Data ćwiczenia: 03.11.2009r.

Jarosz Aldona

Jonak Katarzyna

Kopeć Agnieszka

Biotechnologia, semestr III

Wydział: AEiI

Grupa: AUT 2

Sekcja 12

SPRAWOZDANIE

Ćwiczenie nr 3

Temat ćwiczeń:

Elektroforeza białek w denaturującym żelu poliakrylamidowym

I WSTĘP TEORETYCZNY:

W elektroforezie żelowej ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów, agaru lub skrobi, uformowany w płytkę długości kilkunastu - kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (rzadziej jest to słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu - studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (np.
w formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną, elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki w oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw. markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.

Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów znakowanych izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram).
W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się
i poddaje procesowi elucji.

Zastosowanie SDS (siarczan dodecylu sodu) - substancji powierzchniowo czynnej
- w elektroforezie przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości techniki elektroforetycznej. Potraktowanie cząsteczki białka przez SDS skutkuje powstaniem 15 kompleksów białko-SDS o ustalonym stosunku ładunku elektrycznego do masy. Wykazano, że 1g białka wiąże 1,4g SDS. W kompleksie takim SDS skutecznie maskuje oryginalny ładunek białka normalnie występujący w danym elektrolicie. Właściwość ta pozwala na łatwe i dokładne oznaczenie mas cząsteczkowych rozdzielonych białek. Obecność SDS przynosi szereg korzyści:

- zdecydowana większość białek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS,

szczególnie po redukcji mostków disiarczkowych, ,

- barwienia kompleksów białko-SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka,

- obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji.

Żele denaturujące:

Żele te polimeryzowane są w obecności substancji denaturujących (mocznik, rzadziej formamid), które uniemożliwiają na parowanie zasad w kwasach nukleinowych. Szybkość migracji w żelach denaturującyh jest niezależna od sekwencji kwasów nukleinowych. Żele te wykorzystywane są w sekwencjonowaniu DNA/RNA oraz oznaczaniu polimorfizmów długości (STR).

Właściwości elektroforezy przy zastosowaniu poliakrylamidu:

-mała rozpiętość rozdziału, ale wysoka rozdzielczość rozdziału (do 1 pz.).

- Żele 3.5 - 20% pozwalają na rozdział DNA o długościach 10 pz do 2 tys pz.

- akrylami jest związkiem silnie toksycznym, poliakrylamid może zawierać niewielkie ilości niespolimeryzowanego akrylamidu.

- Bardziej skomplikowane przygotowanie żelu.

- Żele wertykalne (pomiędzy szybami).

Wylewanie żelu :

Idealnie czyste szyby należy złożyć, umieszczając między nimi przekładki
o odpowiedniej grubości i uszczelnić zestaw. Szyby powinny być ściśnięte spinaczami. Następnie włożyć grzebień i zaznaczyć pisakiem granicę żelu rozdzielającego na 0.5 cm od dolnej granicy grzebienia. Aby wylać żel poliakrylamidowy, należy zmieszać składniki
w odpowiednich proporcjach podanych w instrukcji.

Zwykle przed dodaniem katalizatorów (APS i TEMED) zaleca się odpowietrzenie mieszaniny. Roztwór APS przygotowuje się na świeżo. Katalizatory dodaje się tuż przed wylaniem mieszaniny pomiędzy szyby. Od razu po dodaniu katalizatorów polimeryzacji roztwór należy wymieszać i przy pomocy pipetki nalewa między szyby, pamiętając
o zostawieniu miejsca na żel zatężający. Na wierzch żelu nakłada się cienką warstwę
n-butanolu. Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego osusza się jego górną część przy pomocy bibuły, a następnie wylewa żel zatężający. Grzebień umieszcza się w żelu zatężającym tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza. Przed elektroforezą żel (pomiędzy szybami) umieszcza się w aparacie i zalewa buforem elektrodowym. Po ostrożnym wyjęciu grzebienia z żelu nie można zapomnieć o przepłukaniu studzienek i usunięciu pęcherzy powietrza spomiędzy szyb w dolnej części żelu.

II. PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA

Celem ćwiczenia był rozdział białek według mas cząsteczkowych wykorzystując metodę elektroforezy w żelu denaturującym.

Materiał i odczynniki potrzebne w ćwiczeniu:

Preparaty z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych izolowane na ćwiczeniu 1

Preparaty z izolacji białek wiążących DNA (wszystkie frakcje) z ćwiczenia 2

Żel rozdzielający 12%

H2O	2.12 ml
1M Tris:HCl pH 8.8	2.63 ml
40% akrylamid	2.1 ml
20% SDS	35 l
10% APS	70 l
razem:	7 ml

Żel zagęszczający 6%, 2 ml

H2O	1.47 ml
1M Tris:HCl pH 6.8	250 μl
40% akrylamid	254 μl
20% SDS	10 μl
10% APS	20 μl
razem:	2 ml
dodać TEMED	2 μl

Bufor obciążający 6x stężony:
60% glicerol; 300 mM Tris:HCl pH 6.8; 12 mM EDTA; 12% SDS; 864 mM 2-merkaptoetanol; 0.05% błękit bromofenolowy

Bufor do elektroforezy:
192 mM glicyna; 0.1% SDS; 25 mM Tris:HCl pH 8.3

Markery białkowe „prestained”(Fermentas)

Barwnik do żelu:

0,25 g Coomassie Blue R; 45 ml H₂O; 45 ml metanolu; 10 ml kwasu octowego 99.9%

Odbarwiacz do żelu:

750 ml H₂O; 150 ml metanolu; 100 ml kwasu octowego 99.9%

APS służy jako dostawca tlenu, natomiast SDS to środowisko denaturujące białka (poprawia rozdzielczość metody). Bufor obciążający to substancja pozbawiona ładunku, która pozwala na umieszczenie próbki bezpośrednio na powierzchni żelu, a TEMED katalizuje reakcję polimeryzacji.
W czasie wykonywania doświadczenia należało uważać, gdyż niespolimeryzowany akrylamid jest substancją trującą.

1. Wylewanie żelu

Na początku ćwiczeń należało złożyć aparaturę do elektroforezy. W tym celu złożyłyśmy dwie szyby, z których jedna zawierała odstępniki, a druga była gładka. Spięłyśmy je klipsami
i zamocowałyśmy na podstawce. Pomiędzy szybki włożyłyśmy grzebień i oznaczyłyśmy markerem granicę żelu rozdzielającego ok. 0,5 cm od dolnej granicy grzebienia.

Do przygotowania żelów użyłyśmy odczynników podanych powyżej w tabelkach. Najpierw przygotowałyśmy 7 ml żelu rozdzielającego 12% bez dodatku TEMED: do 2,12 ml wody destylowanej dodałyśmy 2,63 ml buforu Tris:HCl o pH 8.8, 2,1 ml akrylamidu (40%), 35 μl SDS (20%) i 70 μl APS (10%). Całość zworteksowałyśmy. 1ml roztworu przeniosłyśmy do osobnej probówki i dodałyśmy 3 μl TEMED. Po raz kolejny zworteksowałyśmy probówkę. Przy pomocy pipety automatycznej wylałyśmy 1000 μl żelu z probówki pomiędzy złożone wcześniej szyby. Po wykonaniu tych czynności odczekałyśmy około 10 minut, aż żel spolimeryzuje. Do pozostałej
w probówce mieszaniny dodałyśmy 6 μl TEMED i wlałyśmy od razu, wcześniej sprawdzając czy żel rozdzielający nie wylewa się z szybek, pomiędzy szyby do wcześniej oznaczonego markerem poziomu żelu rozdzielającego. Na powierzchnię niespolimeryzowanego żelu naniosłyśmy ostrożnie około 1ml wody destylowanej do poziomu osiągnięcia przez nią górnej krawędzi szybek. Pozostawiłyśmy około 10 minut do spolimeryzowania. W tym czasie przygotowałyśmy 2 ml 6% żelu zagęszczającego: do 1,47 ml wody destylowanej dodałyśmy 250 μl Tris:HCl o pH 6.8, 254 μl akrylamidu (40%), 10 μl SDS (20%) i 20 μl APS (10%). Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego wylałyśmy zza szybek wodę i wysuszyłyśmy je bibułą. Do żelu zagęszczającego dodałyśmy 2 μl TEMED i od razu wlałyśmy pomiędzy szybki do utworzenia menisku wypukłego. Następnie włożyłyśmy grzebień, tak by nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Żel pozostawiłyśmy do spolimeryzowania.

2. Przygotowanie preparatów

W czasie oczekiwania na spolimeryzowanie żelu przystąpiłyśmy do przygotowania preparatów, które będziemy rozdzielać metodą elektroforezy w SDS. Na początku podpisałyśmy wszystkie probówki numerami od 1 - 7. Z preparatów, które wyizolowałyśmy na ćwiczeniach poprzednich (EC - ekstrakt cytoplazmatyczny i EJ - jądrowy) pobrałyśmy po 20 μg białka.

Ponieważ nasz ekstrakt jądrowy na wcześniejszym ćwiczeniu wykorzystała inna grupa, posłużyłyśmy się ekstraktem jądrowym wyizolowanym przez sekcję 2 . Na podstawie obliczeń przedstawionych poniżej, stwierdziłyśmy, iż do probówki 1 należy pobrać 4,5
EC, do drugiej 2,5
EJ .

Preparat EC uzupełniłyśmy 1 M NaCl tak, by końcowe stężenie wynosiło 0,2 M Na Cl.

x_NaCl = 4,5*0,2 = 0,9
NaCl

x_NaCl - ilość NaCl

Z powodu braku odpowiedniej pipety:

0,9
* 2 = 1,8
NaCl

1,8 1M NaCl + 1,8 H₂O = 3,6 NaCl

3,6 NaCl + 4,5 EC = 8,1

Aby uzyskać 15
uzupełniłyśmy nasz preparat 0.2M NaCl.

15
-8,1
= 6,9
0,2M NaCl

Preparat EJ uzupełniłyśmy wodą destylowaną i 0,2M NaCl.

Początkowo miałyśmy 2,5
EJ, które zawierało w sobie 0,4M NaCl.

2,5
EJ + 2,5
H₂O = 5

Aby uzyskać 15
preparatu dodałyśmy 0,2M NaCl

15
-5
= 10
0,2M NaCl

W naszej sekcji brak było osadu białkowego izolowanego na poprzednich ćwiczeniach, dlatego też probówkę nr 3 pozostawiłyśmy pustą.

Do kolejnej probówki (nr 4) pobrałyśmy 15 μl preparatu EC-NZ (ekstrakt cytoplazmatyczny
z niezwiązanymi białkami).

Ze wszystkich frakcji pobrałyśmy po 20 μl preparatów kolejno do probówek: 5 (EC-F1), 6 (EC-F2)

i 7 (EC-F3) (to ekstrakty cytoplazmatyczne z białkami związanymi). Na koniec do preparatów znajdujących się w probówkach 1, 2 i 4 dodałyśmy po 3 μl LB stężonego 6x (bufor obciążający), a do reszty probówek - po 4 μl.

Wszystkie próby (od 1 do 7 bez próbki pustej nr 3) gotowałyśmy przez 3 minuty w termobloku
w temperaturze 99 °C. Następnie zwirowałyśmy je krótko na maksymalnych obrotach (przycisk „short”, 14000 obrotów/min.).

4. Elektroforeza preparatów białkowych

Nasza sekcja wykonała bufor do elektroforezy. Do cylindra o pojemności 1000 ml wlałyśmy 200 ml buforu do elektroforezy stężonego 5x i dopełniłyśmy wodą destylowaną do 1000 ml (wlałyśmy 800 ml wody). Na szybkach z żelami podpisałyśmy każdą kieszonkę numerem, jakim oznaczone są probówki z poszczególnymi substancjami, zaczynając od oznaczenia kieszonki na marker literką M. Puste kieszonki skreśliłyśmy znakiem X. Wyjęłyśmy spomiędzy szybek grzebień, by przygotować kieszonki do nanoszenia na żel preparatów. Nasze szybki z żelem umieściłyśmy w aparacie do elektroforezy z 3 szybkami innych sekcji. Szyby ułożyłyśmy dłuższą częścią na zewnątrz
i wstawiłyśmy do stelaża. Po wstawieniu szyb zamknęłyśmy stelaż i włożyłyśmy szyby do naczynia. Gdy każda sekcja umieściła w aparacie swoje szybki wlałyśmy bufor do elektroforezy do wewnętrznej części pomiędzy szybami i do zewnętrznej części do poziomu zaznaczonych ścieżek.

Do ścieżki oznaczonej literą M naniosłyśmy 5 μl markera. Do następnych ścieżek naniosłyśmy w całości nasze preparaty oznaczone numerami 1, 2, 4, 5, 6 i 7.

Elektroforezę prowadzono pod napięciem 100V przez 15 minut, a następnie napięcie zwiększono do 200V. Czas trwania elektroforezy wyniósł ponad godzinę, aż do przejścia barwnika do końca żelu (w przypadku naszych preparatów barwnik nie przeszedł do końca, jednak elektroforeza została zatrzymana, ponieważ jedna z sekcji miała już barwnik przy dolnej krawędzi szybki).

Po skończonej elektroforezie rozłożono aparat. Wyjęłyśmy nasze szybki i ostrożnie rozdzieliłyśmy je przy pomocy łopatki. Zaznaczyłyśmy żel. Łopatką odcięłyśmy ostrożnie żel zagęszczający i korek (żel znajdujący się około 1cm od dolnej krawędzi szybki oraz fragment żelu, w którym „umieszczone” były kieszonki), by nie szczerbić żelu rozdzielającego z żadnej strony. Żel przeniosłyśmy do pudełka plastikowego i zalałyśmy aż do pokrycia barwnikiem zawierającym metanol (dlatego należało zalewać żel pod wyciągiem). Tak przygotowany żel pozostawiłyśmy na kołysce na około 30 minut. Po tym czasie zlano barwnik do butelki, a żel zalano odbarwiaczem i pozostawiono na kołysce do odbarwienia tła.

Przez kolejne dni, aż do piątku jedna osoba z grupy przychodziła do pracowni, by wymienić odbarwiacz na nowy. Osoba z piątku zrobiła także zdjęcia każdego żelu.

3. WYNIKI

Od prawej strony:

• kieszonka - Marker (pomimo bardzo słabej jakości zdjęcia dobrze widoczne prążki)

• kieszonka - Ekstrakt cytoplazmatyczny

• kieszonka - Ekstrakt jądrowy

• kieszonka - pusta

• kieszonka - Ekstrakt cytoplazmatyczny z niezwiązanymi białkami

• kieszonka - ECF1

• kieszonka - ECF2

• kieszonka - ECF3 - Prążki bardzo dobrze widoczne

4. WNIOSKI

…

Zdjęcie jest bardzo słabej jakości, co uniemożliwia nam dokładne odczytanie wyników z elektroforezy.

Podczas wymiany odbieralnika w ostatnim dniu, przełożono nasz żel z elektroforezy do innego, nie podpisanego pojemnika. Uniemożliwiło nam to ponowne zrobienie zdjęcia lepszej jakości.

W 2 i w 6 kieszonce nasz preparat był zabrudzony, ponieważ przy wkładaniu do kieszonek, początkowo wzięłyśmy końcówki preparatów z innej sekcji.

Istnieje konieczność zmiany odbarwiacza, ponieważ w każdym dniu przy jego zmianie, odbarwiacz miał barwę niebieskawą.

Nie mam pojecia które preparaty mialy wyjsc w elektroforezie a które nie.. ;/;/;/

---