Co to jest elektroforeza SDS –PAGE?
Jest to elektroforeza przebiegająca w warunkach denaturujących . Połączenie układu nieciągłej elektroforezy białek z SDS. SDS jest silnym detergentem anionowym, który niszczy struktury białkowe wyższego rzędu, denaturując białka do postaci liniowej (struktura pierwszorzędowa) oraz nadaje im wypadkowy ładunek ujemny. Przyjmuje się, że statystycznie jeden anion dodecylosiarczanowy przypada na dwie reszty aminokwasowe. Ponadto do rozdzielanych próbek dodaje się silne środki redukujące, takie jak 2-merkaptoetanol lub DTT, które redukują mostki disiarczkowe obecne w białkach. Można więc przyjąć, że tempo migracji białek podczas SDS-PAGE jest zależne tylko od ich masy i jest wprost proporcjonalne do jej logarytmu. Oczywiście są białka dla których występują odstępstwa od tej reguły i ich migracja ulega zaburzeniu. Zaliczają się do nich białka obdarzone wysokim ładunkiem natywnym (np. białka histonowe, migrujące wolniej niż wskazywałaby na to ich masa) oraz białka błonowe. Jednakże dla większości białek tempo migracji jest zależne tylko od masy.
Białka w odpowiednim buforze zawierającym SDS oraz czynniki redukujący 2- merkaptoetanol, po zagotowaniu 2-5 min, ulegają rozwinięciu i wiążą około 1,4 g SDS na 1 g białka. Stosowanie tego anionowego detergentu (0,1%) w pełni wysyca łańcuchy polipeptydowe w ilości : 1 ujemnie naładowana cząsteczka SDS na 2 reszty aminokwasowe, co nadaje rozdzielanym białkom ładunek ujemny. Kompleksy białko-SDS wędrują wtedy od katody do anody, przy czym ich ruchliwość zależy od masy cząsteczkowej białka.
Zel poliakrylamidowy ma szereg zalet: jest łatwy i szybki w przygotowaniu, obojętny chemiczny, bezbarwny, wytrzymały mechanicznie i termicznie oraz pozbawiony ładunków elektrycznych. Powstaje wskutek polimeryzacji akrylamidu i N,N’-bisakrylamidu, a wielkość sieci oczek zależy od proporcji między tymi substratami. Polimeryzacja rozpoczyna się po dodaniu nadsiarczanu amonu w obecności katalizatora, którym jest N,N,N’,N’-tetrametylo-etylenodiamina (TEMED) lub β-dimetyloaminopropionitryl (DMAP). W wyniku rozpadu nadsiarczanu amonu w obecności katalizatora powstają wolne rodniki tlenowe inicjujące powstawanie rodników akrylamidowych.
Żele zagęszczające i rozdzielające
Żel poliakrylamiodowy przygotowuje się (wylewa) dwustopniowo: jako pierwszy przygotowuje się żel rozdzielający o procentowości zależnej od wielkości rozdzielanych cząsteczek. W żelu rozdzielającym zachodzi właściwy rozdział białek.
Na wylany żel rozdzielający nanosi się izobutanol (w celu usunięcia ewentualnych pęcherzyków powietrza ). Dodatkowo izobutanol zapobiega dostępowi powietrza, który utrudnia proces polimeryzacji żelu (polimeryzacja trwa od 30 do 120 minut). Po upływie czasu polimeryzacji, należy wypłukać izobutanol z góry żelu , po czym delikatnie osuszyć go bibułą, nie dopuszczając tym samym do przesuszenia górnej warstwy żelu. Następnie, wylewa się żel górny ( 4% ), który jest tzw. żelem zagęszczającym ( w tym żelu umieszcza się grzebień w celu powstania tzw. studzienek)
W skłąd buforu do elektroforezy wchodzi Tris-glicyna o pH=8.3, żel rozdzielający zawiera Tris-HCl ( o pH=8.8), zaś żel zatężający Tris-HCl o niższym pH= 6.8 . Wyższe pH w żelu rozdzielającym powoduje jonizację glicyny, w związku z czym podczas rozdziału migruje ona tuż za jonami chlorkowymi .
Rozdzielający- w tym celu do zlewki wprowadzić kolejno: 20,4 ml wody destylowanej, 15 ml buforu 1,5 M Tris-HCl z 0,4% SDS o pH 8,8, 24 ml
30% akrylamid/bisakrylamidu, 0,6 ml 10% SDS, 60 μl TEMED, 0,3 ml 10% APS.
Uwaga! Wprowadzenie APS uruchamia proces polimeryzacji. Tak przygotowana
mieszaninę ostrożnie, aby uniknąć pojawienia się bąbelków powietrza, wlać pomiędzy
szyby. Na powierzchnię żelu nawarstwić alkohol izopropylowy i pozostawić do
całkowitej polimeryzacji (około 45 minut).
· Pod koniec polimeryzacji przygotować 7% żel zagęszczający o składzie: 12,44 ml
wody destylowanej, 2,51 ml buforu 0,5 M Tris-HCl z 0,4% SDS o pH 6,8, 4,81 ml
30% akrylamid/bisakrylamidu, 200 μl 10% SDS, 25 μl TEMED, 100 μl 10% APS. Na
osuszoną po zlaniu alkoholu izopropylowego powierzchnię żelu rozdzielającego wlać
przygotowany roztwór żelu zagęszczającego. Po wylaniu żelu zagęszczającego
umieścić w nim grzebień i pozostawić na około 30 minut do pełnej polimeryzacji.
W trakcie polimeryzacji przygotować próby białkowe. W tym celu pobrać 100 ml
buforu S (o składzie: 62,5 mM buforu Tris-HCl o pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5%
2-merkaptoetanol, 0,05% błękitu bromofenylowego) i odpowiednią ilość badanej
próbki (o stężeniu białka 1-2 mg/ml) lub prób zawierających markery masy
molekularnej o znanej wielkości. Mieszaninę inkubować w temperaturze 96°C przez
10 minut, w celu usunięcia wiązań siarczkowych ze struktury białka. Po inkubacji
próbki dobrze wymieszać.
· Umocować spolimeryzowane żele w aparacie do elektroforezy, delikatnie wyciągnąć
grzebienie spomiędzy płytek, a następnie zalać kieszonki buforem elektrodowym o pH
8,3 (o składzie: 0,025 M Tris-HCl, 0,192 M glicyny, 0,1% SDS) oraz napełnić tym
buforem komory aparatu.
· Nałożyć próbki i standardy do wcześniej zalanych buforem elektrodowym kieszonek.
Komorę podłączyć do zasilacza i prowadzić rozdział elektroforetyczny w
temperaturze 4°C przy napięciu 60 V dopóki próba znajduje się w żelu
zagęszczającym, a następnie przy napięciu 120 do momentu, gdy marker migracji
białek osiągnie odległość 1 cm od końca żelu rozdzielającego. Po zakończeniu
elektroforezy rozmontować zestaw i pozostawić żel do wybarwienia.
Aparat do elektroforezy SDS- PAGE
Elektroforezę białek prowadzi się w aparatach do elektroforezy. Są wyposażone w 2 naczynia elektroforetyczne ( górne i dolne ) zaopatrzone w elektrody platynowe. W zależności od systemu elektroforetycznego mają uchwyty podtrzymujące płytkę bądź rurki w których formuje się żel.
Ogniskowanie izoelektryczne
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym umożliwia frakcjonowanie białek zależnie od ich punktów izoelektrycznych (Punkt izoelektryczny (pI) jest to pH środowiska (odczyn) w którym cząsteczka aminokwasu staje się obojętna i traci zdolność poruszania się w polu elektrycznym (podczas elektroforezy). Inaczej mówiąc Takie pH, przy którym aminokwas nie jest obdarzony ładunkiem elektrycznym nazywa się jego punktem izoelektrycznym. W punkcie izoelektrycznym aminokwas jest w jednakowy sposób zdysocjowany jako kwas i jako zasada) opisuje się jako ogniskowanie izoelektryczne ( IF). Ten wariant metody wykorzystuje rozdział żelu poliakrylamidowym, w którym utworzono gradient pH między katodą i anodą, wywołany elektrolizą amfoterycznych, syntetycznych związków buforowych – amfolitów. Jeśli wprowadzi się do żelu poliakrylamidowego z amfolitami substancje o charakterze amfoterycznym np. polipeptydy, to podczas elektroforezy wędrują one do miejsc w żelu o wartości pH odpowiadającej pI, czyli stref, w których ładunek sumaryczny cząsteczek wynosi 0. Ta elektroforeza przebiega zwykle w obecności dużych stężeń mocznika i detergentów niejonowych, które umożliwiają analizę białek prawie nierozpuszczalnych w roztworach fizjologicznych ( białka cytoszkieletu, wirusów) .
Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym (zawierającym SDS) [1].
Przygotowanie żelu:
Odczynniki:
- mieszanina monomerów: akrylamid – bisakryloamid (37,5 / 1) 30%
- 10% SDS
- 10% nadsiarczan amonu (APS)
- TEMED
- 1.5 M Tris o pH= 8.0
- 1M tris o pH= 6.8
- 5x stężony bufor do elektroforezy
Na początku należy przygotować odpowiednią ilość roztworu żelu rozdzielającego ( o odpowiedniej procentowości). Przygotowany roztwór należy wlać pomiędzy dwie szklane płytki przedzielone przekładkami i połączone klamerkami, pozostawiając odpowiednią ilość miejsca, w celu późniejszego wylania żelu zatężającego, oraz włożenia grzebienia (studzienki w żelu) [1].
Po wylaniu, roztwór żelu trzeba bardzo ostrożnie zalać wodą lub alkoholem izoamylowym, i tak przygotowany żel pozostawić do polimeryzacji (na ok. 30 minut). PO upływie czasu polimeryzacji, zlać roztwór znad żelu, po czym żel przepłukać wodą (w celu usunięcia resztek nie spolimeryzowanego akryloamidu). Kolejnym krokiem jest przygotowanie roztworu żelu zatężającego. Roztwór ten należy bezpośrednio wylać na żel rozdzielający, a następnie (delikatnie) wsunąć grzebień- uważając by nie powstały pęcherzyki powietrza, które przeaszkadzają podczas rozdziału elektroforetycznego[1].
Ponownie pozostawić żel do polimeryzacji (ok. 30 minut). Gdy żel spolimeryzuje delikatnie usunąć grzebień i przepłukać kieszonki wodą dejonizowaną, żeby usunąć resztki niespolimeryzowanego akryloamidu (jak wyżej).
Tak przygotowany żel poliakryloamidowymieścić umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 5x stężonym buforem do elektroforezy (tj.: 125mM Tris, 1.25M glicyna (pH 8.3), 0.5% SDS) [1].
Przygotowanie próbek do rozdziału elektroforetycznego:
Badane próbki należy zawiesić w buforze Leammeliego (tj.: 0.065M Tris-HCl, 2% SDS, 5% b -merkaptoetanol (pH 6.8), 0.01 % błękit bromofenolowy, 5% glicerol). Następnie, inkubować je przez 3 minuty w 100C w celu denaturacji białek. Po denaturacji próbki można nakładać na żel [1].
Warunki rozdziału elektroforetycznego:
Elektroforezę najlepiej prowadzić przy napięciu ok. 15 V na centymetr długości żelu (do momentu, kiedy barwnik dojdzie do dolnej krawędzi żelu) [1].