Laboratoryjna diagnostyka hematologiczna

dr Julita Kulbacka

Literatura:

A. Dembińska-Kieć, J. W. Naskalski, Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2002, wyd. 2

B. Mariańska, J. Fabijańska-Mitek, J. Windyga, Badania laboratoryjne w hematologii, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2006

F. Kokot, S. Kokot, Badania laboratoryjne - zakres norm i interpretacja, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005

http://www.hematologica.pl/ (atlas hematologiczny)

Rodzaje badań hematologicznych

Podstawowymi badaniami hematologicznymi są:

• Badanie morfologii krwi, z oceną rozmazu krwi obwodowej

• Cytomorfologiczne badanie szpiku

W rozpoznawaniu chorób krwi i układu krwiotwórczego wykorzystuje się wiele innych badań, z których należy wymienić:

• Badania cytochemiczne i cytoenzymatyczne komórek krwi i/lub szpiku,

• Badanie oporności osmotycznej krwinek czerwonych

• Badania układu krzepnięcia i homeostazy

• Badania wysoko specjalistyczne, do których należą:

• określenie immunofenotypu komórek krwi i szpiku, a także nowotworowo zmienionej tkanki,

• ilościowe i jakościowe badania białka monoklonalnego,

• Badania z zakresu innych działów diagnostyki laboratoryjnej, w tym genetyczne, wykonywane metodami biologii molekularnej oraz badanie kariotypu (garnituru chromosomów), badanie histologiczne szpiku pobranego metodą trepanobiopsji oraz histologiczna ocena innego materiału (np. węzła chłonnego)

Pobieranie materiału do badań

• Badania biochemiczne krwi wykonywane są w surowicy lub osoczu uzyskiwanym z zastosowaniem antykoagulantu heparyny, szczawianu lub EDTA (1,5 mg EDTA/ml krwi)

• Krew powinna być pobierana na czczo, w pozycji siedzącej lub leżącej

• Pobrana krew należy dokładnie wymieszać z antykoagulantem i można ją przechowywać do 24 godz., w temp. +4°C

• Rozmaz musi być wykonany do 3 godz. po pobraniu

• Odczyn opadania erytrocytów oznacza się we krwi cytrynianowej, a ich oporność osmotyczna we krwi pobranej na heparynę

• Aby uzyskać surowicę krew należy odwirować po jej całkowitym skrzepnięciu (nie można przechowywać nieodwirowanej krwi w lodówce)

• Krew pobraną na antykoagulant należy odwirować bezpośrednio po pobraniu

Morfologia krwi

Badanie morfologii krwi

Tradycyjne badanie obejmuje oznaczenie:

• Stężenia hemoglobiny w surowicy krwi (Hb),

• Wartości hematokrytu (Ht, Hct),

• Liczby krwinek czerwonych, białych i płytek,

• Wskaźników czerwonokrwinkowych,

• Retykulocytozy,

• Składu odsetkowego krwinek białych,

• Opis krwinek czerwonych, informacje o ewentualnej patologii płytek krwi.

	Kobiety	Mężczyźni
Liczba erytrocytów [x10^12/l]	4.8 ± 0.6	5.4 ± 0.8
Hb [g/l]	140 ± 20	160 ± 20
[mmol/l]	8.69 ± 1.24	9.93 ± 1.24
Ht [l/l]	42.0 ± 5.0	47.0 ± 5.0
SOK [fl]	86 ± 10	86 ± 10
SMH [pg]	29.5 ± 2.5	29.5 ± 2.5
SSH [g/l]	325 ± 25	325 ± 25
Średnica erytrocytów [μm]	6.7 - 7.7	6.7 ± 7.7
Retykulocyty [x10^9/l]	45 - 75	45 - 75
Liczba krwinek białych [x10^9/l]	4 - 10	4 - 10
Liczba płytek krwi [x10^9/l]	150 - 350	150 - 350

Analizatory hematologiczne

Analizatory określają:

• Liczbę krwinek białych (WBC)

• Liczbę krwinek czerwonych (RBC)

• Liczbę płytek krwi (PLT)

• Stężenie hemoglobiny we krwi (HGB)

• Wartość hematokrytu (HCT)

• Wskaźniki czerwonokrwinkowe :

- Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV)

- Średnia masa hemoglobiny w krwince (MCH)

- Średnie stężenie hemoglobiny w krwince (MCHC)

• Wskaźniki zmienności objętości krwinek czerwonych (RDW-SD i RDW-CV)

• Wskaźnik zmienności objętości płytek krwi (PDW)

• Średnią objętość płytki krwi (MPV)

• Odsetek dużych płytek krwi (P-LCR, LP)

Hemoglobina

Stosowane jednostki: g/dl, g/l, mmol/l.

Stężenie Hb
podwyższone	obniżone
nadkrwistości pierwotne	niedokrwistości
odwodnienia	przewodnienia

Hematokryt

Stosowane jednostki: %, l/l

1% Ht = 107 000 erytrocytów w 1μl

1% Ht = 0.34 g Hb/dl

Wartość Hct
zwiększona	zmniejszona
Nadkrwistości pierwotnej (czerwienica prawdziwa) i wtórnej (przewlekłe choroby płuc, przebywanie na dużych wysokościach, nowotwory nerek ze zwiększonym wytwarzaniem erytropoetyny)	Niedokrwistości powodowanej zwiększoną utratą krwi
Nadkrwistości rzekomej (stany zmniejszonej objętości krążącego osocza: choroba oparzeniowa, zapalenie otrzewnej, odwodnienia)	Stanach zwiększonej objętości krążącego osocza
	U kobiet w ciąży

Erytrocyty

Stosowane jednostki: T/l, 10¹²/l, mln/μl

Morfologia: brak jądra, dwuwklęsłe i elastyczne

Rozmiar: 7 - 8 μm

Czas życia: 120 dni

Funkcja: transport tlenu i dwutlenku węgla

3 x RBC = Hb

3 x Hb = Ht

Liczba erytrocytów
podwyższona	obniżona
Nadkrwistości objawowe na skutek: niedotlenienia tkanek(wrodzone i nabyte wady serca, serce płucne, rozedma płuc, tętniaki tętniczo-żylne płuc, przebywanie na znacznych wysokościach)	Niedokrwistości
Zwiększone wytwarzania erytropoetyny (torbielowatość nerek, wodonercze, nowotwory (haemangioblastoma, hepatoma), pheochromocytoma)	Nagła utrata krwi
Działanie kortykosterydów (zespół Cushinga, leczenie sterydami)	U kobiet w ciąży
Nadkrwistość prawdziwa (polycythemia rubra vera)	Przewodnienia
Odwodnienia

Średnia objętość krwinki czerwonej
(MCV)

Stosowane jednostki: fl (10^-15 l), μm³

80-100 fl - krwinka normocytowa

<80 fl - krwinka mikrocytowa

>100 fl - k. makrocytowa




↑ Zaburzenie hipotoniczne, ↓ Zaburzenie hipertoniczne

Średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej
(MCH)

Stosowane jednostki: pg, fmol




Średnie stężenie hemoglobiny
w krwince czerwonej (MCHC)

Stosowane jednostki: g/dl, mmol/l, %




Rozkład objętości krwinek czerwonych (RDW)

Stosowane jednostki: %

Wartości prawidłowe: 11.5-14.5 %

Odczyn Biernackiego

Odczyn opadania krwinek czerwonych (OB, erythrocyte sendimentation rate - ESR) jest szybkością, z jaką opadają krwinki czerwone w osoczu mierzona po 1 i 2 godzinach od momentu pobrania.

OB
Podwyższone	Obniżone
Ostre niedokrwistości	Nadkrwistość
Zaburzenia hormonalne (nadczynność i niedoczynność tarczycy)	Przewlekła niewydolność krążenia
Nowotwory (m.in. w szpiczak mnogi, ziarnica złośliwa)	Hipofibrynogemia
Hiperfibrynogemia
Hipercholsterolemia
Ostre i przewlekłe zakażenia, stany zapalne - po operacjach, po złamaniach kości, po napromienieniu

Retykulocyty

Stosowane jednostki: ‰, Rets x 10⁹/l.

Wartości prawidłowe:

• Względna liczba retykulocytów 5-15 ‰

• Bezwzględna liczba retykulocytów 30-70 Rets x10⁹/l

Liczba Rets
podwyższona	obniżona
Zespoły hemolityczne	Niedokrwistości aplastyczne
Ostre niedotlenienie	Niedokrwistosci hipoplastyczne
Pierwsze dni po masywnej utracie krwi	Nieleczone niedokrwistości z niedoboru wit. B12
Niedokrwistości z niedoboru wit. B12 w 5-9 dni po rozpoczęciu leczenia (wartości przekraczają kilkaset ‰)
Niedokrwistości z niedoboru żelaza w 5-9 dni od rozpoczęcia leczenia

RI (reticulocyte index) - wskaźnik retykulocytów - skorygowany wartością hematokrytu:

RPI (reticulocyte production index) - wskaźnik wytwarzania retykulocytów - jest miarą przyśpieszenia erytropoezy u chorych z niedokrwistościami.

Leukocyty

Stosowane jednostki dla liczby leukocytów: 10⁹/l, tys/μl

Liczba leukocytów wzrasta

W zakażeniach (bakteryjne, pierwotniakowe, grzybicze, wirusowe)

W stanach zapalnych

W chorobach nowotworowych

W przypadku uszkodzeniach tkanek

W hematologicznych zespołach rozrostowych

W mocznicy

W wyniku działania adrenaliny i hormonów sterydowych

Liczba leukocytów spada

W samoistnej aplazji i hipoplazji szpiku kostnego

W uszkodzeniu szpiku kostnego przez środki chemiczne, leki i promieniowanie jonizujące

W hipersplenizmie (pierwotnym i wtórnym)

W niektórych zespołach rozrostowych układu krwiotwórczego (białaczki aleukemiczne, b. włochatokomórkowe, mielofibroza, zespoły mielodysplastyczne, szpiczak plazmocytowy, przerzuty nowotworowe do szpiku kostnego)

W chorobie Addisona-Biermera

Przy ciężkich zakażeniach bakteryjnych (posocznice, zwłaszcza Gram (-), bakteryjne zapalenie wsierdzia, dury i paradury

Przy zakażeniach: wirusowych (grypa, wirusowe zapalenie wątroby, zakażenie HIV, odra, różyczka, ospa wietrzna); pierwotniakowych (malaria, kala-azar); riketsjowych

W czasie wstrząsu anafilaktycznego

W kolagenozach

Po lekach (sulfonamidy i niektóre antybiotyki (chloramfenikol), niesterydowa leki przeciwzapalne, tyreostatyki, leki przeciwpadaczkowe, doustne leki przeciwcukrzycowe)

Objawy diagnostyczne
we wzorze odsetkowym krwinek białych

• Przesunięcie w lewo „odczynowe”

• Przesunięcie w lewo „patologiczne”

• Hiatus leukemicus (przerwa leukemiczna)

• Przesunięcie w prawo

Zaburzenia krwinek białych

• Leukocytoza

• Niezłośliwe zaburzenia fagocytów

• Jakościowe nieprawidłowości fagocytów

• Choroby reaktywne immunocytów

• Nowotwory układu krwiotwórczego

• Złośliwe choroby układu chłonnego

Choroby układu biało krwinkowego

Płytki krwi

PLT - Liczba płytek krwi

MPV - Średnia objętość płytki krwi

Norma
PLT	MPV
150 000 - 400 000/μl 150 - 400 x 10^9/l	7,4-10,4 fl

Żelazo

U dorosłego człowieka, zawartość Fe w ustroju - 3-4 g

(ok. 50 mg/kg u mężczyzn i 35 mg/kg u kobiet).

Stężenie Fe w surowicy 17,9-21,5 μg/100ml (u kobiet jest o ok. 1,78 ·mol/l niższe)

Ocena stanu gospodarki żelazowej:	Badania
Pula czynnościowa	receptor transferynowy, wolna protoporfiryna erytrocytów, MCV, MCH, MCHC, RDW
Pula zapasowa	Ferrytyna, zawartość żelaza w szpiku, zawartość niehemowego żelaza w wątrobie
Pula transportowa	Transferryna, wysycenie transferryny (UIBC), całkowita zdolność wiązania żelaza (TIBC)

Oznaczanie stężenia ferrytyny
w surowicy krwi

Norma 15- 300 g/l

Stężenie ferrytyny w surowicy krwi
Obniżone	Podwyższone
Niedobór Fe w ustroju	Infekcje wirusowe (proliferacja histiocytów)
Niedoczynność tarczycy	Zespoły cytolizy hepatocytów (np. Wirusowe zapalenie wątroby
Niedobór wit. C	Zespoły zapalne
	Nowotwory
	Nadczynność tarczycy
	AIDS
	Nadmiar Fe w organizmie

Oznaczanie stężenia żelaza w surowicy krwi

Norma 10- 30 mol/l; 50-150 mg/dl (mg% lub mg/100 ml)

Stężenie Fe
Spadek	Wzrost
Zmniejszone wchłanianie	Niedokrwistość hemolityczna
Zwiększona utrata	Niedokrwistość aplastyczna
Zwiększone zapotrzebowanie	Zespół mielodysplastyczny
Przyczyny nieznane	Nadmierna podaż Fe
	Ostre uszkodzenie hepatocytów (np. w zapaleniu wątroby typu B)

Oznaczanie całkowitej zdolności wiązania żelaza (TIBC)

Norma TIBC = 45 - 75 μmol/l (250 - 400 mg/dl)

Żelazo

Inne badania:

• Utajona zdolność wiązania żelaza (UIBC)

• Test doustnego obciążenia żelazem (test wchłaniania, krzywa żelazowa)

• Oznaczenie wolnej protoporfiryny w erytrocycie

• Oznaczanie odsetka syderoblastów w szpiku kostnym

• Oznaczanie stężenia wolnych receptorów dla transferryny

• Oznaczanie stężenia żelaza w moczu

Niedokrwistości

Objawy wspólne dla niedokrwistości

(Dembińska Kieć

Niedokrwistości

• Niedokrwistość sideropeniczna - brak Fe

• Niedokrwistości makrocytowe - zwiększone MCV

• Niedokrwistość hemolityczna - skrócony czas życia erytrocytów

• Niedokrwistość aplastyczna

• Niedokrwistości chorób przewlekłych

• Niedokrwistość syderoblastyczna - obecność związków Fe w mitochondriach erytroblastów

• Niedokrwistości wrodzone - nieprawidłowości wewnątrzkomórkowe

Pozostałe zaburzenia

• Nadkrwistości (czerwienica) - wzrost liczby krwinek czerwonych ponad normę

• Porfirie - zwiększone tworzenie, gromadzenie i wydalanie porfiryn

• Hemochromatoza - odkładanie Fe w tkankach

Inne choroby krwi

• MALARIA - wywołana przez pierwotniaki (PLASMODIUM infekuje i niszczy erytrocyty)

• CHOROBY WIRUSOWE -AIDS (wirus HIV infekuje i niszczy limfocyty CD-4 zwane także T4 lub pomocniczo-indukcyjnymi)

Badania cytoenzymatyczne

• Określanie aktywności peroksydazowej (POX)

• Badania aktywności esterazy nieswoistej α-naftylu

• Badanie aktywności esterazy swoistej

• Oznaczanie aktywności fozfatazy kwaśnej

• Badanie aktywności fozfatazy alkalicznej graulocytów (FAG)

• Badanie aktywności końcowej transferazy dezoksynukleotydowej (TdT)




• Wzrost aktywności FAG

• U kobiet w ciąży

• W okresie okołoporodowym

• Aplazja szpiku

• Czerwienica prawdziwa

• Odczyn białaczkowy

• Nowotwory złośliwe

• Zakażenia ostre i przewlekłe (bez wirusowych)

• Spadek aktywności FAG

• Przewlekła białaczka szpikowa

• Nocna napadowa hemoglobinuria

• U osób narażonych na działanie benzenu i promieniowania jonizującego




Cytometria przepływowa

• Cytometria przepływowa to metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy.

• FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting) rozszerzona metoda cytometrii przepływowej, w której oprócz pomiarów komórek są stosowane również urządzenia sortujące.

Analiza wyników

Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów:

• jednowymiarowe (histogram),

• dwuwymiarowe (kropkowy, gęstości, konturowy),

• wykresy trójwymiarowe (perspektywiczny).

Zalety cytometrii przepływowej

• W zależności, od jakości cytometru można zbadać koekspresję nawet czterech antygenów, co nie jest możliwe w żadnej innej metodzie

• Analizowanie bardzo licznych populacji obiektów w krótkim czasie, oraz wysoka dokładność i minimalny rozrzut wyników

• W ciągu kilku sekund można z niezwykłą dokładnością i powtarzalnością wykryć rzadko występujące i nietypowe subpopulacje komórek

• Jest nieinwazyjnym (tzn. nienaruszającym integralności komórkowej) narzędziem badawczym w wieloparametrowej ocenie struktury i funkcji komórek.

• Daje możliwość oznaczenia ploidii w komórkach o określonym fenotypie

Parametry mierzalne w CP




Badania cytogenetyczne w hematologii

Ocena wyglądu i liczby chromosomów uzyskanych z jąder komórkowych hodowli komórek.

Do badania cytogenetycznego pobiera się:

• jądrzaste komórki krwi - tj. limfocyty (do badania nie można użyć np. erytrocytów, które nie posiadają jąder komórkowych)

• komórki szpiku kostnego

Badania molekularne w hematologii

Materiał do badań: DNA i RNA

Do oceny komórek na poziomie molekularnym wykorzystywane są głownie 4 techniki:

• Analiza Southern Blot

• Analiza Northern Blot

• Hybrydyzacja in situ (FISH)

• Reakcja polimerazy łańcuchowej (PCR)

Przypadki

p.1

24-letnia studentka zgłosiła się od lekarza z powodu nadmiernego męczenia się. Mieszkała w domu studenckim, bez kuchni i od dłuższego czasu nie jadała regularnych posiłków. W badaniu fizykalnym nie stwierdzono odchyleń od stanu prawidłowego. Pacjentka miesiączkowała prawidłowo bez obfitych krwawień. W badaniu morfologii krwi stwierdzono:

WBC 7.8 x 109/l

RBC 4.71 x 1012/l

Hb 10.3 g/dl

Ht 33%

Płytki 384 x 109/l

Niedokrwistość niedoborowa ?

Wyznaczamy parametry czerwonokrwinkowe

MCV 70 fl

MCH 21.9 pg

MCHC 31.2 g/dl

RDW 16.5 %

W badaniu mikroskopowym rozmazu barwionego krwi stwierdzono obecność znacznej anizocytozy z dużą ilością mikrocytów i umiarkowaną hypochromią.

Żelazo w surowicy 14 ၭg/dl (norma 50-150 ၭg/dl )

TIBC 375 ၭg/dl (norma 250-450 ၭg/dl )

Wysycenie transferryny 4% (norma 20-55 %)

Ferrytyna w surowicy 0 (norma 30-250 ၭg/dl )

p.2.

25-letni mężczyzna, pracownik zakładów chemicznych, został przyjęty do szpitala z powodu wysokiej temperatury, której towarzyszyły liczne zmiany ropne w tkance podskórnej. W badaniu fizykalnym nie stwierdzono powiększenia wątroby, śledziony ani węzłów chłonnych. Badanie kontrolne krwi obwodowej sprzed 6 miesięcy było prawidłowe, natomiast badania w dniu przyjęcia do szpitala następujące:

WBC 1.8 x109/l

RBC 3.07 x1012/l

Hb 9.0 g/dl

Ht 27 fl

Płytki 19 x 109/l

MCV 88 fl

MCH 29 pg

MCHC 33 g/dl

RDW 13.5%

Wyniki rozmazu

Neutrofile 5%

Limfocyty 94%

Monocyty 1%

Retykulocyty 2‰

Nie znaleziono niedojrzałych komórek układu białokrwinkowego

Wyniki biopsji

Szpik ubogogrudkowy i ubogokomórkowy

Obecność nielicznych limfocytów, plazmocytów i komórek podścieliska




15 | Hematologia laboratoryjna










---