Biotechnologia -W, koło biotechnologia, 1


1. Definicje: kultura in vitro, biotechnologia

Pojęcie biotechnologii

wykorzystanie techniki kultur in vitro

zastosowanie metod genetyki molekularnej do diagnostyki i selekcji

przenoszenie genów na drodze pozageneratywnej

Biotechnologia - zastosowanie wiedzy naukowej i inżynierii do przetwarzania organizmów , komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania dóbr i usług

Kultura in vitro -jest specyficznym sposobem uprawy materiału roślinnego w warunkach sterylnych, w różnego rodzaju pojemnikach.

Technika ta pozwala z małego fragmentu pobranego z organu rośliny uzyskać wzrost, rozmnożenie materiału i odtworzenie całej rośliny.

2. Metody otrzymywania form haploidalnych

Technika in vitro znalazła zastosowanie do:

otrzymywania form haploidalnych

rozmnażania wegetatywnego cennych materiałów

otrzymywania roślin wolnych od patogenów

kultury zarodków

kultury protoplastów (tworzenie mieszańców somatycznych)

selekcji w kulturach in vitro

produkcji metabolitów wtórnych, mikropropagacji i produkcji biomasy w bioreaktorach

otrzymywania roślin transgenicznych

Niezbędnymi warunkami prowadzenia kultury in vitro jest dobór właściwego materiału roślinnego, pożywki do jej uprawy i warunków zewnętrznych - oświetlenia i temperatury.

REDYFERENCJACJA

Bodźcem wyzwalającym odróżnicowanie w kulturach in vitro jest odizolowanie komórek i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce

Haploidy - organizmy o gametycznej liczbie chromosomów

Monoploidy - haploidy powstałe z organizmu diploidalnego

Polihaploidy - haploidy powstałe z organizmu poliploidalnego

Rośliny haploidalne w kulturach in vitro można otrzymać poprzez:

 kultury pylników i mikrospor

wykorzystując zjawisko eliminacji chromosomów w zarodkach mieszańców oddalonych

wykorzystując geny stymulujące proces powstawania form haploidalnych

- metodami chemicznymi

ADROGENEZA (Otrzymywanie haploidów w kulturach pylnikowych drogą androgenezy)

1. Jest to proces złożony, zależny od wielu czynników:

stanu fizjologicznego rośliny, z której pobierane są pylniki

sposobu traktowania ściętych kłosów przed wyłożeniem pylników na pożywkę

stadium rozwojowego pyłku

komponentów pożywek indukcyjnych i regeneracyjnych

warunków fizycznych hodowli pylników

2. Istnieją dwa zasadnicze kierunki rozwoju androgenicznego

bezpośredni rozwój mikrospory w zarodek. W ciągu 4-8 tygodni z zarodków pojawiają się rośliny

pośredni poprzez kalus

3. WYKORZYSTANIE FORM HAPLOIDALNYCH

Wykorzystanie form haploidalnych i linii podwojonych haploidów w hodowli umożliwia skrócenie cyklu hodowlanego oraz zapewnia homozygotyczność form wyjściowych

Haploidy można wykorzystać w hodowli roślin jeśli:

 metodyka produkcji haploidów jest wydajna

rośliny haploidalne powstają w sposób losowy (odpowiadają losowej segregacji gamet)

znane są efektywne metody podwajania liczby chromosomów

LINIE DH

Linie podwojonych haploidów (linie DH) są to formy powstałe w wyniku podwojenia liczby chromosomów u haploidów.

Podwajanie liczby chromosomów u haploidów przeprowadza się najczęściej przy użyciu kolchicyny.  

4. Uwalnianie roślin od wirusów

1. Metody eliminowania wirusów

a) Kultura in vitro merystemów

b) Chemoterapia

c) Termoterapia

d) Krioterapia

W obrębie rośliny zainfekowanej znajdują się komórki, grupy komórek a nieraz tkanki, w których nie można wykryć wirusa.

Możliwość uwolnienia od wirusów roślin rozmnażanych wegetatywnie zapoczątkowało lawinowy rozwój kultury merystemów.

Opracowano procedury izolacji odpowiednio małych wierzchołków pędu

2. Etapy odwirusowywania roślin drogą izolowanych merystemów

a) Odkażanie materiału roślinnego

b) Inkubacja w temp. 18-22 stopni C na świetle

c) Pasaże co 2-3 tygodni

d) Przesadzanie roślin do ziemi

e) Testowanie na zdrowotność

3. Rodzaje kultury merystemów stosowane w procedurze odwirusowywania

a). Podział roślin na sadzonki węzłowe

* Technika przydatna w masowej produkcji roślin ozdobnych i sadowniczych.

* Polega na pocięciu rośliny na fragmenty zawierające pęd z węzłem oraz znajdującymi się w węźle liśćmi oraz pąkami bocznymi.

* Uzyskane sadzonki węzłowe pasażuje się na kolejne pożywki.

* Szeroko wykorzystywane w mikrorozmnażaniu Astromeria, Cymbidium, Gloriosa

b). Kultura poliferujących zarodków

* Poprzez dodanie do pożywki cytokinin w dużym stężeniu uzyskuje się tzw. wieloroślinki. Ponowne podziały i pasaże pozwalają na uzyskanie tysięcy roślin potomnych.

* Szeroko stosowana do rozmnażania Dianthus, Chrysanthemum, Rosa multiflora i wielu innych.

c). Za pośrednictwem kalusa

4. Wirusy uporczywe

Istnieją wirusy tzw. uporczywe, do których zwalczania konieczne jest zastosowanie w kulturach in vitro dodatkowo innych procedur.

5.

Chemoterapia

Chemoterapia polega na dodaniu do pożywki tzw. antymetabolitów, czyli substancji o wysokiej aktywności przeciwwirusowej.

Są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich rozmnażanie się.

6. Terapia in vitro

Pod wpływem długotrwałego działania podwyższoną temperaturą ( w granicach 26-45 stopni C. w czasie od 1-3 miesięcy) następuje inaktywacja wirusów w tkankach rośliny.

Terapii cieplnej poddaje się całe rośliny lub ich organy wegetatywne.

Po zakończeniu procesu termoterapii, z roślin tych pobiera się tkanki merystematyczne i dalej prowadzi kulturę in vitro w celu uzyskania roślin.

Metoda ta znalazła zastosowanie między innymi do odwirusowywania chryzantem i goździków.

7. Krioterapia

jest to działanie niskimi temperaturami (0d +1-4 stopni)

Napisz wszystko co wiesz na temat rozmnażania na skalę wielkotowarową

5. Mikrorozmnażanie roślin na skalę wielkotowarową

1. Kwalifikowany materiał rozmnożeniowy

* Uzyskany na drodze mikrorozmnażania materiał musi być wolny od patogenów.

*

Producent powinien wydać certyfikat międzynarodowy (ISO-9001 lub HACCP) gwarantujący jakość produktu jak i zachowania odpowiednich procedur w procesie produkcji

2. Materiał rozmnożeniowy musi spełniać jakościowe normy genotypu

OWT (oryginalność, wyrównanie, trwałość)

Prawidłowa kondycja roślin

Adaptacyjność rozwojowa

3. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne eksplantatów

Patogeny (bakterie, mikoplazmy, grzyby)

Epifity zasiedlające powierzchnię organów:

* mikoplazmy (charakteryzują się brakiem ściany komórkowej)

* bakterie

* grzyby

4. Bakterie epifityczne

Bakterie gramujemne na ogół stymulują mechanizmy odpornościowe roślin na niesprzyjające warunki środowiska, oraz mechanizmy obronne na patogeny grzybowe i bakterie

Występują zarówno pojedynczo jak i w grupach często w trudno dostępnych miejscach (pod łuskami przylistkami, w pąkach itp..).

Trudne do dezynfekcji.

5. Endofity

są to: grzyby i bakterie przeżywające większą część życia wewnątrz organizmów. Często uważa się, że żyją w symbiozie z rośliną.

Przykłady: bakterie tzw. brodawkowe (Acetobacter)

Bakterie wydzielające toksyczne dla owadów i nicieni metabolity (lolitrem B i ergowalinę).

Ochraniają rośliny przed tymi organizmami

6. Zapobieganie infekcji materiału w stadium początkowym kultury in vitro

Pojawiające się w początkowym okresie kultury in vitro drobnoustroje na eksplantatach lub pożywce są wnoszone z eksplantatami

Zapobieganie:specjalne traktowanie roślin w fazie prekultury(poprzedzającej pobieranie eksplantatów)tzw.stadium „0”

„Punkty kontrolne” i etapy pracy w procesie mikrorozmnażania wielkotowarowego

1. Prekultury

2. Stabilizacja eksplantatów

3. Namnażanie eksplantatów

4. Przygotowanie do wzrostu in vivo

5. Aklimatyzacja

6. Testowanie

Ad. 1.

Prekultura - zespół zabiegów pozwalających otrzymać odmłodzone eksplantaty , częściowo lub całkowicie wolne od patogenów.

Selekcja wartościowych okazów, które będą podlegały klonowaniu

1. Zabezpieczenie roślin przed infekcją (opryski, sposób podlewania)

2. Zidentyfikowanie bakterii i grzybów Test ELISA, PCR i inne)

3. Przygotowanie rośliny , części roślin lub eksplantatów do kultury in vitro, termoterapia

4. Dezynfekcja powierzchniowa

5. Dezynfekcja wewnętrzna (np. zieleń malachitowa)

6. Stosowanie fungicydów i pestycydów

Ad. 2

Stabilizacja eksplantatów

Cel: uzyskanie zdrowych eksplantatów poprzez zapobieganie infekcją.

Na tym etapie prac szczególną uwagę zwraca się na:

umiejętną sterylizację

sprawny sprzęt (kontrola sterylności pomieszczeń, stołów laminarnych)

eliminację eksplantatów zaatakowanych patogenami

indeksację roślin matecznych

Indeksacja roślin matecznych

Indeksację na obecność patogenów można przeprowadzać bezpośrednio na roślinach matecznych lub/i eksplantatach

Dwustopniowość kontroli poprzez testowanie roślin matecznych i test izolowanych z nich eksplantatów stanowi wystarczającą gwarancję , że nie będą namnażane tkanki z bakteriami wolno rosnącymi lub trudnymi do wykrycia

Na podstawie obecności bakterii lub grzybów w eksplantatach w fazie stabilizacji kultury można wnioskować stanie zdrowotności roślin donorowych.

Pozwala na eliminację z mateczników roślin chorych, a w szczególności roślin zainfekowanych patogenami kwarantannowymi (np. Phytophthora, Xanthomonas)

Indeksacja pozwala więc ograniczyć liczbę eksplantatów odrzucanych w procesie produkcji z powodu zainfekowania patogenami

Metody identyfikacji patogenów

obserwacje właściwości fizjologicznych i biochemicznych na pożywkach wybiórczo-różnicujących

* testy bakteriologiczne oparte na wykorzystywaniu różnych źródeł węgla przez badane szczepy bakterii (kupuje się gotowe zestawy).

* techniki oparte na markerach molekularnych (PCR)

Ad. 3

Namnażanie roślin

Na tym etapie prac szczególną uwagę zwraca się na:

testowanie kultury in vitro na obecność patogenów (monitoring kultur)

kontrola procesu mikrorozmnażania (monitoring kultur)

Monitoring kultur

Produkcja wielkotowarowa musi być stale monitorowana mikrobiologicznie

Monitorowanie przeprowadza się poprzez testowanie fragmentów eksplantatów na specjalnej pożywce (pożywce testowej dla wykazania obecności bakterii lub grzybów).

Test ten pozwala na ujawnienie 50-70% wniesionych do pożywki z eksplantatem drobnoustrojów

Ad. 4

Biotyzacja- wprowadzenie do pożywki mikroflory korzystnej dla rozwoju roślin

Ad. 5

Aklimatyzacja- przygotowanie roślin do wysadzenia w szklarnii

Ad. 6.

Kontrola stabilności genetycznej i zdrowotności dla uzyskania certyfikatu

6. Kultury protoplastów

Protoplastem nazywamy komórkę roślinną pozbawioną ściany komórkowej, najczęściej wskutek trawienia enzymami.

Za pomocą łączenia protoplastów różnych gatunków można otrzymać mieszańce somatyczne między odległymi systematycznie roślinami.

Mieszańce somatyczne są to komórki i zregenerowane z nich rośliny otrzymane w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych

Kultury protoplastów pozwalają na

* otrzymywanie mieszańców somatycznych nie tylko przez połączenie jąder komórkowych, ale również przez zlanie się cytoplazmy partnerów, wnoszące dodatkowo cechy dziedziczone plazmatycznie (poprzez informację zawartą w mitochondriach i chloroplastach).

W procesie otrzymywania mieszańców somatycznych wyróżniamy następujące etapy:

* izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów form przeznaczonych do fuzji

* fuzja protoplastów spowodowana czynnikami powodującymi bezpośredni kontakt błon protoplastów (czynnikami chemicznymi lub elektrofuzją), ich odwracalne niszczenie i odbudowanie

* identyfikacja i selekcja komórek mieszańcowych

* kultura in vitro komórek mieszańcowych i regeneracja roślin.

Bezpośrednio po fuzji cytoplazma komórek mieszańcowych zawiera wszystkie organelle obu komponentów fuzji.

Z upływem czasu skład takiej komórki znacznie się zmienia, tak że w końcu powstają na ogół komórki o składzie genetycznym znacznie różniącym się od wyjściowego.

7. Selekcja w kulturach in vitro

Warunkiem skuteczności selekcji w kulturze in vitro jest występowanie korelacji między reakcją komórki lub tkanki w kulturze, a reakcją otrzymanej z niej rośliny.

Selekcja jest prowadzona zazwyczaj przy użyciu czynnika selekcyjnego.

W przypadku hodowli odpornościowej mogą być to np. mykotoksyny a hodowli na suszę określone sole.

Zalety selekcji w kulturze in vitro

* możliwość oceny dużej liczby komórek lub osobników na małej powierzchni (przy założeniu iż istnieje szansa znalezienia korzystnego rekombinanta z częstotliwością 1:10000, u ogórka 10 płytek Petriego o średnicy 6 cm zastępuje 30 ha doświadczeń polowych)

* możliwość badania wielu osobników równocześnie

* uniezależnienie się od występowania interakcji genotypowo-środowiskowej

* ochrona środowiska przed szkodliwością czynnika selekcyjnego.

8. Zmienność somaklonalna

Otrzymane w wyniku mikrorozmnażania rośliny z tego samego genotypu

Mogą fenotypowo różnić się od siebie przez pewien czas lub na stałe.

Pojawienie się nowych cech u roślin uzyskiwanych z kalusa w hodowli tkankowej.

Zmienność taka jest wynikiem mutacji punktowych, translokacji chromosomowych.

Zmienność somaklonalna wywoływana kulturą in vitro jest indukowana na skutek wzrostu komórek, tkanek, zachodzenia procesu regeneracji itp. w oderwaniu od środowiska naturalnego jakim jest cały organizm rośliny

Źródła zmienności somaklonalnej

1. Zmienność w komórkach transplantatu pierwotnego

2. Zmienność wywołana kulturą in vitro

Zmienność w komórkach transplantatu pierwotnego

Eksplantaty mogą posiadać komórki o różnej ploidalności i zmutowane komórki somatyczne, które poza kulturą nie miałyby możliwości przekazania zmienionych cech drogą generatywną.

Podatność na zmienność somaklonalną zależy od:

1. Gatunku rośliny

* nie ulegają zmienności somaklonalnej lilia i hiacynt

* podatne: tytoń, trzcina cukrowa

2. Ploidalności (poliploidalne łatwiej ulegają zmianą)

3. Fragmenty poprane ze starszych fragmentów organów zwiększają częstotliwość pojawiania się zmienności somaklonalnej

4. Sposób prowadzenia kultury

* Pasaże

* Płynne pożywki

* Regulatory wzrostu (szczególnie 2,4D)

Zmienność somaklonów charakteryzuje się dużą niestabilnością a kierunek zmian nie jest możliwy do przewidzenia.

Selekcja pozytywna jest wykorzystywana w hodowli dla poszerzenia zakresu zmienności genetycznej

Zmienność somaklonalna wywiera niekorzystny wpływ na proces uzyskiwania roślin modyfikowanych genetycznie (GMO)

Odmiany wyhodowane z wykorzystaniem zmienności somaklonalnej

Najwięcej odmian roślin ozdobnych z wykorzystaniem zjawiska zmienności somaklonalnej wyhodowano u D. Grandiflora, Ficus sp., Orchids sp., Pelargonium sp., Syringa.,

9.

Kultura zarodków

Kultury zarodków wykorzystuje się w celu:

  przerwania okresu spoczynku nasion

przyspieszenia okresu rozwoju roślin

  uzyskania roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania

  otrzymania roślin mieszańcowych

otrzymania form haploidalnych

Przerwanie okresu spoczynku nasion

* Okres spoczynku nasion jest cechą indywidualną i charakterystyczną dla danego gatunku.

* W rodzaju Irys okres spoczynku wynosi do kilkudziesięciu miesięcy.

* Przerwanie okresu spoczynku nasion można uzyskać między innymi poprzez izolację zarodków z nasion na pożywki sztuczne.

Przyspieszenie okresu rozwojowego roślin

Wykorzystanie kultury in vitro do przyspieszenia okresu rozwojowego roślin coraz powszechniej wykorzystuje się w rodzaju Rosa.

Poprzez kulturę in vitro zarodków przyspiesza się kwitnienie i skraca cykl rozwojowy

Uzyskiwanie roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania
*Często w nasionach mieszańcowych bielmo ulega znacznym zaburzeniom w swoim rozwoju.

*Zarodek pozbawiony substancji odżywczych jakich dostarcza bielmo nie ma w warunkach naturalnych żadnych szans rozwoju.

*Przeniesienie takiego zarodka na pożywkę sztuczną zastępującą bielmo pozwala uzyskać wiele różnych mieszańców międzygatunkowych lub haploidów.

*W przypadku roślin ozdobnych metoda ta znajduje zastosowanie w hodowli róż.

Inne zastosowania:

otrzymywanie form haploidalnych

uzyskanie siewek z wielu drzew owocowych

ocena żywotności nasion m.in. roślin ozdobnych, krzewów i drzew owocowych

10. Kultura zalążków z zarodkami

W praktyce często zamiast izolować zarodki, przenosi się całe zalążki zawierające zarodki we wczesnych stadiach embriogenezy.

W przypadku roślin ozdobnych technika ta znalazła wykorzystanie w takich gatunkach jak Pisum, Helianthus, Glycine.

Technika ta jest szczególnie przydatna w produkcji siewek storczyków, z uwagi na bardzo małe nasiona tego gatunku.

Przykłady : Petunia, Alstromeria, Lilium, Helianthus, Glycine, Gossypium

11.Zapylanie in vitro zalążni i zalążków

Niezgodność gatunkowa często uniemożliwia uzyskanie metodami klasycznymi interesujących hodowcę form

Bariery niekrzyżowalności można omijać poprzez zapylanie in vitro zalążni lub zarodków

Pozwala to na:

* ominięcie barier samo niezgodności i uzyskanie nowych rekombinantów roślin

* uzyskanie poprzez indukcję partenogenezy form haploidalnych

Sposób postępowania:

Zapobieżenie niekontrolowanemu zapyleniu

Sterylizacja materiału (odpowiednich dla danego gatunku eksplantatów np. słupki, słupki z szypułką kwiatową i fragmentami okwiatu

Przygotowanie pyłku do zapylenia

Przykłady:Larix, Picea, Pinus, Cayophyllaceae, Liliaceae ,Malvaceae, Primulaceae

Kultura nie zapłodnionych zalążków

* Jest to metoda alternatywna do techniki uzyskiwania haploidów drogą androgenezy.

* Wykorzystuje się tu zjawisko gynogenezy, czyli rozwoju zarodków z nie zapłodnionych komórek gametofitu żeńskiego w warunkach kultury in vitro zarodków).

* U roślin ozdobnych stosunkowo łatwo jest uzyskać haploidy tą techniką u gerbery

Sztuczne nasiona

Produkt składający się z zarodka somatycznego lub zaczątku rośliny umieszczony w osłonce ochraniająco-odżywczej, zdolny do regeneracji roślin na skale komercyjną.

Najczęściej występują jako otoczkowane odwodnione zarodki somatyczne lub uwodnione zarodki w otoczce hydrożelowej



Wyszukiwarka