Wykład 2 - INTERFERENCJA RNA. TERAPIA GENOWA
DNA----> mRNA-----> białko
„Caenthebidils elegans” ---> eksperymenty na nicieniu
jak wprowadzimy jednoniciowy DNA --> kompleks mRNA => tzw. strategia antysensu --> łączą się i już nie ma translacji
Wprowadzenie przypadkowe sekwencji identycznej do mRNA --> a okazało się że jest taki sam efekt (Fira Mello - 1998)
--> to może hamowanie przez dwuniciowy DNA?
gen kodujący UNG - 22 (białko mięśniowe)
wprowadzenie „ antysens” - nie
wprowadzenie „sens” - nie
dwuniciowe DNA -> skuteczniej hamuje ekspresję
mRNA jest wtedy degradowane
„ interferencja DNA”
Po wprowadzeniu dwuniciowego RNA ---> rozpoznane prez DICER(kompleks białkowy) i tnie na ---> siRNA
siRNAs ---> +RISC => kompleks i odchodzi jedna nić---> kompleks znajduje kompleks elementarny ----> i degradacja mRNA
2 kroki:
dwuniciowe RNA + DICER----kinaza---> RdRPolimeraza(RNAzależna od polimerazy polimeraza;)
Wykorzystanie:
do prób terapii genowej
- micro RNAs - endogenne
- siRNA—j.w. - ale egzogennie
próba blokady genów (odpowiedzialnych za nowotwory)
próba blokady wirusów
TERAPIA GENOWA
Problem z nowotworami --> przerzuty (nawet jak mikroprzerzuty) a RTG i chemioterapia różnie skuteczne
Można próbować--- ale w terapii chorób jednogenowych (np. mukowiscydoza)
Chory gen => choroba
Wprowadzenie prawidłowego genu --> wektory wirusowe lub niewirusowe
Wprowadzenie prawidłowego genu ---> zmodyfikowane wirusem - bardziej efektywne i swoiste
adenowirusy
retrowirusy(RNA-wirusy)
HSV, Lentivirus
Wprowadzenie niewirusowe - mniej swoiste, ale bardziej bezpieczne(nie powoduje reakcji zapalnej):
liposomy
elektropolacja
polimery kationowe
mikroiniekcje
Retrowirusy
Genom retrowirusa:
Gen gag - składniki kapsydu, macierzy oraz nukleokapsydu
Gen Pol - odwrotna transkryptaza i integraza
Geny env - białka otoczki wirusa
LTR - Long Terminal Repeats - sekwencje promotorowe
Sekwencje ш - odpowiedzialne za pakowanie materiału genetycznego
Genom wektora:
w miejsce sekwencji wirusowych gag, pol i env - gen wprowadzany do transferu
+ otoczka wirusowa(otrzymywana z tzw. komórek pakujących - retrowirus pozbawiony sekwencji ш)
Retrowirusy - bardzo opłacalne przy wprowadzaniu obcych genów:
Niezdolne do transdukcji komórek niedzielących się (problem choroby OUN)
Problem losowej integracji retrowirusa --> ryzyko aktywacji onkogenów
Pseudotypowanie
zastąpienie produktu genu env białkiem innego wirusa - rozszerzenie zakresu zakażanych komórek
np. białko ludzkiego vesicular stomatitis wirus dla mysiego wirusa białaczki(wektor terapii genowej , nie powoduje chorób)
Lentiwirusy:
Retrowirusy wywołujące choroby niedoboru odporności u człowieka
Mogą infekować komórki niedzielące się
Adenowirusy:
DNA wirusy, bardzo rozpowszechnione
W większości symptomatyczne infekcje
Adenowirusy - genom:
Cztery regiony wczesnej transkrypcji (E1E4) - funkcje regulatorowe
Geny białek strukturalnych
Wektor - mutanty genu E nie ulegają replikacji
Prace nad wycięciem sekwencji E2 i E4
Brak integracji z genomem gospodarza
małe ryzyko aktywacji onkogenu
krótki czas syntezy prawidłowego białka
Herpes wirus:
HIV - neurotropizm - choroby OUN
Podobnie jak adenowirusy niszczą komórkę efektorową - immunizacja
Wektory - mutanty genów kinazy tymidynowej, reduktazy rybonukleazy - niszczenie komórek szybko dzielących się (neo)
Liposomy:
Drobne syntetyczne pęcherzyki lipidowe
Wiążą i kompensują DNA spontanicznie, tworzą kompleksy o wysokim powinowactwie do błon komórkowych
- mniej wydajny transfer niż retrowirusy
- nie wywołują immunizacji
Biobalistyka:
Wystrzelenie światłem lasera ładunku (egzogennego DNA) - mikrokulki z metali szlachetnych opłaszczonych DNA
Elektropolacja:
Krótkotrwałe ładunki elektryczne o wysokim napięciu tworzą pory w błonach komórkowych
Kationowe polimery
duże powinowactwo do błon komórkowych
Mikroiniekcje
Wstrzykiwanie DNA bezpośrednio do jąder za pomocą szklanych mikroigieł
Próby kliniczne:
Choroby jednogenowe
Brak skutecznego leczenia
Możliwość transferu genu do komórek nowotworowych
Rodzinna hipercholesterolemia:
mutacje genu rLDL
pobranie koórek wątrobowych - insercja genu rLDL - iniekcje i.v.
efekt - krótkotrwałe, nieznaczne obniżenie poziomu CHE
Mukowiscydoza:
Mutacje genu CFTR
First cystic fibrosis gene therapy trias were carried out in 1993
Repeat administration of adenoassociated virus to the lung was safe
Nonviral nanoparticles used, for the first time, in the nose of cystic fibrosis patients were also safe and led to partial correctin of the chloride transport defect in nasal epithelium.
terapia genowa dotyczy postaci oddechowej(działa)
inhalacje sprey'ów ze zmodyfikowanymi retrowirusami (duże ilosci zdrowych genów CFTR) --> częściowo hamują objawy kliniczne
po klikunastu tygodniach po inhalacji --> nawroty, bo te zdrowe komórki się starzeją(a to są komórki germinalne) - nowopowstałe nadal mają uszkodzony gen;(
lepsze wyniki - na etapie zarodkowym
SCID - severe combined immunodeficiency syndrome
ADAgen deaminazy adenozyny
14. 09. 1990 - pierwszy transfer genu ADA do limfocytów 4 letniej dziewczynki
Znaczna poprawa podczas terapii nie musiała żyć w warunkach sterylnych
Transfer co kilka tygodni lub miesięcy
Izolacja limfocytów T -> do laboratorium i strzelamy laserem gen ADA--> bardzo dużo razy, żeby częściowo się udało -->hodowanie i namnażanie prawidłowych limfocytów---> podanie i.v.
Transfer ADA (retrowirusy) do komórek szpiku (stem cells)
Długotrwałe efekty
Opublikowano kilka przypadków wyleczeń
Hemofilia
Brak czynnika VIII lub IX
Komórka docelowa: fibroblasty skóry
Ewentualnie przeszczep szpiku
A number of phase 1 clinical trials have been conducted, and, although connection of the bleeding disorder was neither complete nor long-lasting, they do offer hope for a permanent gene therapy cure for the disease
Nowotwory
Melanoma
Modyfikacja komórek neo in vitro i in vivo
Konieczność zainfekowania znacznej ilości komórek guza
Wprowadzamy gen HSVtk (kinaza tymidynowa) do komórek nowotworowych - podanie dożylne zmienionych autologicznych komórek nowotworowych
Podanie Gancykloviru - fosforyzacja przez HSVtk - wbudowanie do DNA - terminacja replikacji
Terapia nowotworów OUN - retrowirus z deaminazą cytozynową (ECCD)
Konwersja obojetej 5fluorozytozyny do 5fluorouracylu
Antisense approach
I generacja - Wprowadzenie genu kodującego sekwencje antysensowną onkogenu(dobrze działa w wirusach HPV!)
II generacja - Complementary RNA sequences such as antisense RNAs and ribozymes to regulate the expression of specific genes. Despite the simplicity of this approach, this technique usually results in only partial suppression of gene expression and, in some instants, even fails to regulate the gene of interest
Strategia antysensu
S - oligomery - co najmniej 15 nuklotydów
Oligonukleotyd wycelowany w transkrypty genu wirusowego koniecznego do namnażania wirusa HIV - ustępowanie brodawek
Oligonukleotydy skierowane przeciw VERF (Vascular Endothelial Growth Factor)
HLA -B7 - gene therapy
iniekcje do guza DNA z HLA - B7 gene - 14 pacjentów - clinical response less than 25%
nie powodujemy nekrozy guza, ale wzmagamy immunizację;)
problem - dostarczenie leczniczego genu do wszystkich komórek guza
- modyfikacja układu immunologicznego
- wprowadzenie genTNF, rIL2
- TIL -Tumor Infiltating Lymphocytes -> limfocyty swoiście naciekające nowotwory --> wyizolowanie TILów, pobrać, zmodyfikować,żeby był np.w czerniaku skuteczny(wprowadzenie genTNF, lub rIL2),
wprowadzamy cytokiny prozapalne - bo ma działać
- TNFα --> działa na naczynia (a guzy naczyniowe), receptor a potem Il podanie ogólne
- Immunoterapia w Poznaniu(czerniaki) -> sIL - 6R(receptor) i Il - 6, ale odpowiedź kliniczna powyżej 25%
Cancer Center in Poznań, Poland a GMTVhas been tested in malignant melanoma patients. For the last 6 years more than 220 patients were enrolled into study of GMTV consisting melanoma cells modified with genes encoding IL6 and its agonistic solube recepetro (sIL6R). More than 25% of objective clinical responses and significant life extension were observed. The encouraging results formed a basis for design of a phase III prospective, randomized clinical study
Intratumoral or peritumoral injection of vectors expressing IFN gamma
Gene modified cancer vaccines (GMTV) modified with genes encoding (i) cytokines or (ii) costimulatory molecules and dendritic cells modified with (iii) genes encoding tumor antigens or (iv) immunostimulatory factors.
TIL -Tumor Infiltating Lymphocytes
Wprowadzony genTNF, rIL2
Since January 1996 in Departament of cancer Immunology USOMS, at Great Poland
Próby kliniczne innych nowotworów
Rak jelita grubego
Nerki
Jajnika
Piersi
Płuc
Wątroby
Prostaty
Chłoniak
Białaczka
4