W
ydział
Biotechnologii i Nauk o Żywności
Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
Ilościowe metody określania działania bakteriobójczego i grzybobójczego chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w przemyśle
Monika Śniadowska
Nr albumu 190621
SPIS TREŚCI
1. Wstęp teoretyczny
Otrzymywanie produktów o jak najwyższej jakości zależy zarówno od surowców i technologii, ale także ustalonych warunków higienicznych w całym procesie wytwarzania. Zarówno proces mycia jak i dezynfekcji ma tu istotne znaczenie. Działanie to ma na celu usunięcie zanieczyszczeń oraz mikroorganizmów z przestrzeni produkcyjnej[1].
Czystość mikrobiologiczna powierzchni ma duży wpływ na bezpieczeństwo żywności. Na powierzchniach adsorbować mogą żywe komórki drobnoustrojów w różnym stanie wzrostu. Ich źródłem mogą być zarówno surowce, stosowane dodatki, jak również opakowania czy urządzenia produkcyjne. Wysoka aktywność biochemiczna drobnoustrojów prowadzi do ich niekontrolowanego rozwoju, a w konsekwencji niekorzystnych zmian cech organoleptycznych żywności, obniżenia ich trwałości lub całkowitego zepsucia.
Aby temu zapobiec niezwykle istotne jest poprawne przeprowadzenie procesu dezynfekcji urządzeń produkcyjnych, jak i przyborów pomocniczych wykorzystywanych w przetwórstwie.
Przez pojęcie dezynfekcji rozumie się etap kończący proces mycia. Polega on na redukcji mikroorganizmów w otoczeniu produkcyjnym. Efekt ten osiąga się stosując chemiczne środki dezynfekujące zwane dezynektantantami. Pod pojęciem tym rozumie się określoną grupę detergentów o specyficznym działaniu, które mają na celu zniszczenie, usunięcie lub zminimalizowanie liczebności mikroorganizmów do akceptowalnego poziomu, który nie będzie zagrażał bezpieczeństwu i trwałości produktów spożywczych. Dezynfekcję uznaje się za skuteczną, gdy liczebność komórek bakteryjnych zmniejszy się do 0,001-0,0001% w stosunku do liczebności początkowej(108/ml) po 5 minutach kontaktu ze środkiem bójczym - redukcja o co najmniej pięć cykli logarytmicznych. W przypadku grzybów strzępkowych, czy drożdży mówimy o redukcji o co najmniej cztery cykle logarytmiczne po 15 minutach działania, gdy wyjściowa liczba komórek wynosiła 107/ml[2].
W warunkach laboratoryjnych aktywność preparatów ocenia się stosując metody dyfuzyjne i zawiesinowe, które opracowane zostały przez Państwowy Zakład Higieny, do celów przemysłowych metodą rozcieńczania i neutralizowania zawartych w normach PN-EN 1276:2000 i PN-EN 1650:2000. Metody laboratoryjne umożliwiają określenie aktywności bójczej lub statycznej danego preparatu na podstawie wartości MBC (ang. minimal bactericidal concentration) -minimalnego stężenia bójczego oraz MIC (ang. minimal inhibitory concentration) - minimalnego stężenia hamującego wzrost drobnoustrojów. W przypadku metody rozcieńczania-neutralizowania, aktywność biobójcza oceniana jest na podstawie stopnia redukcji liczebności komórek wzorcowych szczepów grzybów i bakterii.
Istotnym problemem, z którym mamy do czynienia podczas procesu dezynfekcji jest oporność drobnoustrojów. Długotrwałe stosowanie tych samych preparatów dezynfekcyjnych może spowodować powstawanie szczepów opornych. W zależności od charakteru mechanizmów obronnych wyróżnia się kilka typów oporności: wrodzoną (naturalną), nabytą (fenotypową lub genotypową) oraz krzyżową. Mikroorganizmy mają różnorodną naturalną wrażliwość na chemiczne środki przeciwdrobnoustrojowe, jednak najłatwiej zniszczyć wirusy lipofilne i bakterie Gram(+). Najczęściej formy przetrwalne wytwarzają bakterie gramujemne (Pseudomonas, Achromobacter, Serratia, Flavobacterium), co przenosi się na wrażliwość przeciwko środkom dezynfekującym. Oporność na czynniki chemiczne polega na uruchomieniu przez komórkę mechanizmów odpowiedzialnych za obniżenie aktywności bójczej wykorzystywanych dezynfektantów czy antybiotyków.
Może być ona efektem:
zmniejszenia przepuszczalności błony komórkowej i zablokowania transportu związku do komórki,
syntezy enzymów inaktywujących, bądź hydrolizujących związek
zmiany szlaku metabolicznego,
usuwania związku przy użyciu aktywnych białek,
zmian zachodzących w białkach wiążących związek, podjednostkach rybosomu, w prekursorze mureiny,
zwiększenia stężenia metabolitu działającego antagonistycznie w stosunku do preparatu
zmniejszenia aktywności enzymów, które przeprowadzają związek w formę aktywną.
Ważna jest więc zmiana dezynfektanta, ale koniecznie na taki, który będzie miał inną substancję czynną.
Dobry preparat dezynfekcyjny powinien wykazywać:
wysoką stabilność w wodzie twardej,
działanie w małym stężeniu przez krótki okres w temperaturze otoczenia,
brak toksyczności,
bezpieczeństwo dla zdrowia,
brak zapachu,
obojętność wobec dezynfekowanych powierzchni[3].
W zakładach przemysłowych zmiana środka dezynfekującego powinna mieć miejsce raz na pół roku.
2. Materiały i metody
2.1 Materiały
Materiałem badawczym była zawiesina dwóch szczepów bakterii (Staphylococcus aureus i Escherichia coli) oraz zawiesina drożdży (Candida albicans). Materiał pochodził z Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Biotechnologii Politechniki Łódzkiej.
2.2 Stosowane pożywki
2.2.1 Podłoże TSA - wykorzystywane do oznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów .
W skład wchodzą:
P
źródło azotu
epton
K
P
epton
sojowy
NaCl, agar, woda destylowana do pH=7,3
2.2.2 Podłoże TSB - wykorzystywana do oznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów.
W jej skład wchodzą :
P
źródło azotu
epton
K
P
epton
sojowy
NaCl, agar, woda destylowana do pH=7,2
2.2.3 Podłoże MEB - wykorzystywane do oznaczania liczbę drożdży oraz pleśni.
W skład wchodzą:
Ekstrakt słodowy- drożdżowy jako źródło witamin i makroelementów
Pepton –źródło azotu
Agar, woda destylowana do pH=5,5
2.2.4 Podłoże MEA - wykorzystywane do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów.
W skład wchodzą:
Ekstrakt słodowy - drożdżowy jako źródło witamin i makroelementów
Pepton - źródło azotu
Agar, woda destylowana do pH=5,5
2.3 Metody badawcze
2.3.1 Wyznaczenie minimalnego stężenia środków dezynfekcyjnych hamujących wzrost bakterii metodą seryjnych rozcieńczeń wg PN-EN 1040:2006
Przygotowanie inokulum bakterii
Przygotowano
zawiesinę bakteryjnego szczepu testowego w tryptonowym roztworze
chlorku sodu, tak aby końcowa liczba komórek zawierała się w
przedziale 1,5-5
108
/ml.
W tym celu odwirowano 24-godzinną hodowlę bakterii przy obrotach
5000obr/min przez 5 minut, zlano supernatant, a biomasę bakteryjną
zawieszono w tryptonowym roztworze chlorku sodu , który wykorzystano
jako rozcieńczalnik.
Wyznaczenie minimalnego stężenia środków dezynfekcyjnych
Stężenie wyjściowe dezynfektanta(w naszym przypadku TAAB-2) wynosiło 5%. W celu wykonania 10-krotnego rozcieńczenia, do 2ml środka dodano 18 ml rozcieńczalnika. Użyte stężenie środka dezynfekującego wynosiło 0,5%. Do probówki zawierającej 1ml płynnego podłoża TSB dodano 1ml przygotowanego inokulum, którego dokładnie wymieszano oraz 1ml środka dezynfekującego TAAB-2. Z otrzymanego roztworu pobrano 1ml i przeniesiono ponownie do mieszaniny 1ml podłoża. Czynność powtarzano do momentu uzyskania rozcieńczenia 1:1024. Przed inokulacją, z ostatniej probówki usunięto 1ml, tak aby we wszystkich probówkach otrzymać objętość 2ml. Wykonano też próbę kontrolną zawierającą 1ml pożywki i 1ml inokulum, bez obecności środka dezynfekującego. Dodatkowo wykonano mieszaninę zawierającą 1ml pożywki i 1ml dezynfektanta. Otrzymane rozcieńczenia inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. W ten sposób sporządzono rozcieńczenia dla Escherichia coli oraz Stpahylococcus aureus.Po okresie inkubacji odczytano zmętnienie prób z zastosowaniem densytometru w stopniach McFarlanda [°McF].
2.3.2 Badanie bakteriobójczego działania preparatu dezynfekcyjnego metodą rozcieńczania-neutralizowania wg PN-EN 1276:2000
Skuteczne działanie bakteriobójcze preparatu dezynfekcyjnego określone jest jako zdolność do co najmniej 105-krotnej redukcji liczby komórek bakterii, które są zdolne do życia.
W celu zbadania czy dany środek spełnia ten warunek sporządzono odpowiednie roztwory w następujący sposób. Do probówki dodano objętość 1ml środka obciążającego w postaci sacharozy, która jest odpowiedzialna za stymulowanie warunków spotykanych w przemyśle. Następnie dodano 1ml zawiesiny testowej, a po 2 minutach i dokładnym wymieszaniu dodano 8 ml dezynfektanta, który został rozcieńczony do 0,5%. Końcowe, użyte w badaniu stężenie środka dezynfekującego wynosiło 0,4%. Probówki z wykonanymi mieszaninami dokładnie wymieszano, aby uzyskać jednorodne środowisko. Po 5 minutach pobrano 1 ml otrzymanego roztworu i dodano do 8ml neutralizatora. Dodano też 1ml wody ażeby uzyskać objętość 10 ml i zachować proporcję 2:8. Następnie wysiano po 1ml mieszaniny na dwie płytki Petriego i zalano pożywką TSA. Płytki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C.
2.3.3 Wyznaczenie minimalnego stężenia środków dezynfekcyjnych hamujących wzrost drożdży metodą seryjnych rozcieńczeń wg PN-EN 1275:2006
Przygotowanie inokulum drożdży
Pobrano jedną ezę ze skosu z hodowlą drożdży i przeniesiono do tryptonowego roztworu chlorku sodu. Aby oznaczyć liczbę drobnoustrojów w wykonanym inokulum, obliczono ilość komórek wykorzystując komorę Thoma.
Wyznaczenie minimalnego stężenia środków dezynfekcyjnych
Do probówki zawierającej 1ml płynnego podłoża MEB dodano 1ml przygotowanego inokulum drożdży, dokładnie wymieszano i dodano 1ml środka dezynfekującego TAAB-2. Z otrzymanego roztworu pobrano 1ml i przeniesiono ponownie do mieszaniny 1ml podłoża. Czynność powtarzano do momentu uzyskania rozcieńczenia 1:1024. Przed inokulacją z ostatniej probówki usunięto 1ml tak aby we wszystkich probówkach otrzymać objętość 2ml. Wykonano też próbę kontrolną zawierającą 1ml pożywki i 1ml inokulum, bez obecności środka dezynfekującego. Dodatkowo wykonano mieszaninę zawierającą 1ml pożywki i 1ml dezynfektanta. Otrzymane rozcieńczenia inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Rozcieńczenia w ten sposób wykonano dla Candida albicans. Po okresie inkubacji odczytano zmętnienie prób z zastosowaniem densytometru w stopniach McFarlanda [°McF].
2.3.4 Badanie grzybobójczego działania preparatu dezynfekcyjnego metodą rozcieńczania-neutralizowania wg PN-EN 1650:2000
Skuteczne działanie grzybobójcze preparatu dezynfekcyjnego określone jest jako zdolność do co najmniej 104-krotnej redukcji liczby komórek drożdży, które są zdolne do życia.
W celu zbadania czy ten środek spełnia dany warunek sporządzono roztwory w następujący sposób. Początkowe stężenie dezynfektanta wynosiło 5%. Przed zastosowaniem go w badaniu został rozcieńczony 10-krotnie. Dodany środek obciążający w postaci sacharozy imitował warunki jakie mogą występować w przemyśle. Do probówki dodano objętość 1ml środka obciążającego (sacharozy), który jest odpowiedzialny za stymulowanie warunków spotykanych w przemyśle imitując. Następnie dodano 1ml zawiesiny testowej, a po 2 minutach i dokładnym wymieszaniu dodano 8 ml dezynfektanta, który został rozcieńczony do 10-krotnie. Po każdym sporządzeniu roztworu próbkę dokładnie mieszano w celu uzyskania jednorodnego środowiska. Po 15 minutach pobrano 1 ml otrzymanego roztworu i dodano do 8ml neutralizatora. Dodano też 1ml wody ażeby uzyskać objętość 10 ml i zachować proporcję 2:8. Wydłużony czas oczekiwania w przypadku drożdży wynika z faktu, iż mogą być one bardziej oporne. Następnie wysiano po 1ml mieszaniny na dwie płytki Petriego i zalano pożywką MEA. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godziny. Po zakończeniu inkubacji wyznaczono liczbę jtk/ml w zawiesinie testowej bakterii i obliczono redukcję liczby zdolnych do życia grzybów.
3. Wyniki
Tabela 1. Wyniki zmętnienia w zależności od wykonanego rozcieńczenia.
|
|
Rozcieńczenie/°McF |
|||||||||
|
Drobnoustrój |
1:2 (2,5%) |
1:4 (1,25%) |
1:8 (0,625%) |
1:16 (0,313%) |
1:32 (0,156%) |
1:64 (0,078%) |
1:128 (0,039%) |
1:256 (0,019%) |
1:512
(9,7 10-3%) |
1:1024 (4,88 |
|
Staphylococcus aureus |
6,0 |
5,2 |
6,6 |
6,2 |
4,9 |
3,6 |
3,0 |
6,9 |
7,6 |
7,1 |
|
Candida albicans |
3,0 |
3,0 |
3,2 |
3,1 |
2,7 |
2,2 |
1,8 |
1,9 |
2,8 |
5,2 |
|
Escherichia coli |
6,2 |
8,4 |
7,5 |
5,8 |
5,1 |
8,1 |
8,6 |
8,9 |
8,9 |
|
Na podstawie wyników przedstawionych w tabeli wykonano wykres przedstawiający zmianę zmętnienia wynikającą z wykonanego rozcieńczenia.
Wykres 1. Wykres przedstawiający zależność zmętnienia od stężenia.
Zarówno z wykresu jak i z tabeli możemy odczytać, przy jakim stężeniu zmętnienie było najniższe, co oznacza najefektywniejsze działanie środka i zahamowanie wzrostu drobnoustrojów. Dla drożdży i Staphylococcus aureus jest to wartość 0,04 %. Dla Escherichia coli wartość stężenia środka przy którym wzrost był najmniejszy wyniosła 0,156%. Pomiar ten nie jest do końca wiarygodny, ponieważ pomiar zmętnienia może być zawyżone ze względu na pożywkę przy niższych stężeniach, a także ze względu na obecność drobnoustrojów przy stężeniach wyższych środka dezynfekującego.
Tabela 2. Liczba drobnoustrojów przed i po zastosowaniu środka dezynfekującego.
|
Nazwa drobnoustroju |
Liczba drobnoustrojów |
|
|
N [jtk/ml] |
Na [jtk/ml] |
|
|
Staphylococcus aureus |
6,4*107 |
nb |
|
Candida albicans |
5,4*106 |
nb |
|
Escherichia coli |
3,85*107 |
nb |
|
nb- nieobecne w badanej próbie N- liczba jtk/ml w testowanej zawiesinie (drożdże policzone z komory Thoma/ bakterie z wysiewów) Na- liczba jtk/ml po zastosowaniu dezynfektanta |
||
Stopnie redukcji
Uznaje się, że redukcja ilości bakterii wskaźnikowych zmierzona przed i po zastosowaniu środka dezynfekcyjnego jest miarą skuteczności dezynfekcyjnej tego środka. Liczbową miarę skuteczności dezynfekcyjnej przedstawiono w stopniach logarytmicznych. Skuteczność usuwania mikroorganizmów wynosząca 90%, odpowiada jednemu stopniowi logarytmicznemu.
Korzystając z wyników otrzymanych obliczono stopnie redukcji dla badanych szczepów.
Wyniósł on odpowienio:
dla Staphylococcus aureus - 7,80618,
dla Candida albicans - 6,732394,
dla Escherichia coli- 7,585461
4. Wnioski
Badane drobnoustroje charakteryzuje zróżnicowana wrażliwość na środki dezynfekcyjne.
Najbardziej wrażliwe okazały się : Candida albicans i Staphylococcus aureus.
Escherichia coli wykazuje zdecydowanie mniejszą wrażliwość na działanie środka dezynfekującego niż pozostałe szczepy testowe.
Bakterie Gram(-), których przykładem jest Escherichia coli charakteryzują się większą opornością, co może być spowodowane posiadaniem otoczki, która chroni przed działaniem środków dezynfekujących.
Zgodnie z normami PN-EN 1650:2000 oraz PN-EN 1276:2000 wynika, że preparat dezynfekcyjny TAAB-2 o stężeniu użytkowym 0,5% zahamował wzrost i spowodował redukcję liczby komórek Candida albicans w ciągu 15 minut, oraz Staphylococcus aureus i Escherichia coli w czasie 5 minut, czego efektem jest obserwowany brak wzrostu na płytkach po dezynfekcji.
Najmniejszym stężeniem środka dezynfekującego, które wykazało działanie hamujące wzrost było stężenie 0,04%.
5. Bibliografia
[1],[3] Libudzisz Z., Kowal K. Żakowska Z. (red): Mikrobiologia techniczna. t. II. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcja żywności. PWN, Warszawa, 2008
[2] Przepiórka-Stepuk J., Mierzejewska S., Przemysł spożywczy. Dezynfekcja i substancje aktywne. Mycie w systemie CIP. 2015, 69 (2), s.15-20
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
więcej podobnych podstron