Wykłady z genetyki i hodowli roślin ozdobnych, Sulechów (Kalsk), rok akademicki
2005/2006, studia dzienne i zaoczne
Wykład 7
GENETYKA MOLEKULARNA
Budowa i właściwości DNA, replikacja DNA, mutageneza.
Genom to całkowity DNA komórki, obejmujący zarówno wszystkie geny jak i odcinki miedzygenowe.
Genom jest strukturą nieaktywną. Przechowywana jest w nim informacja, sam nie ma jednak zdolności do przekazywania tej informacji do komórki. Genom posiada informację genetyczną potrzebną do powstania tego organizmu i utrzymania go przy życiu.
Genom człowieka zawiera około 80000 genów ale kodujące geny stanowią tylko 3% genomu.
Większość genomów jest zbudowana z DNA, ale niektóre wirusy mają genomy zbudowane z RNA
Budowa i właściwości kwasów nukleinowych
DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) zawiera kompletną informacje o budowie cząsteczek białek i RNA, które z kolei determinują kompletną strukturę i wszystkie funkcje komórek oraz całych organizmów. Informacja ta zapisana jest w postaci liniowej sekwencji zasad. Budowa cząsteczki DNA umożliwia precyzyjne powielanie informacji genetycznej, bez którego nie byłoby możliwe rozmnażanie się organizmów i dziedziczenia cech.
DNA jest polimerem składającym się z długich, nierozgałęzionych łańcuchów polinukleotydowych. Zbudowane są one z jednostek zwanych deoksyrybonukleotydami (nukleotydami). Każdy nukleotyd zawiera trzy części: cukier (deoksyryboza), jedną z czterech zasad azotowych oraz grupę fosforanową. Wspomniane zasady to adenina, guanina (G), tymina (T) lub cytozyna. Adenina (A) i cytozyna (C) są związkami dwupierścieniowymi (puryny), natomiast cytozyna i tymina jednopierścieniowymi (pirymidynami). W RNA tyminę zastępuje strukturalnie bardzo podobna pirymidyna - uracyl (U). W RNA cukrem jest ryboza, dlatego jego składniki nazywa się rybonukleozydami lub nukleozydami.
Informacje genetyczną koduje sekwencja zasad w polinukleotydach DNA (A,C,G,T/U). Sekwencję tę przedstawia się zawsze w kierunku 5'_3' . W takim właśnie kierunku tworzy się kopia cząsteczek DNA.
Cząsteczki DNA mają charakterystyczną strukturę przestrzenną, znaną jako dwuniciowa helisa. Strukturę DNA odkryli w roku 1953 Watson i Crick. Heliks DNA można porównać do skręconej spiralnie drabiny, której szczeble tworzą oddziaływujące na siebie zasady, natomiast pionowe listwy - związki cukrowo-fosforanowe. Antyrównoległe łańcuchy DNA są okręcone wokół siebie prawoskrętnie. Antyrównolegle to znaczy że jeden łańcuch biegnie od 5'-3', a drugi 3'-5'. Na jeden obrót helisy DNA przypada 10 par zasad.
Zasady dwóch łańcuchów polinukleotydowych wzajemnie ze sobą oddziaływują. Zawsze tymina oddziaływuje z adeniną, a guanina z cytozyną. Pomiędzy zasadami tworzą się wiązania wodorowe, stabilizujące te oddziaływania. Wiązania G-C są silniejsze od A-T, z uwagi na trzy a nie dwa wiązania wodorowe. Mogą one ulec przerwaniu na skutek działania wysokich temperatur lub niektórych związków chemicznych. Powoduje to rozdzielenie się obu nici helisy: cząsteczki które uległy temu procesowi są określane jako zdenaturyzowane, W komórkach istnieją enzymy, które rozdzielają nici helisy, co jest konieczne do kopiowania DNA oraz ekspresji informacji genetycznej.
Komplementarne parowanie zasad - sposób w jaki zasady dwóch nici DNA łączą się w pary.
Genomy eukariotyczne
Podstawowa struktura fizyczna wszystkich genomów eukariotycznych jest bardzo podobna. Poszczególne genomy różnią się wielkością. Najkrótsze nie przekraczają 10Mb par zasad, największe przekraczają 100000Mb par zasad. Wielkość jest do pewnego stopnia skorelowana ze złożonością organizmu. Grzyby mają najmniejsze genomy, największe kręgowce i rośliny okrytozalążkowe. Należałoby oczekiwać, że złożoność organizmu jest związana z liczbą genów w jego genomie - wyższe eukariota potrzebują większych genomów, aby pomieścić dodatkowe geny. Ta zależność nie jest dokładna. Przykład. Grzyb (drożdże) Saccharomyces cerevisiae, o długości 12 Mb, co stanowi 0,004 długości genomu ludzkiego powinien zawierać 0,004 x 80000, czyli 320 genów. Faktycznie zawiera 6000 genów. Wynika to z faktu iż w genomach mniej skomplikowanych organizmów przestrzeń jest wykorzystywana oszczędniej, ponieważ ich geny leżą bliżej siebie. W przypadku drożdży tylko nieliczne geny są nieciągłe. Niewiele jest też sekwencji powtarzających się rozproszonych w genomie (w genomach niektórych roślin dominują powtarzające się sekwencje DNA).
Rozmiary genomów u roślin (przykłady):
Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik) 100Mb (100 000 000) par zasad
Ryż 565 Mb par zasad
Groch 4800 Mb par zasad
Pszenica 17000 MB par zasad
Człowiek posiada około 3000 Mb par zasad
Replikacja DNA
Replikacja genomowego DNA zachodzi w czasie każdego podziału komórkowego.
Replikacja DNA jest procesem zapewniającym przekazywanie niezmienionej informacji genetycznej z komórek rodzicielskich do potomnych. Proces ten przebiega w sposób bardzo precyzyjny. Istnieje cały system ochronny pozwalający na wykrycie i naprawę błędów w DNA powstałych podczas replikacji komórki.
Synteza nowych nici DNA może zachodzić tylko z udziałem nici rodzicielskich. W wyniku replikacji otrzymuje się dwie identyczne dwuniciowe cząsteczki DNA, z których każda zawiera jedną nić pierwotną i jedną nowo zsyntetyzowaną (replikacja jest procesem semikonserwatywnym).
Replikację przeprowadzają enzymy - polimerazy DNA. Syntetyzują one nową nić DNA komplementarnie w stosunku do nici służącej jako matryca. Synteza przebiega zawsze od 5' do 3'
Proces replikacji DNA
Proces replikacji DNA został podzielony na 3 odrębne fazy: inicjacja, elongacja i replikacja
Inicjacja - rozpoznanie miejsca (lub miejsc) w obrębie cząstewczki DNA, od którego (od których) replikacja się zaczyna
Elongacja - obejmuje procesy związane z działaniem widełek replikacyjnych podczas kopiowania rodzicielskich łańcuchów polinukleotydowych.
Terminacja - proces kończenia i ostatecznego kompletowania nowych łańcuchów DNA
Inicjacja syntezy DNA zaczyna się zawsze w tym samym określonym miejscu (lub miejscach) cząsteczki DNA. Miejsce to nazywamy regionem inicjacji replikacji. Po inicjacji widełki replikacyjne przesuwają się w przeciwnych kierunkach wzdłuż replikowanej cząsteczki DNA. U eukariotów liczby nukleotydów kopiowanych przez jedną parę widełek replikacyjnych są mniejsze niż u prokariotów gdyż organizmy te posiadają wiele miejsc inicjacji. W czasie replikacji DNA oba łańcuchy podwójnej helisy muszą ulegać kopiowaniu. Polimerazy DNA są zdolne do syntezy DNA tylko w kierunku 5'-3'. Oznacza to, że tylko jedna nić zwana nicią prowadzącą może być kopiowana w sposób ciągły. Druga nić zwana nicią opóźnioną jest kopiowana w formie krótkich fragmentów.
Obecność startera jest bezwarunkową koniecznością w replikacji DNA. Startery do replikacji zbudowane są z RNA. Startery są syntetyzowane przez specyficzne rodzaje polimerazy DNA. Do wykształconego startera przyłącza się główny enzym replikacyjny DNA -polimeraza DNA innego typu niż ta, która brała udział w syntezie starterów . Na nici opóźnionej synteza starterów musi być procesem powtarzalnym zachodzącym przy każdej inicjacji nowego fragmentu Okazaki.
Synteza fragmentu DNA u eukariotów kończy się w momencie napotkania przez polimerazę DNA następnego startera RNA. W komórkach bakterii oraz niektórych plazmidów miejsce zakończenia replikacji jest zdefiniowane przez specyficzne sekwencje "ter". Na tym etapie polimeraza DNA usuwa już niepotrzebny starter RNA i zastępuje go DNA.
Widełki replikacyjne
DNA przed skopiowaniem musi zostać odwinięty z nukleosomów. Za rozplecenie helisy DNA odpowiedzialny jest enzym zwany helikazą. Po rozdzieleniu nici DNA białka SSB wiążą się z jednoniciową DNA zapobiegając odtworzeniu dwuniciowej helisy. Rozdzielające się w miejscu syntezy łańcuchy DNA tworzą widełki replikacyjne.
Czas potrzebny na odwinięcie się nici DNA z nukleosomów ogranicza szybkość przesuwu widełek do 50 par zasad na sekundę. Po zakończeniu replikacji nowe nukleosomy są odtwarzane z mieszaniny starych i nowo syntetyzowanych histonów.
Jeżeli replikacja DNA rozpoczyna się wewnątrz dwuniciowej struktury chromosomów liniowych lub kolistych, widełki replikacyjne tworzą strukturę "oczka replikacyjnego", powiększającego się w miarę oddalania widełek.
Fragmenty Okazaki
Ponieważ obie nici matrycowego DNA są zorientowane względem siebie w przeciwnych kierunkach i są kopiowane równocześnie tylko jedna nić DNA może być wydłużana w sposób ciągły, zgodnie z przesuwaniem się widełek. Druga musi być syntetyzowana w postaci krótkich fragmentów (tzw. fragmentów Okazaki), łączących się następnie w jedną nić.
W komórkach eukariotycznych odcinek Okazaki zawiera około 200 nukleotydów. Wskazuje to, iż każdy odcinek Okazaki odpowiada replikacji fragmentu DNA obejmującego pojedynczy nukleosom (140-150 bp nici DNA owiniętej wokół histonowego jądra nukleosomu plus odcinek 50-70 bp łączący poszczególne nukleosomy.
Końcowy etap syntezy nici opóźnionej polegający na łączeniu ze sobą fragmentów Okazaki katalizowany enzymem zwanym ligazą DNA nazywamy LIGACJĄ.
Nić syntetyzowana w sposób ciągły nosi nazwę nici prowadzącej natomiast nieciągły - nici opóźnionej
Jednostkę replikacji (replikonem) nazywa się każdy odcinek DNA , który replikuje się jako pojedyncza jednostka. U bakterii replikon obejmuje cały genom. U eukariotów replikacja rozpoczyna się w wielu miejscach lecz przebiega wolniej niż u eukariotów. Z uwagi, iż przebiega w wielu miejscach równocześnie, zakładając tą samą długość odcinka DNA, u bakterii trwa do 20 x dłużej.
Replikacja telomerów .
Końce liniowych chromosomów nie mogą być w pełni zreplikowane za pomocą nieciągłej replikacji z powodu braku miejsca dla startera RNA. Końce chromosomów eukariotycznych (telomery) są zbudowane z wielu kopii prostej, nieinformacyjnej sekwencji z końcem 3' wystającym poza koniec 5' . Enzym telomeraza zawiera krótką cząsteczkę RNA, w części komplementarną do sekwencji telomerowych. RNA działa jako matryca do syntezy tych powtórzeń na wystającym końcu 3'. Koniec nici opóźnionej (5') zostaje skopiowany przy wykorzystaniu jako matrycy wydłużonej nici wiodącej. Proces wydłużania może zachodzić setki razy aż do oddysocjowania telomerazy. Proces wydłużania i skracania chromosomów jest zrównoważony, dzięki czemu chromosomy pozostają jednakowej długości.
W komórkach somatycznych aktywność telomerazy jest hamowana, co prowadzi do skracania się chromosomów w kolejnych podziałach. Gdy skracanie dochodzi do obszarów DNA zawierających informację, komórki zamierają.
DNA eukariotryczny jest zorganizowany w pętle (domeny). Pętle tworzą odcinki włókna chromatynowego (do 20 tysięcy par zasad), dołączone u podstawy do struktury zbudowanej prawie wyłącznie z nierozpuszczalnych włókien białkowych zwanej matriks jądrową.
MUTACJE
Mutacje są to dziedziczne stałe zmiany normalnej sekwencji DNA, spowodowane działaniem czynników fizycznych, chemicznych lub błędami w replikacji DNA.
Mutacje DNA są powodem chorób genetycznych i nowotworów Choroby genetyczne są powodowane przez mutacje dziedziczne. Zwykle dotyczą pojedynczego genu.
Uszkodzenia DNA mogą być mutagenne i/ lub letalne
Nagromadzenie się wielu cichych mutacji (występujących w niekodującej lub nieregulatorowej części DNA) i nieletalnych mutacji w populacjach powoduje powstawanie polimorfizmu genetycznego.
Mutacje dziedziczne powstają w komórkach zarodkowych, nowotworowe w komórkach somatycznych.
Organizm o fenotypie zmienionym w wyniku mutacji nazywamy mutantem.
Mutacja punktowa - polega na zmianie pojedynczej zasady
Większe mutacje - zmiana więcej niż jednej zasady DNA
Mutageny fizyczne - promieniowanie jonizujące i niejonizujące (promienie X , UV)
Mutageny chemiczne - analogi zasad lub inne związki chemiczne mogące reagować z DNA i zmieniać jego właściwości.
Mutacje mogą zachodzić również spontaniczne na skutek chemicznej reakcji DNA z kilkoma rodzajami związków chemicznych występujących normalnie w komórce.
NAPRAWA DNA
Większość mutacji może być odwrócona przez mechanizmy naprawcze DNA do których należą procesy wycinania uszkodzonych nukleotydów oraz mechanizmy naprawy nie dopasowanych nukleotydów.
Naprawa przez wycinanie (najbardziej powszechny ze wszystkich systemów naprawczych)
Jeden z enzymów rozpoznaje uszkodzone nukleotydy. Endonukleaza wytwarza nacięcia po każdej stronie uszkodzonego miejsca a uszkodzony odcinek DNA zostaje usunięty. Powstała luka zostaje wypełniona przez polimerazę DNA, która syntetyzuje nowe fragmenty DNA. Ligaza łączy następnie nowo powstały odcinek z istniejącą cząsteczką.
Naprawa źle sparowanych zasad
System ten polega na wycinaniu źle sparowanych zasad powstałych podczas replikacji DNA. W parach zasad źle dobranych niewłaściwa zasada znajduje się na nici potomnej. System ten umożliwia odróżnienie prawidłowej nici macierzystej od potomnej.
Pytania egzaminacyjne
39. Budowa i właściwości kwasów nukleinowych (narysuj schemat budowy DNA, znany Ci z wykładów, bez rysunku nie zaliczam odpowiedzi na pytanie)
40. Genom
41. Replikacja DNA (inicjacja, elongacja, terminacja, widełki replikacyjne, (bez rysunku nie zaliczam odpowiedzi na pytanie)
42. Replikacja nici opóźnionej (omów na rysunku, bez rysunku nie zaliczam odpowiedzi na pytanie)
43. Replikacja telomerów (omów na rysunkach, bez rysunku nie zaliczam odpowiedzi na pytanie)
44. Mutacje