Enzymy restrykcyjne są specyficzne sekwencyjnie. Rozpoznają i łączą się do specyficznych sekwencji DNA., np. EcoRI przyłącza się do sekwencji GAATC.

Po tym związaniu następuje trawienie sekwencji w obrębie obydwu bądź jednej nici → produkcja lepkich końców.

Lepkie końce mogą być ponownie połączone przez kolejny enzym nazywany ligazą. Katalizuje reakcję chemiczną łączącą sugar-phosphate bonds :D

Elektroforeza żelowa może być użyta do rozdzielania fragmentów DNA

Elektroforeza używa napięcia elektrycznego do oddzielenia molekuł różnej wielkości w macierzy porowatej (jak gąbka :D). Mniejsze molekuły poruszają się łatwiej przez pory żelu niż większe molekuły.

Żel jest umieszczony w tank'u (aparacie do elektroforezy) wypełnionym buforem elektrodowym (roztworem soli przewodzącym prąd) → ten sam bufor wypełnia również pory żelu. W tanku też są elektrody (druty platynowe), połączone z zasilaczem prądu stałego.`

Używając pipety, próbki DNA są wprowadzane do slotów (studzienek) w żelu agarozowym. Próbki DNA są bezbarwne, ale dodaje się niebieskiego „tracking” DYE. To ułatwia wprowadzenie próbek i wizualne śledzenie migracji DNA.

Konieczne zagęszczenie - any.

Sharp, Sambrook i Saguden wprowadzili użycie barwnika fluorescencyjnego - bromek etydyny - który ma własność wiązania się z DNA - interkaluje między DNA i rozwija helisę o 26°. → po podświetleniu UV mamy różowy majtkowy i widzimy alles :D

W szczególnym wypadku po elektroforezie można zobaczyć obraz.

HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH:

o - znacznik (radioizotop, biotyna, hapten, fluorofor, ligand, białko, enzym) → przyłączony do DNA → sonda hybrydyzacyjna (tu znacznik) → hybrydyzacja i efekt (pozytywny/negatywny)

hapten - substancja drobnocząsteczkowa, która posiada na tyle bogatą strukturę, że można przeciwko niej uzyskać swoiste przeciwciała.

hybrydyzacja polega na tym, że denaturujemy obydwa kwasy nukleinowe a następnie pozwalamy im na fizyczny kontakt → następuje łączenie sondy z docelowym kwasem nukleinowym.

kryterium podziału technik hybrydyzacyjnych zależnie od tego, w jak występuje docelowy kwas nukleinowy:

1. hybrydyzacja w roztworze:

1. wykorzystuje się w doświadczeniach RNAse protection assay → (wysokoczuła metoda detekcji gatunków mRNA) technika pozwalająca na badanie poziomu akumulacji transkryptu,

2. do badania sekwencji powtarzalnych → chodzi o kinetykę reasocjacji (tempo reasocjacji po denaturacji)

2. hybrydyzacja na podłożu stałym [głównie podłożem stałym są błony (pierwotnie mikrocelulozowe, obecnie nylonowe, może też to być odpowiednio przygotowane szkło - technika mikromacierzy)] -

3. podtypy:

1. Southern [Southern blot] - etapy:

2. Northern

3. kolonijna/łysinkowa

4. dot blot

4. hybrydyzacja in situ - w miejscu oryginalnego występowania docelowego materiału genetycznego - w obrębie preparatu mikroskopowego

Southern [Southern blot] - etapy:

1. punkt wyjścia: żel agarozowy z oddzielonymi elektroforetycznie fragmentami DNA (powstałe w wyniku trawienia restrykcyjnego DNA)

2. denaturacja DNA w żelu (przez kąpiel żelu w roztworze alkalicznym → odpowiednio dobrana → żeby nie zhydrolizować, ale zdenaturować)

3. bloting/transfer: przeniesienie fragmentu DNA z żelu na błonę → różne sposoby:
   → kapilarnie - jest tani, b.wydajny i stosowany na co dzień :D - żeby go przeprowadzić trzeba zbudować układ:
   trzeba mieć kuwetę, na niej postawić postument/szybę, na tym bibuła tak, żeby miała kontakt z buforem (działającym stabilizująco na DNA, wysokosolny), który wypełnia kuwetę. Na tą wilgotną bibułę umieszczamy żel, na żelu błonę, na tym bibułę, ręczniki i coś, co dociska cały układ (kawałek szyby/pleksi) → przychodzimy rano :D (bo trzeba czasu) → ręczniki ciągnęły wodę z buforu, więc jakby jest wymuszony przepływ → fragmenty DNA wychodzą z żelu, ale zatrzymują się na żelu → błona jest repliką żelu, bo zostaje zachowany układ.

5. utrwalanie żelu na różne sposoby → utworzenie wiązań kowalencyjnych między błoną i kwasem nukleinowym - i dzięki temu nie da się wyciągnąć tego DNA bez jego hydrolizy

1. cała szopka, bo żele nie wytrzymują forsownego procesu hybrydyzacji → większa wytrzymałość błon.
   → wymuszać transfer przez działanie pola elektrycznego (elektroblot) - raczej do białek w technice Western-blot
   → wymuszać próżniowo

WŁAŚCIWA HYBRYDYZACJA:

1. bierzemy błonę → wkładamy do woreczka foliowego → i do tego bufor hybrydyzacyjny → i kładziemy na wytrząsarkę → i tutaj dochodzi do kontaktu sondy i kwasu nukleinowego (w nocy :D) → potrzeba dużo sondy.

2. błone do butelki, gdzie błona przylega do ściany naczynia → to do pieca hybrydyzacyjnego, gdzie to się obraca → potrzeba bardzo mało sondy.

Po hybrydyzacji tylko niektóre mają przyczepione sondy → miodzio → ETAP DETEKCJI

ETAP DETEKCJI:

• sposób detekcji zależy od tego, czego użyliśmy do znakowania sondy

• gdy to jest radioizotop → autoradiografia → błonę przykładamy do kliszy rentgenowskiej (albo w odpowiedniej kasecie światłoszczelnej) → promieniowanie emitowane przez radioizotop naświetla pewne rejony kliszy → po wywołaniu kliszy obserwujemy wzór uwidocznionych fragmentów DNA.

• gdy hapten → detekcja skomplikowana → DIG-UTP (kompleks) → dodajemy go w miejsce niektórych frakcji nukleotydu → kąpiemy błonę w buforze zawierającym tzw. koniugat przeciwciała haptenowego sprzężonego z enzymem (wiąz. kowalencyjne), którego aktywność możemy łatwo wykryć (koniugaty się kupuje :D) → ostatni etap - powleczenie błony substratem dla tego enzymu → 2 rodzaje substratów:

chromogenne - generują kolor → po enzymie barwny (zazwyczaj ciemno-niebieski) produkt. → detekcja kolorymetryczna

luminogenne - generują światło → po enzymie b. delikatna emisja światła → wykryć można przez kliszę rentgenowską, albo odpowiednio czułą kamerą CCD. → detekcja chemiluminescencyjna (jest czulsza od kolorymetrycznej → może nawet o rząd wielkości)

po powleczeniu tym substratem to enzym działa na ten substrat i przeprowadza reakcję

po doświadczeniu:

• wiemy, że jest efekt

• znamy wielkość fragmentu badanego

• wnioskowanie ilościowe przy hybrydyzacji (technika wymyślona przez p. Southern'a)

Northern od Southern'a różni się DOCELOWYM KWASEM NUKLEINOWYM - BO JEST NIM RNA:

• nie ma restrykcji RNA

• nie ma też denaturacji po rozdziale → elektroforeza w warunkach denaturujących.

• Northern jedną z metod badania ekspresji genów → pozwala na określenie, czy jest i jak duży jest transkrypt.

PCR - Polymerase Chain Reaction → ogromna grupa technik o zasach ogólnych:

1. metoda pozwalająca na powielenie wybranego segmentu DNA (po to, żeby mieć, a czasem znaczenie analityczne → służy wykryciu docelowej sekwencji (w tym znaczeniu podobnie do technik hybrydyzacyjnych)

2. ma składniki mieszaniny reakcyjnej:

1. polimeraza Taq (zazwyczaj) → wytrzymuje inkubacje w wysokich temp. bez utraty aktywności (od bakterii z gorących źródeł - Termus aquaticus) → polimeraza jest katalizatorem w tej reakcji.

2. substraty: dNTPy (N = A, T, G, C) nukleotydy w formie

3. matryca: DNA, które zawiera powielaną sekwencję (w szczególnym przypadku np. całe DNA powielanego genomu)

4. startery (primery) → do rozpoczęcia syntezy nici → determinują amplifikację specyficznego genu

5. bufor (Mg²⁺, stabilizacja itp. → bez Mg²⁺ nie będzie aktywna polimeraza Taq)

3. wszystko łączy się w Eppendorfie

4. do termocyklera → w sposób z góry zaprogramowany steruje zmianami temperatury tej mieszaniny reakcyjnej → na reakcję składają się cykle temperaturowe:

5. W czasie jednego cyklu (klasycznie):

1. ETAP 1: denaturacja (próbka jest podgrzewana do ponad 90°C) → następuje denaturacja DNA matrycowego - separacja nici podwójnej helisy

2. ETAP 2 (annealing): temperatura gwałtownie obniżana (do ok. 50°C) → gwałtownie żeby nie nastąpiła renaturacja, ale żeby w obrębie sekwencji przyłączyły się startery (do komplementarnego miejsca w matrycy) → muszą być spełnione warunki:
   → startery: jeden do jednej nici, drugi do drugiej
   → startery muszą być do siebie skierowane końcami 3'
   → nie więcej niż klika tys. nukleotydów między przyłączonymi starterami

3. ETAP 3: temperatura rośnie do 72°C (optimum temp. polimerazy Taq) → enzym zaczyna wydłużać sekwencję starterów → wydłużanie/synteza na podstawie matrycy

4. powtarzamy cykl - z reguły ~20-50x

6. w każdym cyklu dochodzi do amplifikacji sekwencji otoczonej przez startery → postęp wykładniczy → po PCR tak dużo, że po elektroforezie jesteśmy w stanie obserwować na żelu prążek odpowiadający danej części DNA.

RT-PCR → przepisanie z mRNA na DNA (odwrotna transkrypcja) → otrzymywane DNA jest określane jako cDNA (c = complementar) → reakcja katalizowana przez enzym odwrotnej transkryptazy (oczywiście też startery) → pierwsza nica DNA (którą wykorzystuje się jako matrycę w klasycznym PCR)

---