Data wykonania ćwiczenia: 2.11.2009

Sekcja 10 Aleksandra Gatlik, Jan Idzik

Grupa Aut2

Sprawozdanie

Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym denaturującym.

Wstep teoretyczny.

Elektroforeza SDS-PAGE (Poliacrylamide Gel Electrophoresis) w warunkach denaturujących jest powszechnie wykorzystywaną techniką w laboratorium, umożliwiającą analizę białek. Cząsteczka białka obdarzona ładunkiem zdolna jest do poruszania się w polu elektrycznym. SADS-PAGE umożliwia rozdział białek w żelu poliakrylamidowym ze względu na ich masę cząsteczkową. Aby było to jednak możliwe białka naniesione na żel muszą być wpierw zdenaturowane pod wpływem czynnikow redukujących, wysokiej temperatury oraz silnie ujemnego detergentu SDS (siarczan dodecylu) nadającego białkom ujemny ładunek. Takie białka nie posiadają już struktur wyższego rzędu (II, III, IV), lecz liniową strukturę I-rzędową, w ktorej aminokwasy połączone są jedynie wiązaniami peptydowymi.

Mieszanina akrylamidu pod wpływem APS (nadsiarczan amonu)i katalizatora TEMED tworzą stała sieć tuneli, w ktorych wędrują białka o rożnej masie cząsteczkowej. W zależności od ich wielkości migrują one z rożna szybkością w polu elektrycznym. Małe białka wędrują do anody

szybciej niż białka o wyższej masie cząsteczkowej.

Odczynniki użyte w ćwiczeniu:

• Preparaty z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych izolowane na ćwiczeniu 1

• Preparaty z izolacji białek wiążących DNA (wszystkie frakcje) z ćwiczenia 2

• Żel rozdzielający 12%

H2O	2.12 ml
1M Tris:HCl pH 8.8	2.63 ml
40% akrylamid	2.1 ml
20% SDS	35 l
10% APS	70 l
razem:	7 ml

• Żel zagęszczający

H2O	1.47 ml
1M Tris:HCl pH 6.8	250 μl
40% akrylamid	254 μl
20% SDS	10 μl
10% APS	20 μl
razem:	2 ml
dodać TEMED	2 μl

• Bufor obciążający 6x stężony:
  60% glicerol; 300 mM Tris:HCl pH 6.8; 12 mM EDTA; 12% SDS; 864 mM 2-merkaptoetanol; 0.05% błękit bromofenolowy

• Bufor do elektroforezy:
  192 mM glicyna; 0.1% SDS; 25 mM Tris:HCl pH 8.3

• Markery białkowe „prestained”(Fermentas)

• Barwnik do żelu:

0,25 g Coomassie Blue R; 45 ml H₂O; 45 ml metanolu; 10 ml kwasu octowego 99.9%

• Odbarwiacz do żelu:

750 ml H₂O; 150 ml metanolu; 100 ml kwasu octowego 99.9%

Wykonanie ćwiczenia:

1. Wylewanie żelu

• Złożożono szyby – jedną zawierająca odstępniki, drugą gładką – spięto klipsami
  i zamocowano na podstawce. Włożono grzebień i zaznaczono pisakiem granicę żelu rozdzielającego na 0.5 cm od dolnej granicy grzebienia.

• Przygotowano wg. instrukcji 7 ml 12% żelu żelu poliakrylamidowego bez dodatku TEMED. Przeniesiono do osobnej probówki 1 ml roztworu, dodano 2 μl TEMED, wylano przy pomocy pipety automatycznej (1000 μl) pomiędzy szyby i odczekno , aż spolimeryzuje.

• Do pozostałej mieszaniny dodano 4 μl TEMED, od razu wylano pomiędzy szyby
  do zaznaczonego poziomu. Na powierzchnię niespolimeryzowanego żelu naniesiono bardzo ostrożnie 1 ml H₂O. Pozostawiono do spolimeryzowania.

• Przygotowano 2 ml żelu zagęszczającego wg. instrukcji, bez dodatku TEMED. Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, wylano wodę i wysuszono szyby bibułą. Do przygotowanego żelu dodano 2 μl TEMED, od razu wylano pomiędzy szyby do utworzenia menisku wypukłego, włożyono delikatnie grzebień tak, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pozostawiono do spolimeryzowania.

2. Przygotowanie preparatów (w czasie oczekiwaniu na spolimeryzowanie żelu).

• Podpisano probówki numerami 1-7. Z preparatów EC (ekstrakt cytoplazmatyczny) i EJ (ekstrakt jądrowy) pobrano po 20 μg białka:

Obliczenia:

Wyniki z pierwszego ćwiczenia:

Stężenie białka w:

EC = 5,26 [g/l]

EJ = 3,14[g/l]

Obliczono objętość pobrania do sporządzenia próby do elektroforezy:

Dla EC:

Dla EJ:

Wiadomo, że w próbce z ekstraktem jądrowym jest 0,4 M NaCl, żeby doprowadzić, aby stężenie w próbce wynosiło 0,2 M NaCl dajemy do probówki taką samą ilość wody, i dopełniamy do reszty 0,2M NaCl, żeby końcowa objętość wynosiła 15 l.

6,26+6,26= 12,72l 15-12,72=2,28 l 0,2 M NaCl

Metodą prób I błędów obliczono że trzeba dodać 1 l 1M NaCl do ekstraktu cytoplazmatycznego i dopełnić 0,2 M NaCl, żeby końcowa objętość wynosiła 15 l.

3,8 +1= 4,8 l 15-4,8= 10,2 l 0,2 M NaCl

• Pobrano 15 l preparatu EC-NZ o stężeniu 0,19116 µg/µl (do probówki nr 4 od sekcji Katarzyny Jonak i Aldony Jarosz) . Ze wszystkich frakcji pobrano po 20 μl preparatów kolejno do probówek: 5 (F1), 6 (F2) i 7 (F6).

Dla EC – NZ:

- dla białek niespecyficznie związanych z DNA-celulozą (EJ-F1): 0.05 μg/μl 

- dla białek specyficznie związanych z DNA-celulozą (EJ-F2): 0.047 μg/μl

Gdzie:

EJ-NZ – ekstrakt jądrowy niezwiązany z DNA celulozy

F1- białka niespecyficznie związane z DNA-celulozą

F2- białka niespecyficznie związane z DNA-celulozą

F6-

• Do preparatów 1, 2 i 4 dodano po 3 μl LB 6x, do preparatów 5-7 dodano po 4 μl buforu LB 6x.

• Wszystkie próby (1-7) gotowano 3 min. w termobloku (99⁰C), zwirowano [krótko (przycisk „short”)] na maksymalnych obrotach, przeniesiono do nowych probówek, podpisanych tak samo: 1-7.

3. Elektroforeza preparatów białkowych

• Przygotowanie buforu do elektroforezy:
  Do cylindra o pojemności 1000 ml wlano 200 ml buforu do elektroforezy stężonego 5x
  i dopełnić do 1000 ml.

• Złożono żele (po 4 żele do jednego aparatu) wg. Instrukcji.

• Nanoszenie preparatów:

Do pierwszej ścieżki naniesiono marker masy (5 μl). Do następnych ścieżek nanosiono kolejno preparaty: 1-7 (w całości). Elektroforezę prowadzono pod napięciem 100 V przez 15 min., następnie zwiększono napięcie do 200 V (maksymalne natężenie prądu nie mogło przekraczać 300 mA). Czas trwania elektroforezy – do przejścia barwnika do końca żelu (40-50 min.).

Wybarwianie żelu

• Po skończonej elektroforezie, aparat rozłożono, wyjęto szyby i rozdzielono je, posługując się łopatką.

• Łopatką odcięto żel zagęszczający i korek, żel ostrożnie przeniesiono do przygotowanego pudełeczka i zalano barwnikiem (barwnik zawierał metanol, dlatego należało pracować
  pod wyciągiem).

• Żel postawiono na kołysce i barwiono 30 min.

• Ostrożnie zlano barwnik do butelki, a żel zalano odbarwiaczem (również pod wyciągiem).

• Pozostawiono na kołysce do odbarwienia tła.

• Przez dwa kolejne dni po jednej osoby z grupy przychodzili do pracowni. Zużyty odbarwiacz należało zlać do butelki z węglem aktywnym (regeneracja), na żele należło nalać nową porcję odbarwiacza.

Wyniki

Zgodnie z instrukcją włożono do kieszonek:

1. Ekstrakt cytoplazmatyczny

2. Ekstrakt jądrowy

3. Ta kieszonka pozostała pusta

4. Ekstrakt cytoplazmatyczny niezwiązany

5. F1

6. F2

7. F6

8. Marker

Po wykonaniu elektroforezy uwidoczniły się 4 ścieżki białek ( od lewej):

1. ekstrakt cytoplazmatyczny

2. ekstrakt jądrowy

3. ekstrakt cytoplazmatyczny niezwiązany

8. marker

Niestety na załączonym zdjęciu nie widać ścieżki 1 i 3.

Można wywnioskować, że było wystarczająco dużo białka podanego elektroforezie, stąd ujawnienie się ścieżek, lecz za dużo żeby móc sklasyfikować jakie białka są w danych ścieżkach (1,2) z tego powodu ścieżku były rozmyte, nie uwidoczniły się prążki. Otrzymany po elektroforezie obraz żelu wskazuje, że rozdział protein niezwiązanych z chromatyną nie powiódł się - brak widocznych ścieżek oraz prążków na ścieżkach(4,5,6,7). Za brak prążków prawdopodobnie odpowiada za mała ilość białka podana elektroforezie ponieważ: dla EC-NZ wynosiła 0,02 μg, dla F1 0.01 μg , dla F2 0,0094 μg, lub błąd, który mógł wystąpić w trakcie przygotowywania preparatów do elektroforezy. Możliwe również, że po odwirowaniu nasącz został niedokładnie zebrany co miało wpływ na zmniejszenie stężenia białka. Białka mogły też ulec całkowitej degradacji protetycznej poprzez niedotrzymanie odpowiedniej temperatury co spowodowałoby szybką wędrówkę prążków w żelu.