MIKROBIOLOGIA 14.05.2014 IDENTYFIKACJA SEROLOGICZNA, IZOLO-WANIE WIRUSA

Odczyny enzymatyczne: stwierdzanie obecności wirusa (tylko otoczkowe, za-wierające hemaglutyninę)

Hemaglutynacja i hemadsorbcja – odczyny, służące wyłącznie do stwierdzenia obecności wirusa w materiale, nie do identyfikacji.

Hemaglutynacja HA:

• Odczyn zachodzący szybko w RT, w obecności np. wirusa grypy, ospy, rze-komego pomoru drobiu

• Na szkiełku podstawnym widoczne gołym okiem zlepy erytrocytów

• Możliwe zjawisko elucji – neuraminidaza – wynik jej działania, trawi recep-tory na powierzchni erytrocytów

• HA szkiełkowa – jakościowa – stwierdzenie obecności

• HA ilościowa – w celu wyznaczenia ilości hemaglutynin u danego wirusa

Hemadsorbcja HAS – zdolność komórek zakażonych wirusami otoczkowymi do adsorbowania na swojej powierzchni erytrocytów. Hodowla komórkowa za-każona wirusem, po kilku dniach dodaje się erytrocyty.

Identyfikacja serologiczna – stosowane odczyny:

• Hamowanie hemaglutynacji HI

  • przeciwciała łącząc się z wirusem, blokują hemaglutyniny na jego o-toczce – brak/hamowanie hemaglutynacji

  • 1. Wirus badany + surowica -> inkubacja

  • 2. Erytrocyty

  • Szkiełkowy – jakościowy

  • Ilościowy – miano surowicy w badaniu serologicznym

• Hamowanie hemadsorbcji

  • przeciwciała hamują właściwości wirusa

  • przeciwciała łączą się z powierzchnią zakażonych komórek, blokując hemadsorpcję

• Odczyn seroneutralizacji SN

  • przeciwciała hamują właściwości wirusa

  • zobojętnianie właściwości przez swoiste przeciwciała

  • 1. In vitro – zobojętnienie przez przeciwciała

  • 2. In vivo – z użyciem podłuż biologicznych

  • Ważne zobojętnienie wszystkich cząstek wirusa przez przeciwciała – odczyn ilościowy – wzrastające rozcieńczenia jednego z badanych składników

• Test ochronny PT

  • przeciwciała hamują właściwości wirusa

  • brak reakcji na zakażenie badanym wirusem zwierzęcia swoiście u-odpornionego

  • zobojętnienie zachodzi in vivo – odczyn jednoetapowy

  • uodparnianie przez szczepienia lub surowicę

  • podobny test służący do oceny odporności poszczepiennej np. stada to challenge test

• OWD

  • wykrywanie kompleksu antygen-przeciwciało

  • wykorzystuje zdolność dopełniacza do lizy kompleksów immu-nologicznych

  • 1. Badany materiał – wirus

  • 2. Surowica diagnostyczna – przeciwciało

  • 3. Dopełniacz

  • 4. Amboceptor hemolityczny – przeciwciała dla erytrocytów barana

  • 5. Erytrocyty barana

  • 1-3 układ wirolityczny, 3-5 hemolityczny – wskaźnikowy

  • Wynik dodatni – wiroliza, brak hemolizy

• Odczyn precypitacji – immunodyfucji

  • wykrywanie kompleksu antygen-przeciwciało

  • immunodyfuzja w żelu, na płytce Petriego, wycinamy baseniki w jednym wirus, w drugim przeciwciała, w miejscu optymalnych stężeń - wybarwienie

• Odczyn hemaglutynacji pośredniej – biernej

  • wykrywanie kompleksu antygen-przeciwciało

  • stosowany do identyfikacji wirusów niehemaglutynujących

  • opłaszczenie przeciwciał na nośniku

  • wirus badany + przeciwciała zaadsorbowane na erytrocytach

  • wynik dodatni - hemaglutynacja

• Immunobloty

  • wykrywanie kompleksu antygen-przeciwciało

• Odczyny z zastosowaniem koniugatów

  • wykrywanie kompleksu antygen-przeciwciało

  • odczyn immunofluorescencji IF pośredniej lub bezpośredniej

  • ELISA – do identyfikacji wirusa – test typu Sandwich – płytka z za-adsorbowanymi przeciwciałami swoistymi dla wirusa, dodajemy wirus – powstają kompleksy antygen-przeciwciało, po wypłukaniu dodajemy przeciwciała dla wirusa oznakowane enzymem, na koniec substrat dla enzymu i następuje zmiana koloru, między każdą czyn-nością trzeba wielokrotnie płukać płytkę, można zmierzyć absor-bancję w spektrofotometrze – test ilościowy

CEL BADAŃ SEROLOGICZNYCH:

• Przeglądy stad – próby terenowe – jakościowe, dla dokładniejszej diagnos-tyki – badania laboratoryjne, ilościowe – miano surowicy, przy groźnych chorobach – chore sztuki są wysyłane na ubój, a przy bardzo groźnych – całe stada

• Pozyskanie danych epizootycznych lub epidemiologicznych

• Określanie poziomu odporności poszczepiennej

W celu określenia aktualnie toczącego się procesu chorobowego:

• Badanie par surowic – dwie próby, jedna po wystąpieniu objawów, druga 2-3 tygodnie później, jeśli w drugiej jest 2-4 razy więcej – bieżąca choroba

• Określanie klasy immunoglobulin

  • Pierwsze powstają IgM

  • Rozdział w żelu agarozowym – elektroforeza, IgM są duże i ciężkie

  • Odczyn immunofruorescencji: zakażone antygenem diagnostycz-nym hodowle pokrywa się badaną surowicą, po płukaniu nawar-stwia się surowicę antyglobulinową dla IgM znakowaną fluoro-chromem, płucze i ogląda pod UV

  • Testy ELISA dla IgM

  • Próba z 2-merkaptoetanolem – niszczy tylko IgM

    • Badana surowica + 2ME – 30 min, 37oC

    • Kontrola – badana surowica bez 2ME

    • W obu oznaczamy miana przeciwciał

    • Jeśli w próbie z 2ME miano 4x niższe – wynik dodatni

MIANO W SUROWICY W ODCZYNIE HI

• Płytka mikrotestowa z dołkami „U”

• Wzrastające rozcieńczenia badanej surowicy – 2krotnie

• Do każdej celki taka sama ilość antygenu diagnostycznego

• Następnie taka sama ilość erytrocytów, inkubacja 30 minut

• Kontrola – surowica, płyn, erytrocyty

• Niezlepione erytrocyty opadają na dno dołka, zahamowanie hemaglu-tynacji, przy aglutynacji – rozlewają się po całym dnie

• Również może wystąpić zjawisko elucji

TEST ELISA TYPU POŚREDNIEGO:

• Płytka z antygenem diagnostycznym – wirusem, dodajemy przeciwciała pa-cjenta, potem przeciwciała dla przeciwciał znakowane enzymem i substrat dla enzymu

Przy badaniu odporności przeciwwirusowej oznaczamy też odporność typu ko-mórkowego, limfocyty T i komórki NK, przeciwciała działają tylko na wirusy znajdujące się poza komórkami.

• Test hamowania migracji

• Test transformacji blastycznej