pirymidynowe w obrębie miejsca rozpoznawanego przez restryktazy w macierzystym DNA np. metylaza EcoRI.

- egzonukleazy – hydrolizują 1-niciowe DNA lub RNA, usuwają fragmenty 1-niciowe lub 2-niciowe

- fosfataza alkaliczna – usuwa końce 5’ gr. Fosforanowej, linearyzacja wektora

- odwrotna transkryptaza – synteza RNA komplementarnego do mRNA

- polimerazy DNA – wykorzystywane do syntezy dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowej

- lipaza – łączą polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5’ do polinukleotydów posiadających wolne grupy 3’-OH

- rybonukleazy – hydrolizują RNA

- enzymy lityczne – do pozbycia się ściany komórkowej

Technologie rekombinacji DNA – wektory

- ogólnego zastosowania - pBR322

- ekspresyjne do efektywnej syntezy białka

- klonowanie sekwencji promotorowych

- ekspresyjno – elekcyjne – do produkcji egzoproteiny

- mutagenezy insercyjnej

Klonowanie – etapy:

  1. Izolacja lub synteza genu

  2. Łączenie genu z wektorem

  3. Wprowadzenie do komórki gospodarza

  4. Selekcja klonów

  5. Praktyczne wykorzystanie klonów

Ad1.

- cięcie losowe DNA – pierwsza metoda izolacji DNA, gen alfa-amylazy z Bacillus jakiegoś tam w Bacillus subtillis

- chemiczna synteza genu – stosowana do krótkich polipeptydów

- synteza cDNA – procedura, która wykorzystuje jednoniciowy mRNA jako matrycę do syntezy komplementarnego DNA

- synteza genów metodą PCR





Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Klimek Ochab, mikrobilogia przemysłowa, pytania na egzamin
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,Fermentowane surowce roślinne
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,workowce
notatek pl klimek Ochab, mikrobiologia przemys owa,Bakterie kwasu octowego
notatek pl klimek Ochab, mikrobiologia przemys owa,przemys owe wykorzystanie ple ni
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,Zanieczyszczenia mikrobiologiczne żywności
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa, technologie ścieków
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa, selekcja mikroorganizmów
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,przemysłowe wykorzystanie pleśni
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,PROMIENIOWCE
Klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa, identyfikacja mikroorganizmów
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,drożdże
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,Analiza żywności mikrobiologicznej
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa, zastosowanie komorek immobilizowanych
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,surowce i materiały w biotechnologii
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa, biosynteza metabolitów
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,Mikroorganizmy w biotechnologii
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,Bakterie kwasu octowego
klimek Ochab, mikrobiologia przemysłowa,Zatrucia pokarmowe

więcej podobnych podstron