Podstawy cytometrii przeplywowej oznaczanie subpopulacji komorek

Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek

Przeciwciała (Ab)

- białka należące do frakcji gammaglobulin

syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty
B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla
rozpoznawanego Ag.

Przeciwciała monoklonalne (mAb)

- skierowane przeciwko jednej

determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce
wiązania Ag z Ab)

Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc

niebieskie

- łańcuchy ciężkie

ółte

- łańcuchy lekkie

ciemnoniebieskie/żółte - regiony zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony stałe

szare

- mostki dwusiarczkowe

CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

Odgrywa zasadniczą rolę w fenotypowaniu komórek
immunokompetentnych człowieka.

Jest to możliwe dzięki szerokiemu panelowi dostępnych
przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych
przeciwko obecnym na komórkach Ag różnicowania, CD
(cluster of differentiation), którymi znakuje się
struktury w zawiesinie komórek poddawanych analizie.

Ocena subpopulacji komórek tą techniką jest obiektywną
i powtarzalną metodą diagnostyczną.

CYTOMETR PRZEPŁYWOWY

CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

Analiza wieloparametrowa jednej
komórki w aparacie, w momencie
gdy ruch komórek w cieczy jest
uporz

dkowany

komórki si

nie zlepi

, b

oddzielne w słupie

na pojedyncz

komórk

pada

laser w komorze pomiarowej

PRZEPŁYW KOMÓREK W APARACIE

tu nakładamy

próbkę

fluorescencja

promie

lasera

ciecz osłaniająca

Purdue University Cytometry
Laboratories

MIERZONE PARAMETRY

Podstawowym pomiarem jest rejestrowanie światła
rozproszonego na komórce oraz światła wysyłanego przez
wzbudzony fluorochrom. Detektory mierzą światło rozproszone.

FSC (forward scatter)- pomiar światła rozproszonego, mierzonego w
przedłużeniu promienia lasera, światło pada prawie pod katem 0⁰-
charakteryzuje wielkość komórki

SSC (side scatter)- pomiar światła rozproszonego, mierzone pod kątem
90⁰- pozwala na analizę ziarnistości komórki

Oprócz parametrów opisujących rozproszenie światła, istotnym pomiarem
jest ocena intensywności fluorescencji FL (FL1, FL2…). Pomiar
fluorescencji zależy od autofluorescencji komórek oraz użytych fluorochromów.

Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek

BUDOWA CYTOMETRU

układ transportu cieczy powiązany z układem
powietrznym

układ optyczny: laser argonowy, filtry przepuszczające
promienie światła tylko o określonej długości

układ elektroniki: fotopowielacze, wzmaczniacze,
przetwornik analogowo- cyfrowy

DETEKTORY FLUORESCENCJI

laser

Fluorescence

detektor

przedni

detektory fluorescencji

(PMT3, PMT4 etc.)

STRUKTURALNE

rozmiar

kszta

cytoplazmatyczna ziarnisto

ść

zawarto

ść

barwnika np.: hemoglobina, barwniki

fotosyntetyczne, porfiryny

aminokwasy fluoryzuj

ce w bia

kach

np.:tryptofan

tyrozyna

zawarto

ść

DNA, RNA, wszystkich bia

ek, lipid

cukr

w powierzchniowych, antygen

OCENIANE PARAMETRY

FUNKCJONALNE

adunek powierzchniowy

ekspresja receptor

w powierzchniowych

integralno

ść

ony (

ywotno

ść

)

aktywno

ść

endocytarna

organizacja

cytoszkieletu

aktywno

ść

enzym

OCENIANE PARAMETRY

Zalety cytometrii:
- szybki, obiektywny i zautomatyzowany pomiar pojedynczych
komórek w du

ych populacjach komórkowych, z du

żą

powtarzalno

- wykrywanie

ladowych subpopulacji

- równoległa ocena kilku parametrów
- ilo

ciowa i jako

ciowa ocena stanu układu immunologicznego,

poszczególnych populacji

Wady:
- niemo

ść

korelacji wyników pomiarów fluorescencji z morfologi

komórek
- technika przygotowania materiału do bada

, wymagaj

ca izolacji

z tkanki pojedynczych komórek
- wysoki koszt bada

CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

FL1 (izotiocyjanian
fluoresceiny FITC)

(

PE)

Schematyczny rozkład leukocytów
na cytogramie FFC/SSC

Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek

Występowanie

Funkcja

CD2

Limfocyty T, tymocyty, komórki
NK

Adhezja T do APC,
kostymulacja

CD2R

Aktywowane limfocyty, NK

Aktywacja lim focytów T

CD3

Limfocyty T

Przekazywanie sygnału do
lim focytów T

CD4

Limfocyty T pomocniczne (Th),
monocyty (Mo), makrofagi (MØ),
tymocyty

Koaktywacja lim focytów
Th

CD8

Limfocyty T cytotoksyczne (CTL),
tymocyty

Koaktywacja lim focytów
CTL

CD14

Monocyty (Mo), granulocyty,
kom órki Langerhansa, makrofagi
(MØ)

Białko wiążące LPS

CD19

Limocyty B, komórki pre-B

Aktywacja i proliferacja
lim ofocytów B

CD20

Limocyty B, komórki pre-B

Kanał Ca

, regulacja,

aktywacja i proliferacja
lim focytów B

CD45

Leukocyty

Fosfataza tyrozynowa
biorąca udział w
przekazywaniu sygnałów

CD45RO

Aktywowane limfocyty T,
monocyty, makrofagi, granulocyty,
tymocyty

Markery limfocytów T
pamięci immunologicznej

Antygeny ró

nicowania CD

SUBPOPULACJE KOMÓREK

JEDNOJ

DROWYCH KRWI OBWODOWEJ

Podstawowe markery i cechy fenotypowe linii komórkowych

CD45

- marker wszystkich leukocytów

CD19, CD20

- markery limfocytów B

CD3, CD7

- markery limfocytów T

CD4

- marker limfocytów T pomocniczych

CD8

- marker limfocytów T supresorowych

CD56

- marker komórek NK

CD25, CD71, CD69 - markery aktywacji limfocytów
CD13, CD33

- markery ró

nicowania mieloidalnego

CD15

- marker granulocytów

CD14

- marker monocytów

CD34

- podstawowy marker komórek progenitorowych

(macierzystych)

MONOCYTY

mAb: CD45-FITC/CD14-PE

stanowi

2-4% wszystkich leukocytów

maj

zdolno

ść

do ruchu pe

zakowatego i mog

wydostawa

wiat

a naczy

krwiono

nych

po przej

ciu do tkanek dojrzewaj

i przekształcaj

w MØ

komórki

erne

ce oko

o 4 dni

SUBPOPULACJE KOMÓREK

JEDNOJ

DROWYCH KRWI OBWODOWEJ

LIMFOCYTY B

mAb: CD2-FITC/CD19-PE

postają i dojrzewają w szpiku

bardzo dużo limfocytów B występuje w czasie infekcji
bakteryjnych

wiążą Ag za pomocą receptora BCR, następnie przetwarzają go i
„wystawiają” na powierzchnię komórki w postaci kompleksu z
białkami MHC. Kompleks ten jest rozpoznawany przez swoisty
względem danego antygenu limfocyt T pomocniczy. Wtedy
dochodzi do transformacji blastycznej i powstaniu komórki
plazmatycznej produkującej Ab. Ag, które powodują taki typ
reakcji nazywamy

antygenami grasicozależnymi

. W odróżnieniu

od nich,

antygeny grasiconiezależne

nie wymagają obecności

limfocytów T pomocniczych i mogą bezpośrednio aktywować
limfocyty B.

SUBPOPULACJE KOMÓREK

JEDNOJ

DROWYCH KRWI OBWODOWEJ

LIMFOCYTY T

T pomocnicze - T helper (Th):



mAb: CD3-FITC/CD4-PE



wspomagają odpowiedź immunologiczną poprzez wydzielanie

mediatorów regulujących funkcje układu odpornościowego
(cytokin) lub poprzez bezpośredni kontakt z innymi
komórkami



trzy subpopulacje komórek Th: Th0, Th1 i Th2

T supresorowe (Ts):



mAb: CD3-FITC/CD8-PE



są odpowiedzialne za hamowanie reakcji immunologicznej

SUBPOPULACJE KOMÓREK

JEDNOJ

DROWYCH KRWI OBWODOWEJ

Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek

SUBPOPULACJE KOMÓREK

JEDNOJ

DROWYCH KRWI OBWODOWEJ

KOMÓRKI NATURAL KILLER (NK)

mAb: CD3-FITC/CD56-PE

posiadają właściwości cytotoksyczne

ważne w odporności przeciw komórkom nowotworowym oraz
komórkom zarażonym przez wirusy

działają nieswoiście (wykazują właściwości cytotoksyczne bez
wcześniejszej immunizacji)

OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU

ODPORNO

CIOWEGO

monitorowanie chorób autoimmunizacyjnych, leczenia
immunosupresyjnego, po przeszczepach, niedoborów odporno

ci,

głównie przez ocen

struktur powierzchniowych komórek, rzadziej

antygenów wewn

trzkomórkowych

IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
niezb

dne w monitorowaniu:

wrodzonych zaburzeń odpowiedzi humoralnej, związanych z

niedoborem limfocytów B: określa się liczbę komórek cechujących
się występowaniem markerów CD19/CD20, będących wykładnikiem
tej populacji

IMMUNOFENOTYPOWANIE
LIMFOCYTÓW

niezbędne w monitorowaniu:

- kondycji immunologicznej chorych z

nabytym niedoborem odporności (HIV
pozytywnych): ocena subpopulacji
limfocytów CD4 i CD8 oraz
współczynnika CD4/CD8 np.:

44%/27% - zdrowy (1,63)
7,7%/54% - pacjent z pełnoobjawowym

niedoborem odporności (0,14)

OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU

ODPORNO

CIOWEGO

CD8

C
D
4

LIMFOCYTY

CD4+CD8+

LIMFOCYTY CD4-

CD8+

Zakres wartości prawidłowych markerów komórek

jednojądrowych krwi obwodowej człowieka

Komórki-marker CD

Warto

ść

rednia

[%]

Zakres warto

[%]

CD4+

35-50

CD8+

25-45

CD3+

35-65

CD2

45-65

CD22

20-30

CD56

10-20

CD14

10-25

Wska

nik CD4/CD8

1,4

1,1-1,7

ANALIZA

CYTOMETRYCZNA

OCENA SUBPOPULACJI- pacjent1

Kontrola izotypowa

Limf.T CD4

Limf.T CD8

Limfocyty B

monocyty

Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek

OCENA SUBPOPULACJI- pacjent2

Kontrola izotypowa

LimfocytyT CD8

LimfocytyT CD4

Limfocyty B

monocyty

Komórki NK
(Natural Killer)