Detekcja za pomocą radioizotopów.

Polega ona na zastępowaniu atomów, pierwiastkami promieniotwórczymi, np. fosfor można zastapić fosforem32, wodór można zastapić trytem, siarkę zastąpić siarką 35.Promieniotwórcze atomy emitują promieniowanie. Żel kładzie się na kliszy,klisza ulega napromieniowaniu.

Obraz utajony, wywoływuje się za pomocą tiosiarczanu sodu. W kliszy znajdują się jony srebra, które ulegają redukcji i uwidaczniają miejsca, gdzie doszło do napromieniowania.

Dodawanie radioaktywnego izotopu ma miejsce przed rozdziałem elektroforetycznym.

Białka i DNA są syntetyzowane chemicznie.

I sposobem jest wykorzystanie PCR do wyznakowania danego fragmentu

II sposobem jest użycie kinaz, które przenoszą grupy fosforanowe.

Zalety : Znakowanie radioizotopami posiada wysoką czułość.

Wady: Niestety to znakowanie jest dość drogie, oraz jest zagrożeniem dla zdrowia operatora, ponieważ pracuje się z substancjami promieniotwórczymi.

Znakowanie radioizotopowe jest zastępowane coraz częściej przez znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi.

Barwniki fluorescencyjne.

Do pomiarów fluorescencyjnych DNA wykorzystuje się zdolność barwników do interkalowania dwuniciowej struktury kwasów nukleinowych.

Jednym z najczęściej wykorzystywanych barwników jest bromek etydyny. Bromek etydyny właśnie interkaluję w dwuniciową strukturę kawasów nukleinowych. Maksymalną fluorescencję bromek etydyny wykazuje przy długości fali 302nm.

Według, innych źródeł wykazno, że kompleks bromku etydyny-DNA wykazuje maksymalną fluorescencję przy długości 595nm.

Bromek etydyny wykazuje większe powinowactwo do dwuniciowych cząsteczek kwasów nukleinowych, niż do jednoniciowych, co może spowodować, że barwienie jednoniciowych cząsteczek kwasów nukleinowych może być nieskuteczne, w niektórych sytuacjach.

Należy pamiętać, że bromek etydyny jest substancją mutagenną i należy zachować wszelkie środki ostrożności w pracy z nim.

Podczas replikacji, w miejscu połączenia bromku z DNA, dochodzi do wstawienia dodatkowego nukleotydu, co wiąże się z przesunięciem ramki odczytu i powstaniem mutacji w danym miejscu.

Bromek etydyny dodany do żelu, może hamować migrację cząsteczek w żelu agarozowym a dodany do żelu poliakrylamidowego, hamuje jego polimeryzację.

Czułość bromku etydny sięga 10ng DNA. Do znakowania bromkiem etydyny jest potrzebny wyspecjalizowany sprzęt, np. transluminator.

Innym barwnikiem jest, także oranż akrydyny.

SYPRO RUBY

Jest barwnikiem, który znakuje białka w żelu poliakrylamidowym. Wykazuje porównywalną czułość do znakowania srebrem i większą niż Coomassie Brilant Blue.

Stosuje się go do oceny ilościowej białek. Wykorzystuje się go w Western Blocie, znakowaniu izoelektrycznym, oraz elektroforezie dwukierunkowej.

Wady : barwienie trwa ok. godziny, barwnik jest dość drogi.

Zalety: nie wykazano toksyczności i właściwości mutagennych tego barwnika.

Lightning Fast

Barwnik fluorescencyjny, który także pozwala na znakowanie białka. Barwnik łączy się niekonwalencyjnie z białkami i cząsteczkami SDS . Barwnik jest pozyskiwany z grzyba Epicoccum nigrum.

Zalety: zakowanie tą metodą pozwala wykryć nawet 100 pg białka. Jest to czulsza metoda, niż barwienie srebrem.

Wady : znaczny koszt tego barwnika