Wykład 3
Ascomycetes – workowce
Mają grzybnię podzieloną septami, rozmnażają się płciowo – tworzą worki, w których tworzą się zarodniki.
Przykłady:
- Chaetomium – wytwarza ciała owoconośne (butelkowaty kształt, pokryte rzęskami, ogromna siła celulityczna – zdolność do wytwarzania celulaz – rozkład błonnika) wytwarzają je również grzyby podstawkowe.
- Byssochlamys fulva – atakowanie pasteryzowanych przetworów.
- B. nivea – atakowanie pasteryzowanych przetworów, atakuje truskawki
Deuteromycetes
Nie rozmnażają się generatywnie, rozmnażają się wegetatywnie. Występuje cykl paraseksualny – strzępki 2 różnych plech zbliżają się do siebie, tworzą się poprzeczne mosty – anastomozy – dochodzi do plazmogamii, powstaje grzybnia zawierająca jądra obu plech – powstaje heterokarion. Czasami zlewają się jądra (kariogamia). Po zlaniu 2 jąder różnych powstaje diploida, która ulega samorzutnej haploidyzacji bez mejozy.
Przykłady:
Aspergillus
Jest to kropidlak, występuje w powietrzu, glebie, zawiera różne enzymy hydrolityczne, produkuje różne substancje – kwas cytrynowy
- produkty o małej zawartości wody – A. glaucus, A. niger
- surowce roślinne – zboża, nasiona, orzeszki arachidowe – A. ochraceus, A. oryzae, A. flavus, A. parasitius
- ściany, materiały budowlane – A. niger, A. flavus, A. oryzae
Aspergillus produkuje aflatoksyny.
Penicillum
Pędzlak, zespół konidalny, występuje w glebie i powietrzu, saprofity – rozkład materii organicznej, należy do pleśni magazynowych, atakuje owoce
- zielona zgnilizna – P. digitalum
- niebieska zgnilizna – P. italicum
- mokra zgnilizna – P. expansum
- sery – P. camemberti, P. roqueforti
Odpowiedzialne również za degradację ksenobiotyków
Fusarium
Mają podbarwioną grzybnię od spodu, wytwarzają przetrwalniki, chlamidospory, znoszą wysoką temperaturę, niską temperaturę i wysoką wilgotność. Przeżywają mycie i pasteryzację, saprofity, mogą pasożytować na roślinach - zboże, buraki cukrowe. Fitopatogenność związana z produkcją pektynaz.
Fuzarioza kłosów, wytwarzanie miko toksyn, które mają właściwości hormonalno-estrogenne.
F. solani, F. oxysporum, F. moniliforme
Botritis
Szara grzybnia, uczestniczą czynnie w rozkładzie celulozy i pektyn, saprofity, mogą być pasożytami roślin
B. cinerea – pasożyt buraków cukrowych, zakażone hodowle pomidorów, atakowanie winorośli, wytwarzają substancje śluzowate
Alternaria
Rosną na czarno, z Aspergillus i Penicillum wchodzą w skład pleśni magazynowych. Silne alergeny.
Cladosporium
Grzybnia brunatna, jasne kulki z zielonymi włoskami, bardzo silne właściwości lipolityczne, należą do psychotropów, rozwijają się w warunkach chłodniczych.
C. herbarum, C. fulvum - pomidory, powodują plamistość liści
są silnymi alergenami.
Geotrichum
Jasna, luźna grzybnia, atak na masło, mleczarstwo, kiszonki – zdolność do stabilizacji kwasu mlekowego, silne właściwości lipolityczne.
G. candidum - saprofit, może być patogenem ludzkim, jama ustna, drogi oddechowe
Identyfikacja mikroorganizmów
Proces identyfikacji mikroorganizmów polega na określeniu przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku.
Szczep referencyjny – izolant danego gatunku, opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec).
Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujący co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA.
Identyfikacja taksonomiczna bakterii
Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe.
%G+C = (nG + nC)/(nA + nT + nC + nG) *100%
W obrębie rodzaju różnice w % molowych G+C nie mogą przekroczyć 10%
Klucz Bergey’a dotyczy tylko bakterii!!
Metody klasyczne – Procaryota
- morfologia komórki
- skład chemiczny ściany komórkowej
- obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych
- interakcje z innymi organizmami
- środowisko występowania
- patogenność
- wrażliwość na antybiotyki
- charakterystyka temperaturowa, pH
- stosunek do tlenu
- skład i ilość produktów fermentacji
- wymagania pokarmowe
- zdolność do tworzenia pigmentów
Metody biologii molekularnej – Procaryota
- analiza ilościowa kwasów nukleinowych (%G+C)
- homologia kwasów nukleinowych
Sekwencja polinukleotydów 16S rRNA
Metody klasyczne – Eucaryota
- sposób rozmnażania generatywnego
- patogenność
- ekologia
- budowa ściany komórkowej
- osmotolerancyjność i osmofilność
- czynniki pokarmowe
- tworzenie ureazy – drożdże
- zdolność do wytwarzania pseudogrzybni lub grzybni
- tworzenie pigmentów
- cechy hodowlane populacji
- sposób rozmnażania wegetatywnego
- cechy morfologiczne komórki.
Metody biologii molekularnej – Eucaryota
Takie same jak u Procaryota
Sekwencja polinukleotydów 18S rRNA
Metody biochemiczne – polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych.
Cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych. Wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo:
- wzrost lub jego brak
- reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem
- na podstawie reakcji chemicznej
Metody biofizyczne
Umożliwiają one identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów przez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych. Wyróżniamy tutaj metody elektroforetyczne i chromatograficzne.
Metody elektroforetyczne – skład białek jest charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej. Izolacja białek, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym – profil białkowy.
Metody chromatograficzne – skład kwasów tłuszczowych ściany komórkowej jest charakterystyczny dla danego gatunku przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli.
Metody biologii molekularnej
Metody oparte na badaniu homologii kwasów nukleinowych
Metoda hybrydyzacji – sondy genetyczne
Homologia > 60% - przynależność do gatunku
Homologia > 20 % - zgodność z danym rodzajem
Homologia < 5% - organizmy niespokrewnione
Gene Trak (sonda znakowana peroksydazą)
Gene Probe (sonda znakowana estrem akrydynowym)
Metoda PCR
Metody immunologiczne
Metody oparte na reakcji pomiędzy przeciwciałem a antygenem.
Testy aglutynacyjne (identyfikacja bakterii, pleśni), testy immunoenzymatyczne ( wykorzystują reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcji immunologicznej, cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub biotyną [peroksydaza chrzanowa, alkaliczna fosfataza]), testy immunofluorescencyjne (wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie)
Elisa – test bezpośredni
Elisa – test pośredni
Elisa – test podwójnego wiązania „kanapkowy”
Mikroorganizmy w biotechnologii
Źródła szczepów przemysłowych:
Środowisko naturalne
Środowisko przekształcone przez człowieka
Kolekcja szczepów
Inne źródła
Pozyskiwanie mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym:
- izolacja nowych mikroorganizmów o pożądanych cechach
- badanie nowych szczepów, nowe sposoby hodowli, bardziej czułe metody analityczne
Pozyskiwanie szczepów mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym
Wybór miejsca
Pobranie próby ze środowiska
Wstępna obróbka próbki
Izolacja
Testy selekcyjne
Testy fermentacyjne
Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu
Wybór miejsca
Środowisko – to wybrane przez nas na drodze racjonalnego wyboru źródło mikroorganizmów, z którego spodziewamy się wyizolować, z zastosowaniem klasycznych technik mikrobiologicznych mikroorganizmów o właściwościach, które stanowią o ich atrakcyjności biotechnologicznej
Przykłady:
Wydajna enzymatyczna hydroliza laktozy w mleku o temperaturze 10-15 stopni C
Miejsce pobrania próby – środowisko naturalne obfitujące w gatunki mikroorganizmów psychrofilnych i psychrotrofowych
Przetwórstwo skrobi – wytwarzanie syropów glukozowych
Środowisko naturalne obfitujące w gatunki mikroorganizmów termofilnych i hipertermofilnych
Nowe antybiotyki
Środowisko naturalne obfitujące w gatunki promieniowców
Bioremediacja gleby skażonej produktami ropopochodnymi
Środowisko obfitujące w gatunki mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji węglowodorów
Bioremediacja gleby skażonej pierwiastkami promieniotwórczymi
Środowisko obfitujące w gatunki mikroorganizmów odpornych na promieniowanie jonizujące
Pobranie próby ze środowiska
Kolekcja gatunków mikroorganizmów dominujących w populacji drobnoustrojów w danym środowisku nie stanowi problemu. Mikroorganizmy potencjalnie przydatne w procesach przemysłowych to tylko niewielki odsetek całej populacji
Sposoby zwiększania liczebności pozyskiwanych mikroorganizmów:
- oddziaływanie na środowisko przed pobraniem próby
- wprowadzenie do środowiska wabików – pułapek
- wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna próbki
- hodowla wzbogacająca.
Przykłady:
Izolacja bakterii propionowych – hodowle beztlenowe na glukozie, podłoże z mleczanem/C
Izolacja bakterii kwasu octowego – źródło węgla, 4% etanol (Acetobacter, Glukonobacter)
Izolacja promieniowców – novobiocyna, penicylina
Izolacja grzybów – Streptomycyna
Izolacja bakterii przetrwalnikujących – podwyższona temperatura
Techniki izolacyjne
Zastosowanie pożywek stałych – metodę tę stosuje się do izolowania producentów enzymów. Stosuje się odpowiednią pożywkę selekcyjną zawierającą substrat dla enzymu i obserwuje się stan podłoża wokół kolonii.
Izolacja poprzez przegląd szczepów – wykorzystuje się takie podłoża hodowlane, które zapewniają maksymalną ekspresję cech genetycznych. Przygotowuje się wiele pożywek o różnych czynnikach limitujących, a dla każdego limitowanego substratu stosuje się różne formy składników występujących w dostarczonych ilościach.