PATOMORFOLOGIA wykład 10 (4 XII 00)
APOPTOZA
(gr. apoptosis, opadanie liści z drzew)
Cechy morfologiczne komórek apoptotycznych:
mniejsze o nieregularnym kształcie
kondensacja chromatyny (hiperchromazja DNA) jądro ciemniejsze w hematoksylinie, jaśniejsze w barwieniu fluorescencyjnym
brak ziarnistości chromatyny
fragmentacja jądra komórkowego (karryorhexis)
uwypuklenia błony komórkowej
obecność ciałek apoptotycznych
organella komórki niezmienione
Apoptoza w warunkach fizjologicznych:
obumieranie komórek w trakcie embriogenezy
inwolucja
apoptoza komórek endometrium w cyklu miesiączkowym
atrezja pęcherzyków Graafa np. po menopauzie
zanik prostaty po kastracji
zmiany w sutku po zakończeniu karmienia
apoptoza komórek nabłonka jelitowego
Apoptoza w warunkach patologicznych:
apoptoza komórek nowotworowych
apoptoza neutrofili w zapaleniach ostrych
apoptoza limfocytów B i T w niedoborach cytokin
apoptoza cytotoksyczna limfocytów T w odrzucaniu przeszczepów
apoptoza komórek miąższowych przy niedrożności przewodów wyprowadzających (trzustka, ślinianki, nerki)
ciałka Councilmana w hepatitis viralis
w odpowiedzi na uszkodzenie wywołane napromienianiem, CHTH (chemoterapią), niedotlenieniem (niskie stężenie, wysokie wywoła nekrozę)
Choroby związane z apoptozą i ↑ przeżyciem komórki (dłuższym):
nowotwory złośliwe
choroby autoimmunologiczne
Choroby związane z apoptozą i ↓ przeżyciem komórki (krótszym):
choroba degeneracyjna UN
choroby wywołane niedotlenieniem (infarctus myocardii, najpierw apoptoza, potem nekroza)
deplecja limfocytów T (AIDS)
Zmiany biochemiczne i molekularne w komórkach apoptotycznych:
- promotory (bax)
----------------------- (zwiększenie stosunku)
inhibitory (bcl-2)
zmiany w mitochondriach:
↓ potencjału mitochondrialnego
uwolnienie cytochromu C → aktywuje nieodwracalnie enzymy kaspazy
↑ Ca2+ (uciekają z mitochondriów)
utrata asymetrii fosfolipidów w błonie komórkowej
aktywacja kaspaz:
caspases = cysteine-dependent aspartate specific proteases
proteoliza „death substrates” np. PARP
aktywacja endonukleaz odpowiedzialnych za fragmentację DNA
fragmenty (300-50 kB)
fragmenty wielkości nukleosomów (180-200 bp)
aktywacja transglutaminaz
uszkodzenie DNA komórki:
→ aktywacja genu p53
→ produkcja białka p53 (normalnie to białko zatrzymuje komórkę w cyklu = „policjant molekularny = strażnik genomu komórki”)
→ gdy za dużo p53, to komórki zatrzymują się w cyklu, aby móc naprawić DNA, aby go nie powielać → czasem naprawa jest niewykonalna, trzeba zniszczyć złe DNA
→ p53 odpowiada za syntezę białka bax
→ bax wchodzi do mitochondriów
→ tworzą się kanały w błonie mitochondrialnej)
→ ↓ potencjału mitochondrialnego
→ wpływ na istniejące już kanały (dotychczas zamknięte)
→ otwiera się megakanał
→ ucieka Ca2+ i cytochrom C i H2O oraz inne czynniki aktywujące kaspazy
→ proteoliza różnych składników komórki (białek cytoplazmy i jądra) np. polimerazy
bcl-2 (xe) hamuje wejście komórki w apoptozę
Apoptozę mogą wywołać:
zmiany w DNA, ↑p53
napromieniowanie, toksyny, wolne rodniki
otoczenie bez hormonów i czynników wzrostu
czynniki działające na receptory bezpośrednio w błonie komórkowej
cytotoksyczne limfocyty T
wydzielają perforyny, powstają kanały w błonie, tędy granenzym, aktywator kaspaz
Wykrywanie:
cytometr przepływowy
badanie natężenia fluorescencji (wzbudzanie laserem)
szybkość bardzo duża (10 tys. kom/s)
laserowy cytometr skaningowy
komórki na szkiełku podstawowym
Barwniki:
Rh123 (rhodamina)
akumuluje się w mitochondrium (zależy od potencjału: ↑pot. = ↑Rh)
intensywne świecenie
apoptoza: ↓pot. = ↓Rh = ↓świecenie
JC1
akumuluje się w mitochondrium (normalnie zielony)
agregacja - pomarańczowy
apoptoza: nie agreguje, zielony
DiOC6(3)
apoptoza = mniejsza akumulacja
komórki „późnoapoptotyczne” akumulują go więcej (pomarańczowy)
Badanie zawartości DNA w komórkach: histogram
W apotozie endonukleazy, świeżo pocięte DNA wypłukiwane, mniej DNA.
Utrata asymetrii fosfolipidów:
fosfatydyloseryna normalnie tylko w błonie wewnętrznej
w apoptozie na zewnątrz
substancje wykazujące powinowactwo do fosfatydyloseryny to np. anepsyna
anepsyna to fluoresceina: zielone świecenie
Fragmentacja DNA:
oligonekluazy
na żelu charakterystyczny obraz drabiny (w martwicy przypadkowa fragmentacja)
BrdUTP przyłącza się do fragmentów (tam, gdzie pęknięcia)
+ przeciwciała + fluorescencja → widać
Czasami zdarzają się fałszywe komórki apoptotyczne: monocyty fagocytujące ciałka apoptotyczne