W 6

Cosmid - DNA bakterii + dNA fagowe

• ułatwia wprowadzenie do komórek obcego DNA

• wektor Ti - plazmid bakteryjny, infekuje rośliny (brodawki korzeniowe) Agrobacterium tymefacieus- może koniugować z E.coli; można robić operacje na E. Coli

• Adenowirus - najczęstszy wektor; wywołuje schorzenia płuc; onkogeniczny; do terapii genowej; leczenie SCIT; nie utrzymuje się samodzielenie zbyt długo w komórkach. VEGF - czynnik wzrostu nabłonka naczyń krwionośnych

• Ligacja DNA - łączenie cząsteczek DNA za pomocą ligazy; łączenie szkieletów DNA, fragmenty zakończone lepkimi końcami

Klonowanie cDNA- DNA komplementarny,synteza. Genów nieciągłych nie ma w bakteriach. Musimy użyć genu bezintronowego by ekspresja genu eukariotycznego mogła zajść w bakterii. Punkt wyjścia do syntezy genu kodującego białko w bakteriach. Kodowanie genu na hormon wzrostu (z przysadki)

RNAcDNA szczepy bakteryjne produkujące hormon

Biblioteka genów - zbiór wektorów z DNA; kolonie bakterii; wiele kopii np. plazmidu

Hybrydyzacja łysinkowa lub kolonijna - 2 łańcuchy DNA chcemy wykryć gen, musimy znać sewencję tego genu; wybieramy fragment i znakujemy; sprawdzamy czy w bakterii znajdzie się DNA hybrydyzujące z sondą molekularną (znacznikiem)

Komplementacja mutacji - odwrócenie mutacji pokarmowej

• hybrydyzacja łysinkowa - fag lambda; nie mamy kolonii ale łysinki (te miejsce gdzie fag się namnożył i wygryzł bakterie) hybrydyzacja DNA z sondąklisza fotograficzna

Jak poznać sekwencje DNA?

• by hybrydyzacja zaszła musi być 20 nukleotydów komplemntarnych

• informacja o sekwencji- znamy sekwencje homologiczne u innych organizmów.sondą jest gen ze spokrewnionego organizmu/

• znamy sekwencję białka to można odtworzyć sekwencję DNA bo kod genetyczny jest zdegenerowany.robimy zbór sond gdzie dodajemy- 2 warianty sond

Hybrydyzacja

Southern blot

• podstawowa technika biologii molekularnej

• E. Southern wymyślił przenoszenie DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy (bibuła)na niej zatrzymuje się DNA a przechodzi rozwtór, w którym to DNA było; filtr kładzie się na żelu bibuła; ciężarek; u dołu bufor zasysany w bibułę i cząsteczki z żelu osadzają się w nitrocelulozie.

• Przykładamy kliszę do filtrów i patrzymy, który DNA hybrydyzuje

Hybrydyzacja northern

• tak samo jak na southern tylko sondą jest DNA a hybrydyzuje RNA

• w jakiej tkance funkcjonuje jakiś gen; izoluje się RNA z różnych tkanek i rozdziela się na żelu; sprawdza się ile tego RNA w tkankach

Hybrydyzacja in situ

• sprawdzić czy komplementarne DNAw postaci hybrydyzacji in situ. Celem takiego doświadczenia jest identyfikacja struktur anatomicznych, w których zachodzi ekspresja określonego genu.

FISH

• fluorescent in situ hybridisation

• w którym miejscu na chromosomie jest dany gen- fluorescencja - sonda

Western blot

• rozdział białek na żelu, a pomocą sondy sprawdzamy gdzie cząsteczka się znajduje; sondą jest przeciwciało, które wiąże się na filtrze

DNA chip

• szkiełko na którym synteza łańcuchów DNA - 60 tys. Łańcuchów synteza oligo - DNA na chipach- hybrydyzacja na wielu genach. Chip wsadzamy do roztworu RNA. RNA wyznakowany fluorescencyjnie; gdzie są hybrydyzujące

Sekwencjonowanie DNA

• na żelach wylewa się go między płyty szklane; nalewa się rozpuszczalny akrylamid elektroforeza na żeluzautomatyzowane sekwencjonowanie

Ukierunkowana mutageneza

• zmienić konkretny gen w konkretny sposób

• enzymy o zmienionych właściwościach

• zamieniamy jedną trójkę nukleotydów na inną, by zmienić aminokwas w białku.

• Sprawdzić ,które sekwencje są konieczne do regulacji

Gene disumption

• mutowanie określonych genów

• jeżeli chcemy by zmutował konkretny gen używamy genu homologicznego do sekwencji ale w środku ma jakiś inny fragment

• podwójne crossing over - marker znajdzie się w środku

• gen zniszczony; ramka odczytu zmieniona

• by ustalić do czego służy dany gen

• knock-out mutacje; do badania chorób

The Yeast Two Hybrid System - czy są białka oddziałujące z jakimś białkiem X

---