Wykład -7-

Możliwości, jakie daje wykorzystanie fermentacji mlekowej

Fermentacja mlekowa jest to wykorzystanie metabolizmu pośredniego mikroorganizmów, czyli podstawowego procesu, jaki zawsze te komórki przeprowadzają, bo jest to ich proces energodajny, wiec wykorzystanie mikroorganizmów do produkcji metabolitów pośrednich (niektórych) wiąże się z fermentacją w sensie biochemicznym. Jednym, z głównych procesów wykorzystujących fermentację mlekową jest produkcja serów, czyli sposób oddzielenia od mleka tego, co jest w nim najbardziej wartościowe, czyli białka i tłuszczy, jest to jednocześnie sposób na przechowywanie tych związków odżywczych.

Na tym nie kończy się jednak wykorzystanie fermentacji mlekowej oraz wykorzystanie mleka. Po produkcji sera zostaje bardzo duża część płynna mleka zwana serwatką. Niegdyś serwatkę spuszczano jako ściek do rzek, co powodowało śnięcie ryb, bowiem w serwatce jest jeszcze bardzo dużo substancji organicznych, na których rozwijają się bakterie zużywając przy tym tlen rozpuszczony w wodzie, co powodowało śnięcie ryb.

Biotechnologia pozwala na bardzo ekonomiczne wykorzystanie surowców, zaczęto więc wykorzystywać to, co pozostaje jeszcze w serwatce.

Serwatkę zagęszcza się (np. za pomocą ultrafiltracji, frakcjonowania czy odwrotnej osmozy), dzięki temu uzyskuje się maksymalny odzysk białka, są to białka niewykorzystane w produkcji sera gdyż są rozpuszczalne w wodzie niepodatne na ścinanie enzymatyczne czy na precypitację kwaśną. Robi się to po to, aby wykorzystać to białko w jakiś sposób, gdyż białko zwierzęce jest drogie, ma duże walory odżywcze. Przy odzysku tym wykorzystuje się, np. denaturację termiczną i strącenie w niskim pH. Innym związkiem do wykorzystania z serwatki jest nierozłożona w czasie fermentacji mlekowej laktoza. Laktoza odzyskana z serwatki służy do otrzymywania hydrolizatów, takich gdzie powstają syropy glukozowo galaktozowe tzn. poddaje się laktozę wydzieloną z serwatki albo kwaśnej hydrolizie albo enzymatycznej (obecnie enzymatyczna przeważa) i oczyszczaniu. Komercyjne wytwórnie syropów glukozowo-galaktozowych pracują we Francji w Anglii w USA w Nowej Zelandii wykorzystują immobilizowaną laktazę pochodzenia mikrobiologicznego, lub dawcą enzymu jest niższy grzyb Aspergillus niger albo E coli. (kolejne zastosowanie enzymu w konkretnej produkcji - wytwórnie przemysłowe wykorzystujące proces enzymatyczny i enzym z grupy glikozydaz do produkcji syropów glukozowo-galaktozowych).

[Syropy takie się stosuje np. do mrożonych torcików, był tam tez kwas cytrynowy i serwatka w proszku no i oczywiście aromaty identyczne z naturalnym (uzyskany drogą procesu biotechnologicznego).

Kwas cytry cytrynowy ( może występować jako regulator kwasowości) po pierwsze, dlatego bo jest kwaśny, po drugie do jest składnikiem każdej komórki jest, bowiem metabolitem powstającym w cyklu krebsa jest środkiem naturalnym i jest otrzymywany w sposób naturalny.]

Wykorzystanie serwatki:

Można z niej otrzymywać etanol (1 litr etanolu otrzymuje się z 42 litrów serwatki).

Serwatka jest substratem do produkcji kwasu mlekowego z wykorzystaniem możliwości fermentacyjnych określonych mikroorganizmów.

Inne: produkcja niealkoholowych napojów fermentowanych z serwatki (fermentacja tu nie jest alkoholowa), serwatka bardzo dobrze komponuje się z sokami owocowymi, wysyca się to CO₂ i gotowe.

Serwatkę całą lub odbiałczaną poddaje się fermentacji mlekowej też otrzymując napoje (Ribella - Szwajcaria).

Inne produkty uzyskiwane dzięki fermentacji mlekowej.

Oczywiście produkty mleczne produkowane dzięki fermentacji mlekowej.

Jeżeli kisimy kapustę lub ogórki to też jest fermentacja mlekowa wiec nie powinna się nam ona kojarzyć li tylko z mlekiem, ale przede wszystkim z kwasem mlekowym.

Wszystkie procesy wykorzystujące fermentację mlekową umożliwiają nam otrzymanie jogurtów, kefirów, maślanki, kwaśnej śmietany serów niedojrzewających.

W zależności od produktu, jaki chcemy otrzymać musimy zastosować inne mikroorganizmy, dlatego, że oprócz kwasu mlekowego (główny produkt procesu) powstaje szereg innych metabolitów warunkujących różnice między np. kefirem i jogurtem. Otrzymuje się to odpowiednie mikroorganizmy starterowe, są to albo czyste kultury lub mieszane kultury. Są one produkowane przez specjalne wytwórnie takich starterów.

Są dwa gatunki, o których należy pamiętać w związku z fermentacją mlekową:

-Streptococcus (np. lactis)

-Lactobacillus -( nie trzeba pamiętać imienia i nazwiska bakterii, nazwisko wystarczy).

Tych bakterii jest znacznie więcej i różne gatunki mikroorganizmowi wnoszą różne walory smakowe i zapachowe. Czyli obok produkcji kwasu mlekowego w wyniku fermentacji powstają związki decydujące o walorach smakowych.

-W maślance i kwaśnym mleku smak nadaje acetaldehyd.

-2 gatunki Leukonosto - walory substancji smakowych -acetolina.

Niezależnie od otrzymywanego produktu, głównym procesem w tych wszystkich przypadkach jest fermentacja laktozy, rozkład laktozy na glukozę i galaktozę; glukoza jest dalej utleniana w glikolizie do pirogronianu i następnie powstaje kwas mlekowy, aby zregenerować zredukowany NAD, oraz śladowe ilości kwasu octowego i CO₂. Zależnie od mieszaniny populacji starterowej powstaje jeszcze szereg innych metabolitów, które towarzyszą procesom oddechowym tych mikroorganizmów dając w rezultacie niepowtarzalny smak tego rodzaju przetworów mlecznych.

Do zakwaszania stosuje się kultury starterowe, które są produkowane w odpowiednich wytwórniach, odpowiada to produkcji drożdży piekarniczych (to też jest kultura starterowa)

W Polsce taką firmą produkującą kultury starterowe (do fermentacji mlekowej) jest firma Biolacta. Startery są rozprowadzane w różnej formie:

-zamrożone mieszanki o zestandaryzowanej ilości (dana porcją inakuluje się odpowiednią objętość mleka - startery do bezpośredniej inakulacji)

-forma zamrożona, ale do podhodowania, - trzeba zaszczepić mniejszą objętość mleka a następnie przenieść ją do objętości produkcyjnej - tzw. surowe startery

-biofilizowane proszki - najwygodniejsze w przechowywaniu i użyciu

Produkty mleczne można też otrzymywać przez bezpośrednie zakwaszanie (są to produkty różniące się od produktów otrzymywanych na drodze naturalnej, lecz są też tańsze i otrzymuje się je szybciej). Do zakwaszania stosuje się: kwas cytrynowy (naturalny związek), kwas fosforowy (nienaturalny), kwas glukonowy, kwas mlekowy (najdroższy).

Porównując produkty otrzymane na drodze bezpośredniego zakwaszania i fermentacji okazuje się, że produkty otrzymane drogą naturalną mimo większych kosztów i dłuższego czasu produkcji są korzystniejsze dla człowieka. W przypadku bezpośredniego zakwaszenia można bardzo dobrze panować na walorami zapachowymi, strukturalnymi, gdyż ilość dodawanego kwasu jest zawsze zestandaryzowana (w przypadku fermentacji dzieje się to naturalnie) to inne walory tych produktów już się wyraźnie różnią. Wiąże się to z tym, że w produktach naturalnych jest w dużej mierze strawiona laktoza na tym też polega wyższość tych produktów (ze względu na nietolerancję laktozy u większości ludzi). Przy zakwaszaniu kwasem laktoza pozostaje w ilości, w jakiej była na początku. W produktach naturalnych wszystkie inne składniki mleka są, choć częściowo podtrawione, występują dodatkowe składniki powstające dzięki obecności mikroorganizmów w czasie procesu produkcyjnego m.in. naturalne substancje antybiotyczne, które wytwarzają mikroorganizmy fermentacji mlekowej, czyli antybiotyki z grupy bakteriocyn w dużej mierze przyczyniające się do tego, że naturalne produkty pomagają utrzymać naturalny skład naszej symbiotycznej mikroflory w przewodzie pokarmowym i zabezpieczają nas przed infekcjami przez inne mikroorganizmy (do pewnego stopnia), mówi się nawet, że występują w nich czynniki przeciwrakowe. Proces fermentacji mlekowej był wykorzystywany przez człowieka od bardzo dawna nie tylko dlatego, że powstawało coś dobrego, ale dlatego że maja one dobre właściwości.

Główne produkty fermentacyjne powstają przy użyciu starterów o odpowiednim składzie ( nie jest dla nas ważne, jakich dokładnie mikroorganizmowi się używa, aby otrzymać np. kefir), nad wszystkimi tymi procesami trzeba do pewnego stopnia panować, dlatego, że jeżeli np. prowadzi się fermentacje mlekową kulturą bakteryjną, która zawiera bakterie z gatunku Lactobacillus to, jeśli warunki fermentacji będą za bardzo beztlenowe to zamiast kwasu mlekowego powstanie kwas octowy, przez co zmienia się walory produktu. Mikroorganizm wykorzystywany przy produkcji jogurtów, maślanki (Leukonosto), jako metabolit pośredni wytwarza acetoline rozkładana następnie do diacetylu - związek ten nadaje produktom fermentowanym przez te bakterie zapach maślanki.

Lactobacillus burgalicus i Streptococcus thermophilus - ich metabolizmowi towarzyszy powstawanie acetaldehydu, który jest głównym składnikiem smakowym jogurtu.

Dlatego mieszaniny starterowe muszą być odpowiednio skomponowane.

Do produkcji kefiru stosuje się tzw. ziarna kefirowe - znajdują się w nich oprócz bakterii fermentacji mlekowej takich jak Streptococcus, Lactobacillus caucasicus, stosuje się jeszcze specyficznego rodzaju drożdże. W kefirze odbywa się obok fermentacji mlekowej w niewielkim stopniu fermentacja alkoholowa. Starter ten nazywa się ziarnami kefirowymi, bo jest podobny do różyczek kalafiora.

Przy fermentacji mlekowej dla przemysłu mleczarskiego korzysta się z tego, że metabolizmowi mikroorganizmów na substracie, jakim jest laktoza towarzyszy powstawanie szeregu metabolitów pośrednich, które potem występują w tych produktach powodując, różnice między tymi produktami.

Nie jest obojętne: jaki jest czas inkubacji, jak długo pozwala się mikroorganizmom w tym mleku żyć i w jakiej temperaturze się odbywa;

- kwaśne mleko to temp. 37-40⁰C przez 16-18h;

- maślanka wymaga niskiej temperatury i 18h;

- kefir temp. zbliżona do pokojowej przez 12h ale potem jeszcze w niskiej temp. kefir dojrzewa przez 1 - 3 dni.

W zależności od startera i od tego, co chcemy otrzymać stosuje się różnego rodzaju temperatury.

Z powodu stosowania mikroorganizmów przy produkcji żywności (przemysł mleczarski, kiełbasy fermentowane, tudzież kiszone ogórki, kapusta) zaczęto wprowadzać przepisy, które pozwalają konsumentom ufać tym produktom ( dlatego, ze pracując z mikroorganizmami ma się do czynienia z substancjami na których te mikroorganizmy rosną więc i inne mikroorganizmy będą się tam dobrze rozwijać stąd duże niebezpieczeństwo zakażenia mikroorganizmami niepożądanymi).

W Polsce zaczyna się wprowadzać specyficzny sposób kontroli produktów uzyskiwanych z wykorzystaniem mikroorganizmów, który jest zalecany przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) i wprowadzony jest już w całej unii europejskiej. System ten w skrócie nazywa się (HACCP) System Analizy Zagrożeń i Krytycznych Punktów Kontroli, i ma zapewnić prawidłowy stan mikrobiologiczny produktów poprzez zapobieganie zagrożeniom w całym łańcuchu produkcji (od surowców do opakowania i sprzedaży). Cały system produkcji podlega monitorowaniu (dla sera- od krowy po opakowanie). Punktem Krytycznym (kontrolny punkt krytyczny - critical control point CCP) jest surowiec, miejsce pobrania surowca, sposób transportu, postępowanie z surowcem, opakowanie, mycie urządzeń, czystość rąk pracowników. Tworząc system dla danego procesu produkcyjnego bierze się pod uwagę każde miejsce gdzie może nastąpić zakażenie produktu. System ten obejmuje: najpierw analizę ciągu produkcyjnego i wyznaczanie każdego miejca, na którym można spowodować, przez nieodpowiednie postępowanie, zakażenie produktu, dotyczy to również sprzedaży, warunków przechowywania, rozprowadzania, itd. Kiedy znany jest już ciąg produkcyjny (od surowca - do sprzedaży) i wyznaczone są punkty krytyczne trzecim etapem jest monitorowanie - kontrola punktów krytycznych polega na kontroli mikrobiologicznej, czyli na szybkiej identyfikacji czy są w produkcie obce komórki mikroorganizmów - jest to kontrola ilościowa i jakościowa składu mikrobiologicznego produktu czy określonego miejsca. Jest to zadanie dla biotechnologii, gdyż wszystkie analizy jakościowe i ilościowe wymagają czasu, a tu analiza musi być przeprowadzona szybko, istnieją jednak stosunkowo szybkie metody biotechnologiczne analizy składu mikrobiologicznego (1 wykład).

********

[„Mam nadzieje, że hasło systemu Analizy krytycznych punktów zagrożeń będzie państwu już znane, będziecie wiedzieć, na czym to polega, co może być krytycznym punktem kontroli a jeśli wrócicie do jednego z pierwszych wykładów będziecie wiedzieć, w jaki sposób tą analizę się wykonuje - metody szybkie automatyczne umożliwiające stwierdzenie ilościowego i jakościowego stanu mikrobiologicznego określonego produktu”]

Produkty otrzymywane na drodze biotechnologicznej wykorzystywane przez przemysł spożywczy, ale nie tylko.

FERMENTACYJNA PRODUKCJA KWASU GLUTAMINOWEGO

- otrzymuje się kwas glutaminowy jako związek optycznie czynny: L-Glu

-Glu - jest aminokwasem, więc nie powinien nagromadzać się w komórkach w takich ilościach, aby można było wykorzystywać naturalne mechanizmy do produkcji tego kwasu, u mikroorganizmów synteza aminokwasów jest kontrolowana przez klastery genów zorganizowane w operony, dochodzi tu dodatkowo kontrola przez sprzężenie zwrotne, nagromadzający się aminokwas wyłącza działanie całego operonu.

Produkcja L-kwasu glutaminowego to 370 tyś. Ton/ rok, wyprodukowanie tony kosztuje 95$, cena sprzedaży 2$/kg.

Dawniej otrzymywało się L-Glu z białek zapasowych zbóż bogatych w L-Glu i wykorzystywano w tym celu proces kwaśnej ciśnieniowej hydrolizy (proces drogi, produkcja mało ekologiczna - proces chemiczny).

Po co się produkuje L -Glu. Wykorzystanie :

Sole kwasu glutaminowego są przyprawą, maja walory smakowe (wykorzystywane w kostkach rosołowych, zupach instant - glutaminian sodu).

Wykorzystywany jest też w syntezach chemicznych.

Pochodna N- acetylowana służy do produkcji sulfaktantów biodegradowalnych, nieszkodliwych dla skóry i dodawanych dlatego do mydeł i szamponów.

Amidy tej N-acetylowanej pochodnej mają charakter środków żelujących, wykorzystywane do dyspergowania olejów np. przy ochronie wód morskich, podczas jakiegoś wycieku z tankowca itp.

Kwas oksypirolidynokarboksylowy - cyklicznie zamknięty kwas glutaminowy, ma charakter nawadniający- wykorzystywany w kosmetykach.

Otrzymywanie kwasu glutaminowego (co się robi aby komórki naprodukowały kwas glutaminowy i aby on się w nich gromadził).

Jest wiele szczepów mikroorganizmów, które z różnych przyczyn nadprodukcja L-Glu, są to bakterie Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, czy Orthobacter, różne wytwórnie stosują różne szczepy, ale najbardziej znanym jest Corynebacterium glutamicum.

Jako źródło węgla w procesie produkcyjnym wykorzystuje się różne cukry, najczęściej są to melasy (np. buraczane nienadające się do produkcji cukru, niespełniające pewnych wymagań dla przemysłu cukrowniczego, mogą stać się podłożem przy produkcji L-Glu) lub hydrolizaty skrobiowe. Źródłem azotu muszą być takie sole, w których azot jest już w formie zredukowanej, nie mogą być to azotany.

Proces jest tlenowy.

Role regulującą w procesie produkcji kwasu L-glu pełni biotyna - w przypadku jej braku spada zawartość fosfolipidów w komórkach tych mikroorganizmów, wówczas ich błony i ściany komórkowe stają się przepuszczalne i L-Glu, syntezowany przez komórki, zamiast być przez nie wykorzystywany wycieka na zewnątrz, unika się w ten sposób hamującego działania samego L-glu na proces jego biosyntezy przez sprzężenie zwrotne, nie ma tyle produktu w komórce, aby mógł wyłączyć proces własnej biosyntezy. Przy produkcji L-Glu wykorzystuje się jeszcze inne zjawisko: prowadzi się produkcję L-glu w obecności pewnych ilości penicyliny, która działa na poziomie biosyntezy peptydoglikanu, jeśli więc jest w podłożu penicylina to powstające młode bakterie nie będą w stanie sobie ściany zsyntezować, przez co doprowadza się do wycieku L-Glu do podłoża.

L-Glu powstaje w komórkach w dwóch procesach:

-w cyklu glioksylanowym

-w procesie związanych z cyklem krebsa, α-ketoglukaran jest ketokwasem, który jest substratem wyjściowym w syntezie kwasu glutarynowego.

Usprawniono szczepy pod względem tych dwóch szlaków syntezy kwasu glutaminowego

- zwiększono wydajność wiązania dwutlenku węgla, zwiększono wydajność reakcji gdzie do kwasu fosfoenolopirogronianowego jest przyłączany dwutlenek węgla i powstaje szczawiooctan i dalsze reakcje w kierunku syntezy kwasu L-Glu przebiegają szybciej.

- uzyskano termoczułego mutanta z odpowiednią barierą przepuszczalności, która umożliwiała wypuszczanie przez komórki kwasu glutaminowego w zwiększonym stopniu.

To jest jeden z aminokwasów otrzymywanych obecnie głównie metodami biologicznymi i który ma zastosowanie w przemyśle spożywczym i nie tylko.

Drugim z aminokwasów, który ma znaczenie żywieniowe i nie tylko jest kwas :

L- asparaginowy.

Odnaleziono go w soku asparagusa, stąd nazwa, ale jako aminokwas kwaśny można go było też otrzymać przez hydrolizę ziaren zbóż (białek zapasowych ziaren zbóż), gdzie aminokwasy kwaśne występują w dużej ilości. Od 1958 roku znane już były metody fermentacyjnego, lub enzymatycznego otrzymywania tego kwasu, obie metody były oparte o tę samą reakcję enzymatyczną, reakcje, która przebiega w każdej żywej komórce w związku z biosyntezą tego aminokwasu, jest to reakcja jednocześnie jedną z reakcji włączania amoniaku do związku organicznego. Reakcja przyłączania amoniaku do podwójnego wiązania w kwasie fumarowym katalizowana przez enzym nazywany aspartazą (amoniakoliaza kwasu asparaginowego).

Zastosowanie kwasu asparaginowego:

-aspartan - duże ilości L-Asp są do jego produkcji wykorzystywane: spartan - ester metylowy L-asparaginofenyloalaniny(?).

- przemysł farmaceutyczny - wykorzystanie L-Asp jako nośnika jonów potasu i magnezu do mięśnia sercowego, w ten sposób jest skonstruowany lek o nazwie Aspargina. [Nie wystarczy zjeść chlorku potasu czy siarczanu magnezu, bo nie ulegną absorpcji w jelicie, trzeba je podać w takiej postaci, aby zostały dostarczone do określonej tkanki, która jest formą transportującą.]

- sole żelazowe i potasowe (L-Asp) są wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym jako

nośniki tych jonów w chorobach wątroby czy w anemii.

- synteza związków powierzchniowo czynnych

- razem z witaminą B₆ dobrze się komponuje w kosmetykach

- jako sól sodowa jest wykorzystywany jako przyprawa soku pomarańczowego.

Otrzymywanie L-Aps:

Fermentacja, czyli proces wykorzystujący biomasę do produkcji kwasu L-Asp dawał małą wydajność i zatrzymał się na etapie patentu przemysłowego i ta fermentacja nie na skalę przemysłowa funkcjonuje w oparciu o bakterie mutanta auksotroficznego Brevibacterium flavum, które to na glukozie lub na fumaranie syntezuje L-Asp. Musi to być mutant, aby mógł wyłączyć kontrolę szlaku biosyntezy przez wpływanie na wyłączenie odpowiedniego operonu, albo wyłączenie kontroli szlaku enzymatycznego.

Reakcja enzymatyczna:

Reakcja jest oparta o aktywność enzymu przyłączającego amoniak do kwasu fumarowego i biokatalizatorem są wysuszone komórki E. coli (reakcja 18godzinna w 37⁰C daje wydajność 88% kwasu-Asp), lub jest to proces ciągły (proces przemysłowy wykorzystywany w Japonii), kolumna na której znajduje się odpowiednio przygotowany biokatalizator, są to komórki E. coli, o odpowiedniej aktywności aspartazowej, immubilizowane w poliakryloamidzie. Jeśli są one w tym właśnie nośniku ich aktywność jest wówczas zachowana w temperaturze procesu przez 120 dni. Jeśli nośnikiem jest karageninę innego rodzaju polisacharyd to kolumna może pracować przez 2 lata (bardzo wydajny proces).

Przez te kolumny z odpowiednio przygotowanym biokatalizatorem podaje się roztwór 1,2M fumaranu amonu z dodatkiem jonów magnezu, pH i Mg - na poziomie optymalnym dla aktywności enzymu (kolumna jest chłodzona- duża objętość kolumny- duże wydzielanie ciepła, więc chłodzenie zapobiega dezaktywacji biokatalizatora). „Wyciek” z kolumny poddaje się przeróbce chemicznej, 60% kwasem siarkowym obniża się pH do wartości ok.3, chłodzi się do 15*C -wypadają kryształy, wiruje się , przemywa wodą otrzymując do 90-95% wydajności kwasu L-asp. Teoretycznie kolumna o pojemności 1000 litrów daje 3,4 tony L-Asp.

Te dwa aminokwasy są najważniejsze, choć i inne mają znaczenie żywieniowe.

Kwas cytrynowy

Produkt biotechnologiczny na bardzo dużą skalę.

[Metabolit pośredni - wszystkie procesy fermentacyjne, produkcja aminokwasów, produkcja kwasu cytrynowego opierają się na wykorzystaniu mikroorganizmów i metabolitów pośrednich i otrzymywaniu metabolitów pośrednich. Przy fermentacji nie wydziela się tych metabolitów, wykorzystuje się naturalne mieszaniny, jakie powstają w czasie fermentacji, tu wydziela się metabolit pośredni, dlatego często powstaje problem jak nagromadzić lub produkować metabolit pośredni w takiej ilości przez komórki, aby się to opłaciło. Problem bierze się stąd, że w żadnej komórce nic nigdy nie nagromadza się w takiej ilości, jakie są zbędne dla istnienia takiej komórki.]

Produkcja roczna kwasu cytrynowego wynosi 300 tyś. Ton/rok. Otrzymywany jest głównie metodami biologicznymi. Nazwa pochodzi od faktu, że wyizolowano go z soku cytryny w 1784 r. Występuje w każdej komórce, bo jest metabolitem pośrednim cyklu krebsa, większe jego ilości nagromadzają się w owocach cytrusowych. Ponieważ występuje w każdej komórce został uznany za środek nieszkodliwy, naturalny i dlatego jest powszechnie wykorzystywany w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i nie tylko.

Do roku 1880 znane były metody chemicznego otrzymywania tego kwasu, przede wszystkim z glicerolu. Metody te były drogie i nie dawały wystarczającej wydajności. Metody fermentacyjne rozpoczęły się wraz ze znalezieniem pewnych gatunków grzybów, na początku nazywano je Cytomyces, bo dawały kwas cytrynowy - ich wzrostowi towarzyszyło nagromadzanie się kwasu cytrynowego. Po dokładniejszym zbadaniu tych grzybów okazało się, że są to pewne gatunki penicillium. Pierwsze technologie oparte na tych mikroorganizmach wprowadzono w Anglii, Belgii, Czechosłowacji i Niemczech. Dziś wykorzystuje się innego rodzaju mikroorganizmy.

Zastosowania kwasu cytrynowego;

-przemysł spożywczy - słodycze i napoje (głównie) - wykorzystuje 75% produkcji rocznej

- farmakologia- 10%

- inne gałęzie przemysłu - 15%

Wykorzystanie:

struktura chemiczna tego kwasy - grupy hydroksylowe zbliżone do siebie - dlatego jest dobrym związkiem kompleksującym np. metale ciężkie - żelazo, miedź, dlatego bardzo często wykorzystywany do stabilizacji olei i tłuszczy - jako chelator metali zmniejsza procesy utleniania przebiegające w tłuszczach.

- nie jest korozyjny -czyszczenie bojlerów i instalacji - nie niszczy powierzchni metalowych - dodatek do środków czyszczących.

- Stabilizuje kwas askorbinowy - zapobiega jego utlenianiu

- daje efekt musujący z węglanami i dwuwęglanami - dodatek do leków rozpuszczalnych i musujących (np. rozpuszczalna aspiryna)

- stosowany jako anion do leków, które maja charakter zasad

- sól trójsodowa kwasu cytrynowego zapobiega krzepnięciu krwi - kompleksuje wapń

- sól żelazowo-amonowa - wykorzystywana w anemii - nośnik żelaza

- mieszaniny buforowe - w -farmakologii, kosmetyce

- do usuwania tlenku siarki z gazów odlotowych.

- estry z różnymi alkoholami dają możliwość otrzymania plastyfikatorów do produkcji foli do pakowania żywności. Folia taka pochodzi z ze związków naturalnych jest opakowaniem nietoksycznym i szeroko stosowanym.

Otrzymywanie: obecnie dwa procesy

Organizmem produkującym obecnie kwas cytrynowy jest grzyb Aspergillus niger, w oparciu o aktywność tego mikroorganizmu są możliwe dwa procesy: fermentacja powierzchniowa i fermentacja wgłębna.

W przypadku fermentacji powierzchniowej biomasa rośnie na powierzchni podłoża, w przypadku fermentacji wgłębnej w całej jego objętości (tzw. wzrost dyfuzyjny). Obie te fermentacje wykorzystują jako źródło węgla i energii nieodpowiednie dla przemysłu cukrowniczego melasy: z buraków cukrowych lub trzciny cukrowej ewentualnie syrop glukozowy. Istnieje też proces oparty na aktywności drożdży Candida ale nie ma on większego zastosowania.

30% produkcji oparty jest o proces fermentacji powierzchniowej.

W procesie tym do melasy o określonym stężeniu dodaje się składników nieorganicznych i żelazicyjanek i takie podłoże podlega sterylizacji i gotowaniu.

Żelazicyjanek potasu - znaczenie regulujące w przypadku produkcji kwasu cytrynowego ma dostępność komórek do jonów cynku, żelaza i manganu. Dodanie żelazicyjanku w odpowiedniej ilości, aby jonów metali było tyle ile wymaga tego produkcja (przed dodaniem żelazicyjaku do podłoża określa się przez miareczkowanie ilość metali w podłożu i wówczas dodaje odpowiednia ilość tej soli). Tak przygotowane podłoże wlewa się do aluminiowych rynienek i zaszczepia się sporami grzyba. Produkcja przebiega w temp. 30*C przez 7-15 dni, po tym czasie opróżnia się rynienki, mycelia- komórki wegetatywne grzyba, oddziela się a płyn hodowlany idzie do sekcji oczyszczania.

Proces wgłębny - funkcjonujący na szerszą skalę - przebiega w fermentorach, gdyż biomasa rośnie w całej objętości podłoża - są to zbiorniki z mieszaniem i napowietrzaniem, wymagające chłodzenia. Proces przebiega w temp. 25-37*C. Podłoże przygotowywane jest w ten sam sposób jak przy fermentacji powierzchniowej.

Proces został opracowany w ten sposób, że wykorzystuje on biochemię nadprodukcji kwasu cytrynowego i gromadzenia się go w komórkach wykorzystywanych jako organizmy producencie. Normalnie kwas cytrynowy jako metabolit pośredni nie powinien się w tych komórkach gromadzić.

60% kwasu cytrynowego u organizmów producenckich pochodzi z reakcji C1 + C3, kwas pirogronowy + dwutlenek węgla - reakcja katalizowana, przez karboksylazę pirogronianową. 40% pochodzi z reakcji rozpoczynającej cykl krebsa, czyli z przyłączania acetylo-CoA do kwasu szczawiooctowego.

Zastosowanie odpowiednich warunków umożliwia kumulację kwasu cytrynowego: ogranicza się ilość dostępnego azotu, fosforu, oraz cynku, żelaza i manganu. Powoduje to, że komórki te, u których i tak zwiększona jest aktywność glikolityczna w stosunku do dalszych procesów, które mają wykorzystywać produkty glikolizy (cykl krebsa), syntezują nadmiar kwasu cytrynowego. Oczyszczanie jest to już proces chemiczny, polega on na gotowaniu z wapniem - otrzymuje się cztero-uwodniony cytrynian wapnia, przemywa się go wodnym roztworem kwasu siarkowego otrzymując kwas cytrynowy i siarczan wapnia.

NAJWAŻNIEJSZE - z produkcji kwasu cytrynowego:

-organizmem producenckim jest Aspergillius niger

- są dwa procesy fermentacyjne: powierzchniowy i wgłębny - proces wgłębny jest szerzej stosowany.

- nagromadzanie się kwasu cytrynowego jest możliwe przez sterowanie warunkami podłoża, warunkami hodowli oraz dzięki szczególnym procesom metabolicznym samych bakterii.

KWAS GLUKONOWY

-produkowany na dużą skalę - 50 tyś. Ton/rok

-bezpośredni metabolitem glukozy

Zastosowanie

- przemysł spożywczy - lakton tego kwasu znajduje się w proszku do pieczenia

- przemysł farmaceutyczny - nośnik jonów: wapnia, żelaza; dodatek w mieszankach różnego rodzaju leków.

Otrzymywanie:

Początkowo otrzymywano kwas glukonowy metodami chemicznymi (gdyż jest bezpośrednim produktem utlenienia glukozy), przez elektrochemiczne utlenienie glukozy w obecności tlenu lub bromu i odpowiedniego katalizatora. Obecnie metody fermentacyjne wyparły zupełnie metody chemicznei kwas glukonowy otrzymywany jest wyłącznie na drodze biologicznej.

Powstaje on w cyklu pentozofosforanowyn - w reakcji utlenienia glukozo-6-fosforanu do 6-fosforoglukono laktonu i ten przez glukonolaktonazę jest przekształcany w kwas 6-fosfoglukonowy. W przypadku nadmiaru glukozy (regulacja nadmiarem substratu), następuje zatrzymanie dalszego utleniania - otrzymuje się kwas 6-fosfoglukonowy.

Druga reakcja to bezpośrednie utlenianie glukozy (już nie w postaci glukozo-6-fosforanu), odpowiednio oksydazą i dehydrogenazą do glukonolaktonu, następnie spontanicznie lub enzymatycznie otrzymuje się kwas glukonowy. Wykorzystuje się do produkcji kwasu glukonowego dwa mikroorganizmy: Aspergillus niger i Acetobacter suboxidans (na skalę przemysłową wykorzystuje się Aspergillus niger).

W tym procesie istotnym jest, że podłoże musi zawierać substrat do utleniania - glukozę lub syrop dekstrozowy (syrop dekstrozowy powstaje przez enzymatyczne podtrawienie skrobii).

Źródłem azotu może być mocznik, sole amonowe, namok kukurydziany (patrz produkcja antybiotyków). Temp. fermentacji 30-33*C, przez 19 godzin, daje to 109% wydajności kwasu glukonowego (dlatego, że w procesach biotechnologicznych wydajność liczy się na wyjściową ilość substratu). Wykorzystując do procesu Acetobacter suboxidans, jako substrat służy skrobia podhydrolizowana bakteryjnymi alfa-amylazami do dekstranu, lub syrop kukurydziany. Reakcja trwa 24 godziny. Oczyszczanie: klaryfikacja, oddzielanie od biomasy, dekoloryzacja, krystalizacja, oczyszczanie na kolumnach jonowymiennych.

!Jest to drugi oprócz kwasu cytrynowego kwas organiczny uzyskiwany metodami fermentacyjnymi i produkowany na szeroką skalę.

Trzecim kwasem organicznym jest KWAS MLEKOWY.

Powstaje w wyniku fermentacji mlekowej, powoduje powstanie wielu walorów smakowych i zapachowych, tworzy odpowiednie środowisko do rozwoju innych mikroorganizmów fermentacji mlekowej.

Kwas mlekowy może występować jako forma L lub D, ale są też takie mikroorganizmy, które są na tyle „obrzydliwe”, że wytwarzają mieszaninę racemiczną.

Z punktu widzenia zastosowania kwasu mlekowego interesują nas formy optycznie czynne.

Wykorzystanie, zastosowanie:

50% - przemysł spożywczy - zakwaszasz i środek konserwujący

- przemysł farmaceutyczny - stearylomleczan

Jest bardzo mocnym i bardzo korozyjnym kwasem, dlatego rozprowadzany jest jako roztwór 50%, bądź 88%.

Proces produkcji jest prowadzony w taki sposób, że otrzymuje się roztwór rozcieńczony, gdyż takie stężenia (jak wyżej) są już zabójcze dla wszystkiego, co żyje.

Ze względu na silną korozyjność często rozprowadza się go w postaci pudrów lub proszków soli tego kwasu.

Jest syntonem w przemyśle farmaceutycznym - dlatego jest wymagany w formie optycznie czynnej.

Polimleczan, - czyli polimer tego kwasu jest bazą do otrzymywania biodegradowalnych tworzyw, wykorzystywanych m.in. do produkcji nici chirurgicznych (takich, które rozpuszczają się w organizmie - wykonuje się nimi wewnętrzne szwy i ulegają one następnie resorpcji).

Estry kwasów tłuszczowych i kwasu mlekowego są wykorzystywane jako środki emulgujące w piekarnictwie i kosmetyce.

Do produkcji celofanu.

Jako plastyfikatory do produkcji pewnych pestycydów - gdzie szkielet kwasu mlekowego jest wyjściowym do dalszych modyfikacji.

Duża część produkowana jest chemicznie, gdyż procesy fermentacyjne niosą ze sobą pewnego rodzaju ograniczenia jak pofermentacyjne odpady, czyli to, co niesie ze sobą zapach i kolor, jednak wszędzie tam gdzie potrzebny jest produkt naturalny wykorzystuje się produkt naturalnej fermentacji.

Proces fermentacyjny jest tańszy niż proces chemiczny, wykorzystuje on homofermentacje mlekową - nie interesują nas tu żadne dodatkowe substancje.

Mikroorganizmy zdolne do prowadzenia homofermentacji mlekowej (powstaje tylko i wyłącznie kwas mlekowy); Lactobacillus, seviococus(?) Streptococus. Na skalę przemysłową wykorzystuje się jednak grzyba: Phizopues oryzae(?) (ZAPAMIĘTAĆ GO!!!).

Wydajność procesu: 1 cząsteczka glukozy w procesie glikolizy i fermentacji daje 2 cząsteczki kwasu mlekowego. 100 gram glukozy daje 90 gram kwasu mlekowego.

Wybór grzyba a nie bakterii w tym procesie fermentacyjnym spowodowane było selektywnością procesu w stosunku do jednego z stereoizomerów, szybkością, efektywnością rozkładu taniego źródła węgla, minimalnym zapotrzebowaniem na inne składniki, wytrzymałością na niskie wartości pH (niskie pH spowodowane nagromadzaniem się kwasu mlekowego).

Produkcja przemysłowa:

- proces jest stacjonarny ( w biotechnologii bardzo rzadko wykorzystuje się proces ciągły).

- fermentory są drewniane lub z nierdzewnej stali, ze względu na wysoką korozyjność kwasu mlekowego.

- inokulum przygotowuje się w innym fermentorze lub stosuje się inokulum będące częścią biomasy pochodzącą z poprzedniego zakończonego już procesu.

- źródłem węgla jest sacharoza (cukier buraczany) albo serwatka (kolejne wykorzystanie dla serwatki jako odrzutu z produkcji sera!), dekstroza (dlatego wytwórnie kwasu mlekowego znajdują się przy cukrowniach).

- źródło azotu - musi być dość bogate: jest to albo ekstrakt drożdżowy lub namok kukurydziany.

- fermentacja trwa 1-2 dni, jeżeli zastosuje się serwatkę, - co stanowi 5% źródło cukru;

albo do 6 dni, jeśli źródło cukru jest bogatsze - 15% źródło cukru - wówczas źródłem cukru jest glukoza bądź sacharoza.

- oddzielenie biomasy, (czyli filtracja).

- oczyszczanie (chemiczne).

Spośród omówionych procesów w Polsce funkcjonują:

- Wołczyn, Maszewo -produkuje się osmofilne drożdże piekarnicze (osmofilne - wytrzymują duże stężenia cukrów, dzięki temu proste w stosowaniu przy produkcji pieczywa) są wynalazkiem Politechniki Łódzkiej; osmofilność u nich otrzymano dzięki fuzji protoplastów.

- BIOLACTA - szczepionki (startery) mleczarskie

- Leszno - produkcja kwasu mlekowego (system produkcji taki jak podano powyżej)

- Zgierz - firma CYTROKWAS - produkcja kwasu glukonowego

- POLFA-KRAKÓW, CUKROWNIA W WAŁCZU, firma BIOREK -produkcja kwasu cytrynowego.

Proces konwersji skrobi

(proces silnie związany z przemysłem spożywczym) (mamy potem wiedzieć, jakie enzymy i dlaczego wykorzystuje się w procesie konwersji skrobi)

Skrobia - polimer α-D- glukozy, polisacharyd zapasowy roślin, człowiek jest w stanie ją trawić. Głównym wiązaniem łączącym cząsteczki glukozy jest α-1-4- glikozydowe.

Skrobia jest polisacharydem niejednorodnym - składa się z dwóch frakcji:

- amyloza - od 300 do 1000 reszt glukozy, połączonych wiązaniem α-1-4- glikozydowe. Łańcuch amylozy ma strukturę drugiego rzędu - dzięki istnieniu wiązań wodorowych między sąsiadującymi grupami hydroksylowymi w cząsteczkach glukozy formują się pętle, struktura drugorzędowa amylozy jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między odpowiednimi grupami bocznymi w glukozie. Dlatego w czasie podgrzewania skrobi następuje rozbicie tych wiązań (kleikowanie skrobi - skrobia zmienia swój stan fizyczny).

- amylopektyna - obok wiązań α-1-4- glikozydowych występują wiązania α-1-6- glikozydowe, jest to rozgałęziony polimer glukozy.

Enzymy rozkładające skrobię są to enzymy AMYLOLITYCZNE - istnieją dwie grupy tych enzymów:

- α-AMYLAZY - endoglikozydazy - atakują cząsteczki od wnętrza, trawią wiązania α-1-4- glikozydowe, są nazywane enzymami dekstrynogennymi - bowiem w wyniku ich trawienia powstają większe fragmenty polisacharydowi - dekstryny. W wyniku działania α-amylazy powstają oligosacharydy zawierające 6-7 cząsteczek glukozy (na końcu powstaje maltoza).

- β-AMYLAZY - enzymy sacharogenne - egzoglikozydazy -atakują cząsteczkę polisacharydu od wolnego końca odcinając po dwie cząsteczki glukozy. W wyniku ich działania powstaje β-maltoza (jednostki dwuglukozowe) lub powstaje tzw. dekstryna graniczna (te amylazy nie są w stanie hydrolizować polisacharydy przy i za rozgałęzieniem). Powstała maltoza rozkładana jest przez enzym hydrolityczny, α-glukozydazę na dwie cząsteczki glukozy.

W procesie konwersji skrobi wykorzystuje się źródło cukru jako źródło czegoś, co jest słodkie. Np. ziemniaki słodkie nie są a przez konwersję mamy otrzymać coś, co jest słodkie z tych ziemniaków (glukoza też słodka nie jest).

Proces konwersji skrobi dotyczy jednego źródła skrobi (na tym źródle proces ten został opracowany), jest to konwersja skrobi kukurydzianej (opracowana w USA, spowodowane to było potrzebą uniezależnienia się USA od najbliższego źródła cukru, jakim była sacharoza z trzciny cukrowej pochodząca z Kuby). Do otrzymania cukrów (sacharozy - „czegoś, co jest słodkie” - do przemysłu spożywczego) posłużyła kukurydza, bo rośnie szybko nie jest wymagająca i jej nasiona mają dużo skrobi.

Amen.

3

Wykład -7-

Możliwości, jakie daje wykorzystanie fermentacji mlekowej.

---