1. Test Amesa



Wykorzystywane są odpowidnio skonstruowane szczepy Salmonella typhimurium,
zaiwerające różne mutacje w operonie histydyny (mutanty his- nie są zdolne do
wzrostu na pożywce minimalnej pozbawionej aminokwasu L-histydyny).



Zdolność do wzrostu na pożywce minimalnej umożłiwia bakteriom mutacja powrotna
czyli rewersja do formy o fenotypie his+.



W teście Amesa określna się zdolność badanej substacnji chemicznej do
spowodowanie rewersji.



Stosuje się układ egzogenny w postaci frakcji S9, która umożliwia komórkom
prokariotycznym aktywację enzymatyczną badanej substancji (otrzymywaną z
wątroby szczurów).



Przebieg:

o

Wysiew mutantów his- na podłoże agarowe zawierające minimalną ilość
histydyny.

o

Umieszczenie badanego związku na powierzchni agaru,

o

Wzrost bakterii do momentu wykorzystania całej histydyny.

o

Prztrwanie i zdolność do podziałów i tworzenia kolonii tylko u bakterii u
których nastąpiła rewersja.

o

Po 48 – 72 godzinach prowadzenia hodowli zlicza się hodowle rewertantów
porównując ją z liczbą kolonii rewertantów spontanicznych (hodowlna
kontrolna bez badanego związku).

o

Związek uznawany jest za mutagenny gdy liczba kolonii rewertantó jest
znacznie większa od liczby kolonii rewertantó spontanicznych i skpiają się one
w miejsach występowania mutagenu.



Wymagany jest minimum 2-krotny wzrost liczby rewertantów w porównaniu z
rewertantami spontanicznymi.



Wzrost taki przy użyciu układu S9 zalicza substancję do mutgenów pośrednich, bez
jego zastosowania do bezpośrednich.



Test Amesa jest wysoce skuteczny w wykrywaniu rakotwórczych substancji
chemicznych mających właściwości mutagenne.

2. Test strukturalnych aberracji chromosomowych



W teście tym wykorzystuje się właściwości klastogenne (zdolności do łamania
chromosomów) badanych mutagenów fizycznych i chemicznych.



Obserwuje się aberracje typu chromosomowego (gdy uszkodzeniu ulegną obie
chromatydy) i typu chromatydowego (gdy uszkodzeniu ulegnie tylko jedna
chromatyda, powstają głównie pod wpływem czynników chemicznych).



Do aberracji chromosomowych należą:

o

Wymiany międzychromosomowe,

o

Wymiany wewnątrzchromosomowe,

o

Fragmenty acentryczne,

o

Złamania chromosomowe,

o

Przerwy chromosomowe.



W przypadku aberracji chromosomowych mutageny działały w fazie G1 lub G0, w
rezultacie czego w fazie S doszło do ich podwojenia – aberracje prereplikacyjne.



Aberracje typu chromatydowego:

o

Złamania chromatydowe,

o

Fragmenty minutowe,

o

Przerwy chromatydowe



W wypadku tych aberracji mutagen zadziałał w fazie S późnej lub w fazie G2 w
wyniku czego uszkodzenia dotyczą tylko jednej chromatydy – aberracje
postreplikacyjne.



Obserwacje uszkodzeń chromosomów przeprowadza się w stadium metafazy.



Test aberracji strukturalnych można przeprowadzać in vivo lub in vitro. Materiałem
do testu in vitro mogą być: limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty, trofoblasty,
komórki płynu owodniowego (najczęściej wybiera się limfocyty, łatwo je pozyskać i
namnażać).



Przebieg w warunkach in vitro:

o

Dodanie limfocytów do odpowiedniego medium hodowlanego, w obecności
danej substancji – wymagane jest badanie conajmniej 3 stężeń, przy czym
najwyższe powinno być niższe od stężenia cytotoksycznego. Substancje
trudnorozpuszczalne bada się na granicy ich rozpuszczalności.

o

Dla każdej badanej dawki zakłada się co najmniej dwie hodowle oraz hodowle
kontrolne ujemne (bez badanej substancji) i dodatnie (w obecności już znanego
mutagenu).

o

Jeżeli nie ma dowodów, że substancja jest mutagenem bezpośrednim a
komórki nie posiadają wewnętrznego systemu aktywacji metabolicznej, do
hodowli należy dodać system egzogennej aktywacji enzymatycznej (najczęściej
frakcję S9).

o

Po prowadzeniu hodowli przez 48 godzin w temp. 37 stopni Celsjusza na
ostatnie 2-3 godziny dodaje się inhibitor wrzeciona podziałowego,
przeprowadza szok hipotoniczny przy użyciu roztworu 0,075 M KCl i proces
utrwalania komórek w mieszaninie metanolu i kwasu octowego lodowatego.

o

Z uzuskanej zawieiny sporządza siępreparaty mikroskopowe barwione
barwnikiem Giemsy i poddaje analizie cytogenetycznej.

o

Dla każdej dawki bada się conajmniej 100 metafaz zapisując liczbę
chromosomów oraz rodzaj ich aberracji.



Przebieg w warunkach in vivo:

o

Dojrzałym płciowo myszom podaje się dootrzewnowo lub dożołądkowo
badaną substancję w kilku dawkach (w granicach 20 – 60% wartości dawki
śmiertelnej) Dla kązdej dawki zwykle 5 zwierząt. Próba kontrolna otrzymuje
rozpuszczalnik badanej substancji.

o

Testowany związek podaje się na 30, 48 i 72 godziny. 2 -3 godziny przed
zakończeniem zwierzętom podaje śię dootrzewnowo kolchicynę, usmierca się
je przez dyslokację kręgów szyjnych i podaje dootrzewnowo 0,5 ml 5%
roztworu pentobarbitanu.

o

Z kości udowych wypreparowuje się komórki szpiku kostnego.

o

Końcówka taka sama jak przy in vitro.



Oceny preparatów każdej hodowli dokonują dwie niezależne od siebie osoby.



Dokonuje się oceny statystycznej wyników. Za kryterium mutagennego działania
przyjmuje się statystycznie zmienny wzrost częstości aberracji w próbie badanej w
porównaniu z próbą kontrolną.

3. Test wymian chromatyd siostrzanych (test SCE)



Badanie Sce opiera się na modelu semikonserwatywnej replikacji DNA> jeżeli w
środowisku znajduje się analod tyminy 5 – bromodeoksyurydyna (BrdU) to następuje
jej wbudowanie w mijesce tymidyny.



Po 2 cyklach powstają chromosomy w których jedna chromatyda w obu niciach
posiada BrdU (B-B) a druga w jednej (B-T). Chromatydy B-B wiążą mniej barwnika
Giemsy – są jasne w porównaniu z chromatydami o nici B-T.



W wybarwionych różnicowo chromosomach możemy obserwować zmiany w ich
strukturze polegające na wzajemnych przemieszczeniach homologicznych odcinków
między dwiema siostrzanymi chromatydami.



Analiz indukcji SCE można dokonywać na komórkach dzielących się in vivo(szpik
kostny, komórki nabłonkowe) oraz komórkach mogących się namnażać poza
ustrojem (limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty)



Przebieg in vitro:

o

Namnożenie limfocytów w płynie hodowlanym z BrdU i testowaną substancją
w kilku dawkach. Równolegle prowadzi się hodowlne z frakcją S9 i bez oraz
hodowlne kontrolne z BrdU.

o

Hodowle prowadzi się 72 godziny (2 cykle) i barwi się odpowiednią techniką.

o

Z każdej hodowli analizuje się 50 – 100 metafaz będących w mitozie 2 cyklu.

o

Analiza polega na liczeniu punktów pęknięć i związanych z tym przemieszczeń
dystalnych lub środkowych frgamentó chromatyd siostrzanych.

o

Wyniki obejmujące liczbę analizowanych komórek i średnią liczbę wymian SCE
w przeliczeniu na jedną komórkę wraz z odchyleniem standardowym we
wszystkich hodowlach doświadczalnych i kontrolnyach zestawia się w tabelach.

o

Związek genotoksyczny to taki który powoduje istotny wzrost statystyczny SCE.



Przebieg in vivo:

o

Badania przeprowadza się na dojrzałych płciowo myszach, wszczepiając im
podskórnie lub podając dootrzewnowo BrdU i podaje się im dożołądkowo lub
otrzewnowo roztwór badanej substancji.

o

Kilka dawek w granicach 20 -60% dawki letalnej, dla każdej 4-5 zwierząt.
Równolegle grupy kontrolne otrzymują rozpuszczalnik badanej substancji
(ujemna) i BrdU (dodatnia).

o

Czas trwania eksperymentu to 30 godzin, po którym uśmierca się zwierzęta i z
kości udowych preparuje szpik. Na 3 godziny przed końcem podaje się myszom
roztwór kolchicyny.

o

Reszta tak jak w in vitro.



Przy pomocy SCE można również ocenić dynamikę podziałów komórkowych
obliczając indeks replikacyjny – RI. Analizuje się 100 przypadkowych metafaz i ocenia
liczbę komórek po pierwsyzm, drugim i trzecim podziale mitotycznym. Podziały
rozpoznaje się po różnicach w zabarwieniu chromatyd. Wzór na RI =
1M

1

+2M

2

+2M

3

/100

4. Test mikrojądrowy



Za jego pomocą wykrywa się działania czynników genotoksycznych powodujących
złamania chromosomów i uszkodzenia wrzeciona podziałowego.



Na skutek zaburzeń wrzeciona chromosomy dzielącej się komórki nie rozchodzą się
do biegunów i pozostają w cytoplaźmie tworząc mikrojądra. Mikrojądra powstają
również z odłamanych fragmentów chromosomów.



Test może być wykonywany in vivo i in vitro, z udziałek frakcji S9, lub bez.



Przebieg in vivo:

o

Najczęściej wykorzystuje się erytrocyty polichromatyczne szpiku kostnego lub
śledziony dojrzałych myszy.

o

Badana substancja podawana jest w conajmniej 3 dawkach, drogą
dożołądkową lub iniekcyjną do otrzwenej.

o

Po określonym czasie robi się rozmazy komórkowe, które po zabarwieniu
barwnikiem Giemsy podaje się analizie mikroskopowej.

o

Ocena preparatów polega na określeniu w nich:

 Liczby erytrocytów polichromatycznych w mikrojądrami w 1000

erytrocytach polichromatycznych,

 Liczy erytrocytó polichromatycznych przypadającej na 200 erytrocytów

normochromatycznych w celu orkeślenia stosunku erytrocytów
polichromatycznych do normochromatycznych.

o

Otrzymane wyniki podaje się analizie statystycznej, a substancja badana
wykazuje działąnie genotoskyczne jeżeli wywołuje wzrost częśtośći
występowania erytrocytów polichromatycznych z mikrojąderkami w

porównaniu do częstości tych komórek w grupie kontrolnej. Najcześciej –
kontrolna od 0,2-0,5% a genotoksyk 0,8%-3%.



Przebieg w warunkach in vitro:

o

Hodowle standardowe 72godzinne z krwi żylnej.

o

Limfocyty pobudza się do podziałów fitohemaglutyniną, a na ostatnie 28
godzin dodaje się cytocholazynę B, która zatrzymuje podział komórek na etapie
cytokinezy ale nie zakłóca podziału jądra.

o

W efekcie otrzymujemy dwujądrzaste komórki ze wspólna cytoplazmą i błoną
komórkową (lub wielojądrzaste).

o

Analiza plega na ocenie 500 – 10000 komórek dwujądrzastych z widocznymi
mikrojądrami.

o

Badana substancja jest genotoksyczna jeżeli wywołuje powtarzalny
statystycznie istotny wzrost częstości komórek z mikrojądrami w stosunku do
hodowli kontrolnych.



Za pomocą tego testu można wykazać obecnośc fragmentó acentrycznych ale nie
można ustalić ilu chromatyd dotyczyły delecje. Barwienie centromerów techniką FISH
pozwala na ustalenie czy mikrojądro zostało utworzone przez fragment acentryczny
iderwany od jednej bądż obu chromatyd, czy też utworzone zostało przez cały
chromosom.