PN Mleko i przetwory mleczarskie - Badania mikrobiologiczne ogólne zasady


POLSKA NORMA

PN-93

Mleko i przetwory mleczarskie

A-86034/02

Badania mikrobiologiczne

Ogólne zasady badań

Zamiast PN-77/A-8603111

Grupa katalogowa 1219

PN-93/A-86034/02 neq ISO 7218:1985

1. WSTĘP

Przedmiotem arkusza normy są ogólne zasady badań mikrobiologicznych mleka i przetworów mleczarskich w zakresie:

2. LABORATORIA I ICH WYPOSAŻENIE

2.1. Laboratoria

2.1.1. Pomieszczenia do badań. Zaleca się wydzielenie oddzielnych pomieszczeń do:

11 W zakresie p. 3.19, 3.27 oraz załącznika 1 i załącznika 2.

2.1.2. Stanowisko pracy. Powierzchnia pracy na 1 pracownika powinna wynosić około 20 m2 łącznie z pomieszczeniem do ważenia, wirowania, inkubacji i zamrażania.

Miejsce pracy powinno być dobrze oświetlone, lecz zabezpieczone przed bezpośrednim nasłonecznieniem. Oświetlenie stanowiska pracy powinno wynosić 1200 Lx (symulowane światło dzienne), a laboratorium 500 Lx na wysokości 1 m od podłogi.

2.1.3. Utrzymanie czystości i aseptyki w laboratorium. Urządzenie laboratorium powinno zapewniać łatwe utrzymanie czystości i porządku. Zaleca się:

Pomieszczenie do badań należy wyposażyć w:

Prawidłowość działania lamp UV i stołów z laminar­nym przepływem powietrza należy okresowo kontrolo­wać przez ocenę zanieczyszczeń mikrobiologicznych powietrza. Ocenę przeprowadzać za pomocą specjalne­go wyposażenia do pobierania próbek i badania powie­trza (np. selektywny aerobioskop) lub metodą sedymen­tacyjną wg załącznika 1.

PN-93/A-86034/02

2.2. Wyposażenie

2.2.1. Cieplarki. Zaleca się stosowanie cieplarek z płaszczem wodnym, dobrze izolowanych cieplarek powietrznych lub specjalnych kabin. Temperatura wewnątrz ciepłarek powinna być stała. Temperaturę kontrolować termometrem umieszczonym w butelce z glicerolem. Dla ujednolicenia temperatury, duże ciep­larki powinny być wyposażone w kilka termometrów i ewentualnie w urządzenia wymuszające cyrkulację powietrza.

Temperatura otoczenia powinna być zawsze niższa niż w cieplarce, a do inkubacji w niskich temperaturach należy stosować cieplarki wyposażone w urządzenia chłodnicze.

W badaniach mleka i przetworów mleczarskich naj­częściej stosuje się następujące temperatury inkubacji: 21, 30, 37, 42 i 55°C.

2.2.2. Łaźnie wodne powinny być wyposażone w urządzenia do automatycznej regulacji temperatury, pompę cyrkulacyjną i dokładny termometr. Do wypeł­niania łaźni stosować wodę destylowaną lub demineralizowaną, którą należy często wymieniać lub pastery­zować przez ogrzanie do temperatury 90°C i przetrzy­manie w tych warunkach przez 30 min.

Probówki i butelki z hodowlą drobnoustrojów należy zanurzać tak, aby poziom płynu znajdował się poniżej poziomu wody w łaźni. Dla uniknięcia infekcji należy stosować korki nie pochłaniające wilgoci.

2.2.3. Aparaty do sterylizacji

  1. Autoklaw do sterylizacji w nasyconej parze wod­nej wyposażony w manometr i termometr oraz filtr za­pobiegający zanieczyszczeniu z powietrza podczas su­szenia po sterylizacji. Autoklaw powinien umożliwiać uzyskanie temperatury, co najmniej 12ł°C.

  2. Suszarka do sterylizacji w suchym, gorącym po­wietrzu, najkorzystniej z cyrkulacją powietrza umożli­wiającą uzyskanie temperatury 160 -r- 175°C.

2.2.4. Sprzęt do przechowywania próbek i materiału biologicznego

  1. Chłodziarki umożliwiające utrzymanie temperatu­ry w zakresie 0 -r 5°C.

  2. Zamrażarki o temperaturze co najmniej -20°C do przechowywania próbek i o temperaturze -45°C do przechowywania mrożonych szczepionek mleczarskich.

2.2.5. Aparaty do rozdrabniania i mieszania próbek

  1. Młynek do mielenia kazeiny z kubkiem metalo­wym wyjaławianym 72% (V/V) roztworem alkoholu etylowego.

  2. Mieszalnik obrotowy (homogenizator) z regulo­waną szybkością obrotów w zakresie 8000-:-45000 obr/min, wyposażony w pojemniki metalowe lub szklane odporne na temperaturę sterylizacji. Pojemność pojemników powinna być 2 -i- 3-krotnie większa od objętości mieszanych płynów.

  3. Mieszalnik typu perystaltycznego (stomacher) ze sterylnymi woreczkami polietylenowymi. Pojemność woreczków polietylenowych powinna być około 4 -j-5-krotnie większa od objętości mieszanych płynów.

  4. Mikrowstrząsarka (micro-shaker, mikser Vortex itp.) umożliwiająca taką intensywność mieszania, aby płyn w probówce podnosił się na wysokość 2-3 cm od górnej krawędzi probówki.

2.2.6. Inne aparaty pomocnicze

  1. Mikroskop optyczny wyposażony w obiektywy powiększające 10, 20, 40, 60 i 100-krotnie i okulary po­większające 10-krotnie.

  2. Waga o odpowiednim zakresie i dokładności wy­noszącej ±1% ważonej masy netto.

  3. Pehametr o dokładności ±0,1 jednostek pH z kompensacją temperatury

  4. Suszarka próżniowa lub eksykator z manometrem | do badania szczelności puszek.

  5. Pompa olejowa do redukcji ciśnienia w suszarce| próżniowej.

  6. Filtry bakteriologiczne do wyjaławiania niektó­rych komponentów pożywek np. sączki membranowej z estrów celulozy średnicy por 0,45 µm ze specjalną oprawką.

  7. Liczarka kolonii wyposażona w lupę i ewentualnie" automatyczny licznik.

  8. Lupy powiększające 2 -i- 10 razy.

2.2.7. Szkło

  1. Butelki lub kolbki pojemności 100, 200, 2501 i 500 ml.

  2. Probówki bakteriologiczne o wymiarach 8 x 100 mm; 16 x 160 mm; 18 x 180 mm; 20 x 200 mm i probówki Dürhama

  3. Płytki Petriego średnicy 90 i 150 mm

  4. Pipety bakteriologiczne pojemności 1 ml najkorzystniej z wpływem średnicy 1,75-:-3 mm oraz pipety skalowane pojemności 10 ml z wyraźnie zaznaczona skalą kontrastującą z ich zawartością. Nie należy używać pipet z utłuczonymi czubkami.

  5. Pipety automatyczne z wymiennymi końcówkami jednorazowego użytku.

  6. Strzykawki automatyczne do rozlewania rozcieńczalników i płynnych pożywek.

  7. Naczyńka wagowe.

  8. Szkiełka zegarkowe średnicy około 6 cm.

  9. Pręciki szklane proste oraz specjalnie wygięte do posiewów powierzchniowych pałeczki Drigalskiego

  10. Perełki szklane.

    1. Moździerz porcelanowy z wylewem oraz tłuczek

  1. m) Cylindry pomiarowe

  2. n) Szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe.

2.2.8. Drobny sprzęt

  1. Skalpel lub nóż.

  2. Przyrządy do otwierania konserw.

  3. Świdry metalowe do pobierania próbek.

  4. Nożyczki.

  5. Łyżki lub łopatki metalowe.

  6. Korki gumowe różnych rozmiarów.

  7. Papier pergaminowy lub folia aluminiowa,.

  8. Bibuła do sączenia.

  9. Papierki wskaźnikowa „dysperwod".

  10. Wata.

  11. Pojemniki metalowe do sterylizacji płytek Petriego i pipet.

  12. Oczko bakteriologiczne (eza)

  13. Palnik gazowy lub spirytusowy

POLSKA NORMA

PN-93

Mleko i przetwory mleczarskie Badania mikrobiologiczne Ogólna liczba drobnoustrojów — oznaczanie metodą płytkową w temperaturze 30° C

A-86034/04

Zamiast PN-77/A-86031"

Grupa katalogowa 1219

PN-93/A-86034/04 eqv ISO 6610:1992

1. WSTĘP

1.1. Przedmiot normy. Przedmiotem arkusza normy jest oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów metodą płytkową w mleku i przetworach mleczarskich.

1.2. Określenia. Drobnoustroje są to bakterie, droż­dże i pleśnie tworzące policzalne kolonie w warunkach określonych metodą oznaczania.

2. METODA BADANIA

2.1. Zasada oznaczania polega na posiewie określo­nej ilości próbki i jej dziesiętnych rozcieńczeń do 2 równoległych płytek Petriego, wlaniu do płytek okreś­lonej pożywki agarowej, inkubacji w temperaturze 30°C przez 72 h w warunkach tlenowych, policzeniu kolonii i obliczeniu liczby drobnoustrojów w 1 ml lub1 g próbki.

2.2. Aparatura i sprzęt

  1. Cieplarka o temperaturze 30 ±1°C.

  2. Łaźnia wodna o temperaturze 45 + 1°C.

  3. Aparat do liczenia kolonii.

  4. Pehametr.

  5. Płytki Petriego średnicy 90 mm.

  6. Probówki bakteriologiczne o wymiarach 16 x 160 mm, 20 x 200 mm.

  7. Butelki pojemności 150 -:- 250 ml.

  8. Pipety pojemności 1 i 10 ml.

Przygotowanie aparatury i sprzętu - wg PN-93/A-86034/02.

2.3. Rozcieńczalniki — wg PN-93/A-86034/03.

2.4. Pożywki

2.4.1. Pożywka do oznaczania ogólnej liczby drobno­ustrojów

Pepton trypton 5,0 g.

Ekstrakt drożdżowy 2,5 g.

Glukoza 1,0 g.

Mleko w proszku odtłuszczone wolne

od substancji hamujących 1,0 g.

Agar 10+15 g.

Woda destylowana 1000 ml.

Składniki rozpuścić w wodzie w następującej kolej­ności: ekstrakt drożdżowy, pepton, glukoza i mleko w proszku. W razie potrzeby podgrzać. Dodać agar i ogrzewać w bieżącej parze wodnej przez 30 min lub doprowadzić do wrzenia. W razie potrzeby przesączyć na gorąco przez sączek z waty lub bibuły. Ustalić pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 7,0 +0,1 w temperatu­rze 25°C. Rozlać do probówek po 12-M5 ml lub do butelek w ilościach nie większych niż 150 ml. Wyjała­wiać w temperaturze 121 +1°C przez 15 min. Używać bezpośrednio po wyjałowieniu lub przechowywać bez dostępu światła w temperaturze 0+5°C nie dłużej niż 1 miesiąc w warunkach zabezpieczających przed zmiana­mi ilościowymi i jakościowymi.

Jeżeli pożywkę przygotowuje się z podłoża handlo­wego nie zawierającego w swoim składzie mleka

w proszku, to składnik ten należy dodać w ilości 1,0 g/l.

2.4.2. Agar wodny

Agar 10+15 g.

Woda 1000 ml.

składzie mleka dodać w ilości

PN-93/A-86034/04

Agar rozpuścić w wodzie przez ogrzewanie. Ustalić pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 7,0 ±0,2 w tempe­raturze 25°C. Rozlać do probówek po 4 ml lub do butelek w ilościach nie większych niż 150 ml. Wyjała­wiać w temperaturze 121 ±1°C przez 15 min.

2.5. Przygotowywanie próbek i rozcieńczeń - wg PN-93/A-86034/03.

2.6. Wykonanie oznaczania

2.6.1. Posiew i inkubacja. Z próbki i jej rozcieńczeń wykonać posiew wgłębny, do co najmniej 2 płytek Petriego wg PN-93/A-86034/02. Posiewać tyle kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych, aby w co najmniej jednym posiewie uzyskać liczbę kolonii na płytce w granicach KH-300.

Do każdej płytki Petriego przenieść 1 ml próbki lub jej rozcieńczeń, a następnie wlać po 12-:-15 ml pożywki wg 2.4.1 schłodzonej do temperatury 45 ±1°C. Dokład­nie wymieszać i pozostawić do zestalenia. Czas od wykonania pierwszego rozcieńczenia do zmieszania rozcieńczeń z pożywką nie powinien być dłuższy niż 15 min.

W przypadku, gdy badany produkt jest zanieczysz­czony drobnoustrojami tworzącymi na powierzchni po­dłoża kolonie rozlewające się, co utrudnia liczenie, można na zestalone podłoże odżywcze wlać około 4 ml upłynnionego i schłodzonego do temperatury 45 ±1°C agaru wodnego wg. 2.4.2 i pozostawić do zestalenia. Czynność tę należy odnotować w dokumentacji analiz. Odwrócone płytki inkubować w temperaturze 30 +1°C przez 72 ±3h.

Równocześnie wykonać próby kontrolne z samą po­żywką oraz z pożywką zaszczepioną stosowanym roz­cieńczalnikiem.

2.6.2. Odczytanie i obliczanie wyniku. Po inkubacji policzyć wszystkie kolonie na płytkach Petriego, na których liczba kolonii mieści się w granicach 10-:-300. Kolonie smugowe liczyć wg PN-93/A-86034/02. Wyni­ki obliczać w sposób następujący.

  1. Liczba kolonii na płytkach w granicach 10-:-300. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 ml lub 1 g próbki obliczyć wg wzoru w którym:

L = C/(N1+0,1•N2) •d

C — suma kolonii na wszystkich płytkach wybra­nych do liczenia,

N\ — liczba płytek z pierwszego liczonego rozcień­czenia,

N2 — liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńcze­nia,

d — wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pier­wszemu (najniższemu) liczonemu rozcieńcze­niu.

Obliczoną wg wzoru liczbę zaokrąglić do dwóch znaczących cyfr. Wynik przedstawić jako liczby pomię­dzy 1,0 a 9,9 pomnożone przez 10x, gdzie x oznacza odpowiednią potęgę.

  1. Liczba kolonii na płytkach mniejsza niż 10. Jeżeli z posiewu bezpośredniego produktu płynnegolub z posiewu pierwszego rozcieńczenia innych produk­tów (odważanych) uzyskano liczbę kolonii mniejszą niż 10, wynik podać w sposób następujący:

  1. Liczba kolonii na płytkach większa niż 300.

Jeżeli z największego posianego rozcieńczenia (naj­mniejsza koncentracja próbki) uzyskano tylko płytki z liczbą powyżej 300 kolonii, to wynik podać jako przybliżony:

POLSKA NORMA

PN-93

Mleko i przetwory mleczarskie Badania mikrobiologiczne Pleśnie i drożdże — oznaczanie liczby metodą płytkową w temperaturze 25 C

A-86034/07

Zamiast PN-77/A-8603111

Grupa katalogowa 1219

PN-93/A-86034/07 (eqv ISO 6611:1992)

1. WSTĘP

1.1. Przedmiot normy. Przedmiotem niniejszego arkusza normy jest oznaczanie liczby pleśni i drożdży metodą płytkową w mleku i przetworach mleczarskich.

1.2. Określenia. Pleśnie i drożdże są to mikroorga­nizmy, tworzące charakterystyczne kolonie w selektyw­nych pożywkach w warunkach określonych metodą oznaczania.

2. METODA BADANIA

2.1. Zasada oznaczania polega na posiewie określonej ilości próbki i jej dziesiętnych rozcieńczeń do dwóch równoległych płytek Petriego, wlaniu do płytek selek­tywnej pożywki agarowej, inkubacji w temperaturze 25°C przez 5 dni w warunkach tlenowych, policzeniu charakterystycznych kolonii i obliczeniu liczby pleśni i drożdży w 1 ml lub w 1 g próbki.

2.2. Aparatura i sprzęt

a) Cieplarka o temperaturze 25 ±1°C.

b) Łaźnia wodna o temperaturze 45 +1°C.

c) Pehametr.

d) Płytki Petriego średnicy 90 mm.

e) Probówki bakteriologiczne o wymiarach 16 x 160 mm, 20 x 200 mm.

f) Butelki pojemności 150 -:- 250 ml.

g) Pipety pojemności 1 i 10 ml.

Przygotowanie aparatury i sprzętu — wg PN-93/A-86034/02.

2.3. Rozcieńczalniki — wg PN-93/A-86034/03.

2.4. Pożywki (do wyboru).

2.4.1. Pożywka selektywna z oksytetracykliną

  1. Pożywka podstawowa

Ekstrakt drożdżowy 5,0 g.

Glukoza 20,0 g.

Agar 10-:-15 g.

Woda 900 ml.

Składniki lub kompletne podłoże handlowe rozpuścić w wodzie. Ogrzewać do całkowitego rozpuszczenia się agaru. Ustalić pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,6 +0,1 w temperaturze 25°C. Rozlać do butelek po 90 ml. Sterylizować w temperaturze 121 ±1°C przez 15 min.

  1. Roztwór oksytetracykliny Chlorowodorek oksytetracykliny

(C22H30N2O„) • HCL 50 mg.

Woda 50 ml.

Składnik rozpuścić w wodzie. Wyjaławiać przez fil­trację lub przygotować z zachowaniem warunków jało-wości. Przygotowywać w dniu użycia pożywki.

  1. Pożywka kompletna

Pożywka podstawowa 90 ml.

Roztwór oksytetracykliny 10 ml.

Upłynnioną pożywkę podstawową schłodzić do tem­peratury 45 +1°C, następnie zachowując warunki jałowości dodać roztwór oksytetracykliny ogrzany do tem­peratury 45 +1°C i wymieszać. Nie upłynniać ponow­nie.

2.4.2. Pożywka selektywna z chloramfenikolem

Ekstrakt drożdżowy 5,0 g.

Glukoza 20,0 g.

Chloramfenikol (CnHi2Cl2N2O5) 0,1 g/l (Do uzyskania koncentracji 100 /µg/ml pożywki.)

Agar 12 -:- 15

Woda 1000 ml.

Składniki rozpuścić w wodzie. Ogrzewać do całkowi­tego rozpuszczenia się agaru. Ustalić pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,6 +0,1 w temperaturze 25°C. Rozlać do butelek w ilości nie przekraczającej 100 + 150 ml. Sterylizować w temperaturze 121 +1°C przez 15 min.

2.5. Przygotowywanie próbek i rozcieńczeń - wg

PN-93/A-86034/03.

2.6. Wykonanie oznaczania

2.6.1. Posiew i inkubacja. Z próbki i jej rozcieńczeń

Wykonać posiew wgłębny wg PN-93/A-86034/02 do co najmniej dwóch płytek Petriego. Posiewać tyle kolej­nych rozcieńczeń, aby w co najmniej jednym posiewie uzyskać liczbę kolonii na płytce w granicach 10 -r 150.

Do każdej płytki Petriego przenieść 1 ml próbki lub jej rozcieńczeń, a następnie dodać po 12 4- 15 ml po­żywki wg 2.4.1 lub 2.4.2 upłynnionej i schłodzonej do temperatury 45 +1°C. Dokładnie wymieszać i pozosta­wić do zestalenia. Czas od wykonania pierwszego roz­cieńczenia do zmieszania rozcieńczeń z pożywką nie powinien być dłuższy niż 15 min.

Zaleca się zalanie zestalonej pożywki cienką warstwą (4 ml) pożywki do oznaczania drożdży i pleśni lub aga­ru wodnego wg PN-93/A-86034/04.

Równocześnie wykonać próbę kontrolną z samą po­żywką i pożywką zaszczepioną stosowanym rozcień­czalnikiem.

Odwrócone płytki inkubować w temperaturze 25 ±1°C przez 5 dni.

2.6.2. Odczytanie i obliczanie wyniku. Po inkubacji policzyć wszystkie kolonie na płytkach Petriego, na których liczba kolonii mieści się w granicach 10-:-150.

Drożdże najczęściej tworzą kolonie błyszczące o róż­norodnej barwie, np. białej, białokremowej, czasami czerwonej lub żółtej o konsystencji kremu, czasami ślu­zowatej.

Pleśnie tworzą kolonie o wyglądzie meszku lub splą­tanych nitek o różnorodnej barwie, np. białej, żółtej, oliwkowej, zielonkawej, niebieskiej lub czarnej. Struk­tura kolonii jest luźna, czasami zwarta lub śluzowata. Jeżeli znaczna część płytki przerośnięta jest pleśniami i trudno policzyć poszczególne kolonie, to wówczas na­leży liczyć rozcieńczenie ze wzrostem poniżej 10 kolonii na płytce i wynik interpretować wg poz. b).

W przypadkach wątpliwych (na pożywce sporadycz­nie mogą rosnąć bakterie w postaci drobnych kolonii) należy przeprowadzić badania mikroskopowe wg PN-93/A-86034/02, badając co najmniej √n kolonii, gdzie n - oznacza liczbę policzonych kolonii.

Badania mikroskopowe mogą być również pomocne do oddzielnego liczenia drożdży i pleśni.

Liczbę drożdży i pleśni w 1 rnl lub 1 g próbki obj czyć w następujący sposób:

  1. Liczba kolonii na płytkach w granicach 10 -:-150.

Liczbę drożdży i pleśni (L) w 1 ml lub 1 g próbki obliczyć wg wzoru

L = C / (Ni + 0,1 N2) * d

w którym:

C — suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia,

N1 — liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia,

N2 — liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia,

d — wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu rozcieńczeniu.

Obliczoną wg wzoru liczbę zaokrąglić do dwóch znaczących cyfr. Wynik przedstawić jako liczby między 1,0 a 9,9 pomnożone przez 10", gdzie x - oznacza odpowiednią potęgę.

  1. Liczba kolonii na płytkach mniejsza niż 10.

Jeżeli z posiewu bezpośredniego produktu płynnego lub z posiewu pierwszego rozcieńczenia innych produktów (odważanych) uzyskano liczbę kolonii mniejszą m 10, wynik podać w następujący sposób:

  1. Liczba kolonii na płytkach większa niż 150. I Jeżeli z największego posianego rozcieńczenia (najmniejsza koncentracja próbki) uzyskano tylko płytki z liczbą powyżej 150 kolonii, to wynik podać jako przybliżony:

Mikrobiologia - Ogólne zasady oznaczania liczby bakterii z grupy coli - Metoda płytkowa

1 Zakres normy

W niniejszej normie międzynarodowej podano ogólne zasady oznaczania bakterii z grupy coli, występujących w żywności i w paszach, metodą liczenia kolonii na stałej pożywce agarowej, po inkubacji w 30 °C, 35 °C lub 37 DC; wybór temperatury jest przedmiotem umowy między za­interesowanymi stronami.

UWAGA 1 Temperatura inkubacji 30 °C jest stosowana w przypadku, gdy celem oznaczeń są względy technologiczne; temperatury 35 °C lub 37 °C są stosowane, gdy celem ozna­czeń są względy zdrowotne.

2 Normy powołane

Wymienione niżej normy zawierają postanowienia, które - poprzez określone powołanie się (na daną normę) w treści niniejszej normy międzynarodowej - stają się również postanowieniami niniejszej normy. W momen­cie publikacji niniejszej normy międzynarodowej, poda­ne niżej wydania norm były aktualne. Ponieważ jednak wszystkie normy podlegają nowelizacji, strony zawiera­jące umowy na podstawie niniejszej normy ISO zachęca się do zbadania możliwości zastosowania najnowszych wydań wymienionych niżej norm. Rejestry aktualnych norm międzynarodowych prowadzą wszyscy członkowie IEC i ISO.

ISO 6887:1983, Microbiology - General quidance for the preparation of ditutions for microbiological examination N2).

ISO 7218:1985, Microbiology - General quidance for mi­crobiological examinations N3).

3 Definicja

Dla celów niniejszej normy międzynarodowej przyjęto następującą definicję:

Bakterie z grupy coli: Bakterie, które w określonej tem­peraturze (np. 30 °C, 35 °C lub 37 °C, zgodnie z ustale­niami) tworzą charakterystyczne kolonie na stałej pożyw­ce z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i laktozą w warunkach określonych w niniejszej normie międzynarodowej.

4. Zasada metody

4.1. Posiew na dwie płytki, metodą zalewową, stosuj określona,, stałą pożywkę selektywną oraz określa ilość bakterii próbki (produktu płynnego) lub zawieś wyjściowej (w przypadku innych produktów).

Przygotowanie, w takich samych warunkach, następnych par płytek do posiewu dalszych dziesięciokrotnych rozcieńczeń metodą zalewową.

4.2 Inkubacja płytek w 30 °C, 35 °C lub 37 °C (zgodnie z ustaleniami) przez 24 h.

4.3 Obliczanie liczby bakterii z grupy coli w mililitrze gramie próbki na podstawie liczby charakterystycznych kolonii (wg 10.1).

5 Pożywka i płyn do rozcieńczeń

5.1 Zasady ogólne

Zasady postępowania laboratoryjnego według ISO 7218.

5.2 Płyn do rozcieńczeń

Według ISO 6887 i określonej normy międzynarodowej dotyczącej badanego produktu.

5.3 Stała pożywka selektywna: agar z fiolet krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią

i laktozą (VRBL)

Skład

pepton

7g

ekstrakt drożdżowy

3g

laktoza

10 g

chlorek sodu

5g

sole żółci

1.5 g

czerwień obojętna

0,03 g

fiolet krystaliczny

0,002 g

Agar (w zależności od właściwości żelujących agaru)

12g -:- 18g

Woda

1 000 ml

Przygotowanie

Postępować zgodnie z przepisami w celu zapewnie­nia selektywnych właściwości pożywki.

Dokładnie wymieszać z wodą składniki lub kompletną pożywkę handlową i odstawić na kilka minut. Tak usta­lić pH, aby po gotowaniu wyniosło 7,4N6) w 25 °C. Do­prowadzić do wrzenia, mieszając od czasu do czasu.

Gotować przez 2 min. Niezwłocznie ochłodzić pożywkę w łaźni wodnej (6.5) o temperaturze 45 °C.

Unikać przegrzania pożywki, zbyt długiego ogrzewania lub odgrzewania. Pożywki nie można sterylizować w autoklawie i należy utrzymywać jej jałowość do chwili użycia (9.2.2).

Pożywkę należy użyć w ciągu 3 h od chwili przygotowa­nia.

6 Aparatura i szkło

UWAGA 2 Zamiast szkła laboratoryjnego można używać sprzętu jednorazowego użytku, jeżeli ma on odpowiednią specyfikację.

Typowe wyposażenie pracowni mikrobiologicznej, a w szczególności:

6.1 Aparat do suchej sterylizacji (sterylizator) lub do mokrej sterylizacji (autoklaw)

Według ISO 7218.

6.2 Ciepłarka, o temperaturze 30 °C ± 1 °C, 35 °C ± 1 °C lub 37 °C ± 1 °C.

6.3 Płytki Petriego, szklane lub plastykowe o średni­cy od 90 mm do 100 mm.

6.4 Pipety, o nominalnej pojemności 1 ml.

6.5 Łaźnia wodna lub podobny sprzęt, umożliwiający utrzymanie temperatury 45 °C ± 0,5 °C.

6.6 Przyrząd do liczenia kolonii, składający się z oświetlonej podstawy i mechanicznego lub elektronicz­nego licznika cyfrowego.

6.7 Pehametr, o dokładności ± 0,1 jednostki pH w temperaturze 25 °C.

7 Pobieranie próbek

Próbki pobierać zgodnie z normą międzynarodową wła­ściwą dia danego produktu. Jeżeli taka norma nie istnie­je, zaleca się, aby zainteresowane strony uzgodniły to między sobą.

8 Przygotowanie próbki do badań

Przygotować próbkę zgodnie z normą międzynarodową właściwą dla danego produktu. Jeżeli taka norma nie istnieje, zaleca się, aby zainteresowane strony uzgodniły procedurę między sobą.

9 Sposób postępowania

9.1 Wielkość próbki, zawiesina wyjściowa i rozcieńczenia

Według ISO 6887 i normy międzynarodowej właściwej dla danego produktu.

9.2 Posiew i inkubacja

9.2.1 Przygotować dwie jałowe płytki Petriego (6.3). Jało­wą pipetą (6.4) przenieść do każdej płytki po 1 ml próbki w przypadku badania produktu płynnego lub po 1 mi za­wiesiny wyjściowej próbki w przypadku innego produktu.

Przygotować następne dwie jałowe płytki Petriego. Jało­wą pipetą przenieść do każdej płytki po 1 ml pierwszego dziesięciokrotnego rozcieńczenia (10"1) próbki w przy­padku produktu płynnego lub po 1 ml pierwszego dzie­sięciokrotnego rozcieńczenia (10"2) zawiesiny wyjścio­wej w przypadku innych produktów.

Powtarzać czynność używając jałowej pipety dla dalszych dziesięciokrotnych rozcieńczeń.

9.2.2 Do każdej płytki Petriego wlać około 15 ml pożywki VRBL (5.3) o temperaturze 45 °C ± 0,5 °C. Czas między przygotowaniem pierwszego rozcieńczenia (10"1) a chwi­lą wylania pożywki (5.3) na płytki nie powinien przekro­czyć 15 min.

Posianą próbkę dokładnie wymieszać z pożywką i pozo­stawić do zestalenia, umieszczając płytki na zimnej po­ziomej powierzchni.

Przygotować także płytkę kontrolną z 15 ml pożywki w celu sprawdzenia jej jałowości.

9.2.3 Po całkowitym zestaleniu pożywki zalać po­wierzchnię każdego posiewu około 4 ml pożywki VRBL (5.3) o temperaturze 45 °C ± 0,5 °C. Odstawić do zestale­nia, jak opisano wyżej.

9.2.4 Odwrócić posiane płytki i inkubować w cieplarce w temperaturze 30 °C, 35 °C lub 37 °C (zgodnie z ustale­niami) przez 24 h ± 2 h.

9.3 Liczenie kolonii

Po inkubacji (9.2.4) policzyć charakterystyczne kolonie bakterii z grupy coli na każdej płytce zawierającej nie wię­cej niż 150 koionii2) charakterystycznych lub innych, uży­wając przyrządu do liczenia kolonii (6.6).

UWAGA 3 Po 24 h inkubacji charakterystyczne kolonie są ciemnopurpurowoczerwone o średnicy, co najmniej 0,5 mm, czasami otoczone czerwoną strefą wytrąconej żółci.

10 Przedstawianie wyników

10.1 Metoda obliczania wyników

10.1.1 Przypadek ogólny - Płytki zawierające od 15 do 150 charakterystycznych kolonii

Wybrać płytki, na których liczba charakterystycznych kolo­nii w dwóch kolejnych rozcieńczeniach nie przekracza 150. Przynajmniej jedna z tych płytek powinna zawierać nie mniej niż 15 charakterystycznych kolonii.

Liczbę N bakterii z grupy coli w 1 ml lub 1 g produktu obliczyć z wzoru:

N = ∑C /(n1 + 0,1n2) d

w którym

∑C - suma charakterystycznych kolonii na wszyst­kich wybranych płytkach;

n1 - liczba płytek wybranych z pierwszego rozcień­czenia;

n2 - liczba płytek wybranych z drugiego rozcieńcze­nia;

d - współczynnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu rozcieńczeniu.

Obliczoną z wzoru liczbę zaokrąglić do dwóch znaczą­cych cyfr.

Wynik, to jest liczbę bakterii z grupy coli w 1 ml lub 1 g produktu, przedstawić jako liczbę zawierającą się między 1,0 a 9,9 pomnożoną przez 10x, gdzie x oznacza odpo­wiednią potęgę.

10.1.3 Szacowanie małych liczb

Jeżeli na dwóch płytkach, na które posiano próbkę płyn­ną lub zawiesinę wyjściową innej próbki, wyrosło niniej niż 15 charakterystycznych kolonii, wynik należy podać w następujący sposób:

10.1.4 Brak charakterystycznych kolonii

Jeżeli na dwóch płytkach, na które posiano nie rozcień­czoną próbkę płynną lub pierwsze rozcieńczenie innych próbek, nie stwierdzono obecności charakterystycznych kolonii, to wynik podać w następujący sposób:

UKD 637.17.3:616.157:543.9-078

POLSKA NORMA

PN-93

Mleko i przetwory mleczarskie Badania mikrobiologiczne Staphylococcus aureus (gronkowce chorobotwórcze) — wykrywanie obecności, oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL), oznaczanie liczby metodą płytkową

A-86034/13

Zamiast PN-77/A-86031"

Grupa katalogowa 1219

1. WSTĘP

1.1. Przedmiot normy. Przedmiotem niniejszego arku­sza normy jest wykrywanie obecności oraz oznaczanie liczby Staphylococcus aureus w mleku i przetworach mleczarskich.

1.2. Określenia. Staphylococcus aureus (gronkowce chorobotwórcze) są to bakterie tworzące typowe i/lub nietypowe kolonie na określonej pożywce selektywnej i wytwarzające koagulazę ścinającą plazmę krwi króli­czej.

1.3. Rodzaje metod badania. Arkusz normy obejmuje następujące metody:

1.4. Zakres stosowania metod. Metody wykrywania obecności i oznaczania NPL są przeznaczone do bada­nia produktów o małym zanieczyszczeniu Staphylococ­cus aureus (poniżej 100 w 1 g lub 1 ml), a zwłaszcza suszonych produktów mleczarskich.

Metody płytkowe z zastosowaniem pożywki Baird-Parkera i pożywki PFI (z plazmą krwi króliczej, fibry-nogenem i inhibitorem trypsyny) są przeznaczone do badania wszystkich produktów mleczarskich. Pożywka PFI umożliwia szybkie oznaczanie Staphylococcus aureus (24 -r- 26 h) i bezpośrednie oznaczanie tych bak­terii w produktach o dużym zanieczyszczeniu inną mikroflorą.

2. WYKRYWANIE OBECNOŚCI STAPHYLOCOCCUS AUREUS W OKREŚLONEJ ILOŚCI PRODUKTU

2.1. Zasada oznaczania. Oznaczanie obejmuje nastę­pujące etapy:

2.2. Aparatura i sprzęt

    1. Cieplarka o temperaturze 37 ±1°C.

    2. Pehametr.

    3. Łaźnia wodna o temperaturze 37 +1°C, 45 +1°C i 50 +1°C.

  1. Probówki bakteriologiczne o wymiarach 10 x 75 mm, 16 x 160 mm, 20 x 200 mm.

  2. Butelki pojemności 150 -:- 250 ml.

  3. Pipety pojemności 1 ml, 10 ml i pomiarowe pojem­ności 1 ml z podziałką co 0,1 ml.

  4. Oczka bakteriologiczne najlepiej średnicy 3 mm i drucik.

  5. Płytki Petriego średnicy 90 mm. Przygotowywanie aparatury i sprzętu — wg PN-93/ A-86034/02.

3. OZNACZANIE LICZBY STAPHYLOCOCCUS

AUREUS METODĄ PŁYTKOWĄ NA POŻYWKACH BAIRD-PARKERA I PFI

3.1. Zasada oznaczania.

Oznaczanie na pożywce Baird-Parkera obejmuje:

Oznaczanie na pożywce PFI obejmuje:

3.2. Aparatura i sprzęt

  1. Cieplarka o temperaturze 37 ±1°C.

  2. Łaźnie wodne o temperaturze 37 +1°C, 45 ±1°C i 55 ±1°C.

  3. Pehametr.

  4. Pipety pojemności 0,1; 0,5; 1 i 10 ml lub pomia­rowe 1 ml zamiast 0,1 i 0,5 ml.

  5. Butelki pojemności 150 -:- 250 ml.

  6. Probówki bakteriologiczne o wymiarach 16 x 160 mm i 10 x 75 mm (do próby na koagulazę).

  7. Płytki Petriego średnicy 90 i 140 -:- 150 mm. h) Pręcik Drigalskiego wg PN-93/A-86034/02.

  8. Filtry bakteriologiczne.

  1. Pompka wodna lub pompa próżniowa.

Przygotowanie aparatury i sprzętu — wg PN-93/ A-86034/02.


Wyszukiwarka