Temat: Czynniki warunkujące aktywność enzymów

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest poznanie wpływu takich podstawowych czynników jak temperatura, stężenie jonów wodorowych oraz stężenie enzymu na aktywność enzymów.

Odczynniki:

1. roztwór enzymu (wyciąg z kiełków pszenicy)

2. bufor o pH = 3,0

3. bufor o pH = 4,4

4. bufor o pH = 5,2

5. bufor o pH = 6,6

6. 0,00075-molowy 4-nitrofenylofosforanu

7. 10 % roztwór NaCO₃

Szkło i inne pomoce:

- 1 zlewka na 600 ml

- 1 pipeta serologiczna na 1 i 5 ml oraz

- 14 probówek chemicznych.

Metoda i Wykonanie:

Próba zerowa:

Do probówki wlano 1,25 ml H₂O, dodano to tego 0,5 bufora o pH= 5,2 i umieszczono na pięć minut w łaźni wodnej o temp. 38˚C. Następnie roztwór wyjęto i dodano 0,5 ml 4-nitrofenylofosforanu, wymieszano i inkubowano przez 10 min w temp. 38˚C . Po upływie wyznaczonego czasu dodano 2,5ml NaCO₃.

Wpływ temperatur:

Do trzech probówek odmierzono po 0,5 ml roztworu enzymu , następnie 0,5 ml wody i 0,75 ml buforu o pH = 5,2 . Pierwszą próbówkę umieszczono w temp. 0˚C (woda z lodem), drugą w łaźni wodnej o temp. 38˚C, a trzecią w łaźni wodnej temp. 100˚C na około 5 minut. Następnie probówki wyjęto i dodano 0,5 ml 4-nitrofenylofosforanu, wymieszano i inkubowano przez 10 min w temp. 38˚C . Po upływie wyznaczonego czasu dodano 2,5ml NaCO₃.

Wpływ stężenia enzymu:

Do pięciu probówek odmierzono kolejno po 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 ml roztworu enzymu i odpowiednio po 1,0; 0,75; 0,5; 0,25 ml H₂O (do probówki z 1,25 ml enzymu nie dodano wody). umieszczono na pięć minut w łaźni wodnej o temp. 38˚C do każdej probówki po 0,5 ml buforu o pH = 5,2. Tak przygotowane roztwory umieszczono na pięć minut w łaźni wodnej o temp. 38˚C. Po upływie wyznaczonego czasu dodano probówki wyjęto i dodano 0,5 ml 4-nitrofenylofosforanu, wymieszano i inkubowano przez 10 min w temp. 38˚C. Następnie dodano 2,5ml NaCO₃ do każdej.

Wpływ stężenia jonów wodorowych (pH):

Do czterech probówek odmierzono po 0,5 ml roztworu enzymu, następnie 0,5 ml wody i odpowiednio po 0,75 ml buforu o pH = 3,0; 4,4; 5,2; 6,6. Tak przygotowane roztwory umieszczono na pięć minut w łaźni wodnej o temp. 38˚C. Po upływie wyznaczonego czasu dodano probówki wyjęto i dodano 0,5 ml 4-nitrofenylofosforanu, wymieszano i inkubowano przez 10 min w temp. 38˚C. Następnie dodano 2,5ml NaCO₃ do każdej.

Obserwacje:

Po dodaniu buforu i 4-nitrofenylofosforanu nie zaobserwowano żadnej zmiany barwy. Po inkubacji i dodaniu następnego odczynnika (roztwór NaCO₃)można dostrzec jak roztwór zmienia barwę z bezbarwnej na odcień zieleni. W zależności od aktywności enzymu barwa jest intensywniejsza (przy większym), bądź mało intensywna (przy mniejszym).

Wyniki:

Po ustawieniu fotometru na próbę zerową uzyskano wyniki dla poszczególnych prób, następnie przedstawiono je w tabelkach i sporządzono wykresy zależności:

a) Temperatura

Tabela wyników wpływu temperatury:

temperatura	0˚C	38˚C	100˚C
wynik	0,012	0,233	0,023

2. Stężenie enzymu

Tabela wyników wpływu stężenia enzymu

stężenia enzymu	0,25 ml	0,5 ml	0,75 ml	1,0 ml	1,25 ml
wynik	0,187	0,315	0,316	0,571	0,765

Schemat rozcieńczeń

c) pH
Tabela wyników wpływu pH

pH	3,0	4,4	5,2	6,6
wynik	0,053	0,189	0,288	0,167

Schemat rozcieńczeń

Obliczanie aktywności enzymu:

1. w temperaturze 38˚C

A- Absorpcja

0,002 - molowy współczynnik 4-nitrofenylofosforanu

139 - masa molowa produkt

2. o stężeniu równym 0,5 mola

A- Absorpcja

0,002 - molowy współczynnik 4-nitrofenylofosforanu

139 - masa molowa produkt

3. o pH = 5,2

A- Absorpcja

0,002 - molowy współczynnik 4-nitrofenylofosforanu

139 - masa molowa produkt

Wnioski:

W zależności od temperatury, stężenia enzymu czy też pH roztworu, absorpcja fali jest większa bądź mniejsza. Największą wartość osiąga w optymalnych warunkach, to jest w temperaturze 38˚C i w środowisku o pH = 5,2. Zwiększone stężenie roztworu nie powoduje spadku absorpcji, jak to jest w przypadku poprzednich czynników.

Aktywność enzymu w optymalnych warunkach i o odpowiednim stężeniu powinna być zbliżona. Aktywność enzymu mierzonego jest rozbieżna, co wskazuje na błąd podczas mierzenia bądź przygotowywania próbek.

---