SPRAWOZDANIE

Temat: Zapoznanie się z metodą określania aktywności aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy. Sporządzenie nasyconego roztworu siarczanu amonu.

Cel doświadczenia:

1. Wyznaczanie stężenia aldolazy.

Oznaczanie aktywności enzymatycznej aldolazy testem hydrazynowym.

2. Sporządzenie nasyconego roztworu siarczanu amonu.

Przebieg doświadczenia:

I.

1. Wyznaczono stężenie aldolazy w próbce przez pomiar absorbancji A przy długości fali 280 nm. Skorzystano z prawa Lamberta – Beera:

A = ε ∙ l ∙ C

gdzie:

• A - absorbancja

• ε - współczynnik ekstynkcji

• l - długość drogi optycznej [cm]

• C - stężenie substancji absorbującej

W tym celu do dwóch kuwet odmierzono po 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) o pH 7.2 i wykonano zerowanie urządzenia względem samego buforu. Następnie do drugiej kuwety dodano 40 μl stężonego roztworu aldolazy. Roztwór enzymu wymieszano przy użyciu parafilmu i zmierzono spektrofotometrycznie stężenie białka w próbce

2. Wyznaczono aktywność enzymatyczną aldolazy testem hydrazynowym. W tym celu do dwóch czystych kuwet odmierzono po 1.5 ml 2.6 mM siarczanu hydrazyny zawartym w buforze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) o pH 7.5. Dodano do obu kuwet po 200 μl 30 mM fruktozodifosforanu (FDP). Włożono obie kuwety do spektrofotometru ustawionego na długość fali 240 nm i wykonano zerowanie aparatu względem przygotowanego odnośnika. Następnie dodano aldolazy (16,5 μl, a w drugiej serii pomiarów 25 μl) do kuwety „próbka”, a do kuwety „odnośnik” odpowiednio taką samą objętość buforu. Kuwety zamknięto przy użyciu parafilmu i dobrze wymieszano roztwory. Natychmiast wykonano pomiar absorbancji mieszaniny reakcyjnej przy długości fali 240 nm.

II.

Sporządzono nasycony roztwór siarczanu amonu. W tym celu odważono na wadze analitycznej 90 g siarczanu amonu i wsypano do kolby. Dodano 100 ml 1 mM EDTA. Całość umieszczono na palniku gazowym i mieszano bagietką do całkowitego rozpuszczenia soli. Po lekkim ostygnięciu roztworu mieszaninę miareczkowano ( pod wyciągiem) 5 % roztworem amoniaku do uzyskania pH 7,5. Jeżeli w trakcie miareczkowania wytrącały się kryształki soli rozpuszczano je przez ponowne podgrzewanie na palniku gazowym. Następnie roztwór przesączono przez lejek Büchnera, używając pompki wodnej. Przesączony roztwór pozostawiono do następnych ćwiczeń w temperaturze 5^oC.

Opracowanie wyników:

1. a) Wyznaczono stężenie aldolazy w próbce przez pomiar absorbancji:

Abs _aldolazy = 0,2756

ε = 0,91

l = 1 cm

b) Wyznaczono aktywność enzymatyczną aldolazy testem hydrazynowym:

• Wyznaczono początkowe stężenie aldolazy C₁.

• Wyznaczono objętości aldolazy dodanej podczas wykonania testu hydrazynowego:

1)

2)

• Wyznaczono rzeczywistą masę dodanej aldolazy :

• Wyznaczono stężenia aldolazy w próbce do testu hydrazynowego :

• Wyznaczono aktywności aldolazową, totalną i specyficzną w kuwecie i preparacie wyjściowym:

Pierwszy pomiar (wykres heloł):

Drugi pomiar (wykres drugi pomiar):

Opis wzorów:

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

Tabela 1.

Lp.		A280
1	40	0,2756	0,3029	16,5	0,03712	0,00291	3
2				25	0,05607	0,00435	3

Lp.
1	0,0136	0,0234	4,674
2	0,0205	0,0354	4,669

Tabela 2.

Lp.
1	23,02	107,494	107,494	4,67
2		107,502	107,502	4,67

Wnioski:

1. Cel ćwiczenia zrealizowano, gdyż wyznaczono aktywności aldolazową, totalną oraz specyficzną. Zgodnie z oczekiwaniem aktywności specyficzne były sobie równe dla różnych objętości aldolazy, co oznacza, że aktywność specyficzna nie zależy od objętości i stężenia enzymu. Sporządzono wykres zależności absorbancji od czasu. Zauważono liniowy wzrost absorbancji w czasie, co jest równoznaczne ze wzrostem stężenia produktu w kuwecie oraz świadczy o postępie reakcji. Z tego też względu natychmiast po zmieszaniu substratów wykonano pomiar absorbancji mieszaniny reakcyjnej. Otrzymana prosta była podstawą do wykonania dalszych obliczeń - wyznaczenia aktywności aldolazowej, a następnie totalnej i specyficznej. Zgodnie z obserwacją aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu, a aktywność totalna od objętości roztworu. W literaturze odnotowano aktywność specyficzną aldolazy wynoszącą 10-12 U/mg [1]. W przeprowadzonym doświadczeniu otrzymano mniejszą wartość aktywności aldolazy, może to być wynikiem różnych warunków przeprowadzanych eksperymentów tj. innego pH oraz temperatury. Co więcej, być może w doświadczeniu był używany roztwór aldolazy otrzymany inną metodą niż wymieniony w artykule, mogło to mieć później wpływ na aktywność enzymu.

2. W wyniku przeprowadzonego doświadczenia uzyskano ok. 100 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu o pH 7,5. Wraz z intensywnym mieszaniem i podwyższoną temperaturą rozpuszczalność siarczanu amonu wzrosła. Uzyskano roztwór niezbędny do wykonania doświadczenia nr 3 – preparacji aldolazy z mięśni królika.

Literatura:

[1] Penhoet E., Rajkumar T., Rutter WJ., Multiple forms of fructose diphosphate aldolase in mammalian tissues, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 56,1966, 1275-1282