L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9 . . . W LABORATORI UM
|
Walidacja
metod badawczych
STRESZCZENIE Artykuł alidacja jest potwierdzeniem jakie parametry chcemy zwalidować,
przedstawia wymagania dotyczÄ…ce poprzez przedstawienie obiek- w jakim zakresie powinny siÄ™ znalez
ć,
walidacji metod badawczych, Wtywnego dowodu, że zostały ustalamy punkt odniesienia. Mogą być
defi nicje cech charakterystycznych spełnione wymagania dotyczące kon- to dane z dokumentu znormalizowa-
metod badawczych oraz sposoby kretnego zamierzonego użycia lub za- nego, inne z
ródło naukowe lub własne
przedstawiania dowodów na spełnienie stosowania. doświadczenie laboratorium. Analitycy
wymagań dotyczących konkretnego Przez dowód obiektywny należy stosujący np. spektrofotometryczne
zastosowania metody badawczej. rozumieć dane potwierdzające istnie- metody badawcze i walidujący kolej-
SA
OWA KLUCZOWE walidacja, nie lub prawdziwość czegoś, a uzyskać ną taką metodę wiedzą, jakiego rzędu
granica oznaczalności, granica go można poprzez obserwację, pomiar powtarzalności czy niepewności mogą
wykrywalności, liniowość, niepewność, lub badanie. Czym jest wymaganie? się spodziewać.
obciążenie, odchylenie standardowe, Norma PN-EN ISO 9000:2006 określa 2. Sprawdzenie, czy powyższe ściśle
odtwarzalność, powtarzalność, precyzja, w ten sposób potrzebę lub oczekiwanie, określone wymagania mogą zostać
specyficzność, selektywność które zostało ustalone, jest obowiązko- spełnione w przypadku zastosowania
we lub wynika z praktyki organizacji, jej danej metody.
SUMMARY The article presents klientów lub innych stron zainteresowa- 3. Stwierdzenie przydatności metody oraz
requirements concerning validation nych. Określenie  zwalidowany oznacza dopuszczenie jej do stosowania.
of research methods, defi nitions of związany z walidacją status, a walidację Dodatkowe wymagania odnośnie do
characteristic features of research methods, można przeprowadzić w warunkach walidacji metod mikrobiologicznych na-
as well as ways of presenting evidence rzeczywistych lub symulowanych. Jakie kłada dokument EA-04/10 Akredytacja
of fulfi lling the requirements concerning wymagania nakłada norma PN-EN ISO/ laboratoriów mikrobiologicznych.
a specifi c use of a research method. IEC 17025:2005 Ogólne wymagania doty- Walidacja powinna jak najlepiej od-
KEY WORDS validation, limit czące kompetencji laboratoriów badawczych zwierciedlać warunki rzeczywiste dla me-
of quantifi cation, limit of detection, i wzorcujących? tody. Idealnie, gdy jest oparta o próbki
linearity, uncertainty, bias, standard Laboratorium powinno przeprowadzić naturalne w całym zakresie badawczym.
deviation, reproducibility, repeatability, walidację metod nieznormalizowanych, Uzyskanie takich próbek środowiskowych
precision, specifi ty, selectivity metod znormalizowanych wykorzysty- nie zawsze jest możliwe lub wymaga bar-
wanych poza przewidzianym dla nich dzo długiego czasu, laboratoria stosują
zakresem oraz metod znormalizowanych, więc próbki kontaminowane za pomocą
które zostały poszerzone lub zmodyfiko- certyfikowanych wzorców fizykochemicz-
wane. Jednakże z praktyki laboratoryjnej nych lub mikrobiologicznych kultur
wynika, iż laboratoria poddają walidacji odniesienia. Jednakże analityk zawsze
również metody znormalizowane, stoso- powinien mieć świadomość, że dodatek
wane w przewidzianym przez nie zakre- do matrycy jest jedynie imitacjÄ… obecno-
sie. Walidacja powinna być wykonana ści naturalnie występujących substancji.
w takim zakresie, jaki jest konieczny Zgodnie z PN-EN ISO/IEC 17025:2005
dla zamierzonego stosowania. Dzięki oraz dokumentem EA-04/10 proces wa-
danym uzyskanym z walidacji labora- lidacji wymaga sprawdzenia cech charak-
torium może ustalić rzeczywisty zakres terystycznych dla metody analitycznej,
(granice oznaczalności i wykrywalności), podanych w tabeli 1.
oszacować niepewność oraz nadać ramy
dla wewnętrznej kontroli jakości badań. NIEPEWNOŚĆ
W celu prawidłowego przeprowadzenia WYNIKU POMIARU
walidacji należy wyróżnić trzy etapy: Niepewność to parametr związany z wy-
mgr inż. Agnieszka Salata
1. Specyfikacja wymagań i określenie cech nikiem pomiaru charakteryzujący rozrzut
ODDZIAA
LABORATORYJNY
POWIATOWA STACJA SANITARNOºöEPIDEMIOLOGICZNA W ZGORZELCU charakterystycznych metod. Ustalamy, wartoÅ›ci, które można w uzasadniony
16
. . . W LABORATORI UM L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9
|
WYMAGANIA DOKUMENTU EAºö4/10
WYMAGANIA PNºöEN ISO/IEC 17025:2005
METODY JAKOÅšCIOWE METODY ILOÅšCIOWE
Specyficzność Specyficzność Niepewność wyniku
Względna poprawność Czułość Liniowość
Odchylenie dodatnie i ujemne Względna poprawność Odporność na czynniki zewnętrzne
Granica powtarzalności
Granica wykrywalności Odchylenie dodatnie i ujemne
i/lub odtwarzalności
Efekt matrycowy Powtarzalność
Powtarzalność i odtwarzalność Odtwarzalność
Granica oznaczalności
Tabela 1. Wymagania dokumentu EA-4/10 oraz PN-EN ISO/IEC 17025:2005 dla procesu walidacji
sposób przypisać wielkości mierzonej konać pomiaru spektrofotometrycznego kami badania otrzymanymi w ustalonych
(PN-ISO 10012:1998). w różnym czasie trwania reakcji barwnej. warunkach. Za miarę precyzji przyjmu-
Metody szacowania niepewności po- Istotne jest, by w jednym czasie badać je się zwykle odchylenie standardowe
miaru podano w artykule (12). zmianę tylko jednej wartości. wyników badania lub współczynnik
zmienności. Im większe jest odchylenie
LINIOWOŚĆ WARUNKI standardowe, tym mniejsza jest precyzja.
Liniowość jest zakresem metody badaw- POWTARZALNOŚCI Aby oszacować odchylenie standardowe,
czej, w którym sygnał wyjściowy jest I ODTWARZALNOŚCI należy dokonać minimum 15 serii pomia-
proporcjonalny do oznaczanego stęże- Warunki powtarzalności to takie warun- rów, w których czynnikiem zmienności
nia substancji. Możemy mieć pewność, ki, w których niezależne wyniki badania będzie czas, np. w ciągu 10 dni. Należy
że metoda badawcza jest liniowa i zawiera takich samych obiektów są otrzymane zastosować wzór:
cały badany zakres stężeń, gdy współ- za pomocą tej samej metody, w tym sa-
n
2
1
s xi x
czynnik nachylenia jej krzywej wzorcowej mym laboratorium, przez tego samego

n 1
i 1
jest większy bądz
równy 0,999. Możemy analityka, z użyciem tego samego wy-
go obliczyć ze wzoru na funkcję liniową posażenia, w krótkich odstępach czasu. gdzie n jest liczbą serii pomiarów, xi to i-ty
y = bx + a, gdzie y to sygnał pomiarowy Warunki odtwarzalności dotyczą róż- wynik, natomiast x to wartość średnia
(np. absorbancja), x  stężenie analitu, nych laboratoriów, różnych operatorów wyników.
a  współczynnik przesunięcia, natomiast oraz różnego wyposażenia. Warunki Dla metod mikrobiologicznych pre-
b to poszukiwany przez nas współczynnik powtarzalności pośredniej, najczęściej cyzję możemy wyrazić poprzez względne
nachylenia prostej, zwany też współczyn- spotykane w praktyce laboratoryjnej, odchylenie standardowe:
nikiem kierunkowym. to takie warunki, w których niezależne
S
RSD
wyniki badania takich samych obiek-
x
ODPORNOŚĆ tów są otrzymane za pomocą tej samej
NA CZYNNIKI ZEWN
TRZNE metody, w tym samym laboratorium, gdzie S jest odchyleniem standardowym,
By udowodnić, że metoda badawcza speł- z użyciem tego samego wyposażenia, a x  średnią liczbą jednostek tworzą-
nia wszystkie wymagania odnośnie do wła- przez różnych operatorów, w dłuższych cych kolonie. RSD wyrażone w procen-
ściwego jej stosowania, należy wyodrębnić odstępach czasu. tach jest współczynnikiem wariancji
te jej etapy, których zmiana może mieć (zmienności).
wpływ na wynik badania. Mogą to być ODCHYLENIE
"
CV % RSD *100%
warunki panujÄ…ce w cieplarce, wahajÄ…ce STANDARDOWE
siÄ™ np. w zakresie 37 Ä… 1°C, gdy tymcza- POWTARZALNOÅšCI
sem metoda badawcza wymaga hodowli I ODTWARZALNOÅšCI GRANICA POWTARZALNOÅšCI
w temperaturze 37 Ä… 0,5°C. Może to być Odchylenie standardowe wyników badania I ODTWARZALNOÅšCI
również czas, który jest potrzebny na zaj- otrzymanych w spełnionych warunkach Granica powtarzalności to wartość, któ-
ście reakcji barwnej w analizie chemicznej. powtarzalności jest miarą rozrzutu roz- rej z prawdopodobieństwem 95% nie
W pierwszym przypadku, jeżeli nie mamy kładu wyników badania. Podobnie mogą przekracza wartość bezwzględna różnicy
możliwości ustawienia stabilności tempe- być określone wariancja powtarzalności między dwoma wynikami badania otrzy-
ratury w cieplarce na 37 Ä… 0,5°C, należy i współczynnik zmiennoÅ›ci powtarzal- manymi w speÅ‚nionych warunkach powta-
udowodnić, że temperatury 36°C oraz noÅ›ci, które również mogÄ… być używane rzalnoÅ›ci. GranicÄ™ powtarzalnoÅ›ci oznacza
38°C nie majÄ… wpÅ‚ywu na liczbÄ™ wy- jako miary rozrzutu wyników badania. siÄ™ zwykle przez r. Granica odtwarzalnoÅ›ci
rosłych kolonii. Dokonać tego można Odchylenie standardowe odtwarzalności wymaga spełnienia warunków odtwarzal-
poprzez procentowe porównanie liczby jest natomiast miarą rozrzutu wyników ności, a oznacza się ją literą R.
kolonii wyrosłych na podłożu dla każdej w warunkach odtwarzalności. Powtarzal- W praktyce laboratoryjnej wymaga
z tych temperatur z liczbą kolonii dla ność i odtwarzalność wyrażają precyzję się sprawdzenia zaobserwowanej różnicy
temperatury 37°C. W przypadku poda- metody badawczej, która jest stopniem pomiÄ™dzy dwoma (lub wiÄ™cej) wynikami
nej reakcji fizykochemicznej można do- zgodności pomiędzy niezależnymi wyni- badania, i dlatego bardziej potrzebna
17
L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9 . . . W LABORATORI UM
|
jest pewna wartość krytyczna tej różnicy Druga sytuacja zachodzi, gdy w labo- obecność jednostki tworzącej kolonię
niż odchylenie standardowe. Odchylenie ratorium w warunkach powtarzalności (jtk), lub najmniejsza liczba jtk możliwa
standardowe takiej różnicy to: otrzymano n wyników badania, z któ- do wykrycia w danej objętości matrycy.
rych uzyskano średnią arytmetyczną
. Natomiast nieznany jest składnik OBCI
ŻENIE,
y
s n
obciążenia pochodzący z laboratorium BA

D SYSTEMATYCZNY,
gdzie n = 2 dla dwóch wyników badania. i należy dokonać porównania z wartością POPRAWNOŚĆ
W praktyce statystycznej stosuje siÄ™ odniesienia µ0 poprzez zastosowanie od- Obciążenie jest różnicÄ… miÄ™dzy wartoÅ›ciÄ…
różnicÄ™ krytycznÄ…: chylenia standardowego różnicy | - µ0|. oczekiwanÄ… wyników badania a przyjÄ™tÄ…
y
Różnica krytyczna wynosi teraz: wartością odniesienia. Jest to błąd syste-
fs n matyczny, w odróżnieniu od błędu loso-
1 n 1
wego. W oparciu o materiał odniesienia
CD (2,8sR )2 (2,8sr )2

n
gdzie f to współczynnik rozstępu kry- 2 możemy dokonać oszacowania błędu
tycznego. systematycznego. Analiza materiału od-
Zakładając rozkład normalny i poziom ZAKRES ROBOCZY niesienia i porównanie uzyskanej śred-
prawdopodobieństwa 95%, wartość f wy- Zakres roboczy to przedział, w którym niej z wartością deklarowaną przez np.
nosi 1,96, czyli f 2 = 2,8. Można zatem można stosować metodę badawczą z ak- producenta certyfikowanego materiału
" s. Dzię- ceptowalną precyzją, dokładnością oraz pomoże odpowiedzieć na pytanie, jakie
zależność tę przedstawić jako 2,8
ki tym przekształceniom otrzymujemy liniowością. Dla metod fizykochemicz- jest obciążenie metody (bias) wewnątrz
wzory opisujące granicę powtarzalności nych dolna granica zakresu może odpo- laboratorium. Bias można oszacować
i odtwarzalności: wiadać granicy oznaczalności. Czym jest również poprzez analizę wyników badań
granica oznaczalności (limit of quantifi- międzylaboratoryjnych, jednak powinny
R = 2,8 S oraz R = 2,8 S cation)? Jest to najmniejsze stężenie lub być to badania odnoszące się do warto-
r R
najmniejsza liczba mikroorganizmów ści zadanej przez organizatora badań,
Ustaliliśmy już odchylenie standardowe możliwa do ilościowego oznaczenia a nie odnoszące się do średniej uzyska-
na podstawie minimum 15 serii pomia- daną metodą z określoną precyzją oraz nej przez wszystkie laboratoria biorące
rowych. Jeżeli w dalszej praktyce chcemy dokładnością. Z granicą oznaczalności udział w porównaniach.
ocenić dwa pojedyncze wyniki badania, związana jest granica wykrywalności (limit
otrzymane w warunkach powtarzalności of detection). Jest to najmniejsze stężenie CZUA
OŚĆ, SELEKTYWNOŚĆ,
lub odtwarzalności, dokonujemy ich po- lub najmniejsza liczba mikroorganizmów SPECYFICZNOŚĆ
równania z powyższymi granicami. możliwa do wykrycia za pomocą danej Czułość określa, jaką najmniejszą różni-
Zaleca się, aby wartość bezwzględna metody badawczej. Granica wykrywalno- cę, odpowiedz
czynnika na metodÄ™ ba-
różnicy pomiędzy dwoma wynikami nie ści może być wyznaczona na podstawie dawczą jesteśmy w stanie stwierdzić. Np.
przekraczała granicy powtarzalności. Jeżeli odchylenia standardowego z 10 pomia- w przypadku spektrofotometrycznych me-
to wymaganie jest spełnione, oba wyniki rów próbki ślepej. Jeśli próbka ślepa nie tod fizykochemicznych zależność ta jest
uznaje się jako akceptowalne, a ich śred- zawiera poszukiwanego czynnika, można liniowa, a jej miarą jest współczynnik
nia arytmetyczna może być podana jako dodać do próbki minimalną wykrywalną nachylenia krzywej wzorcowej, i z niego
wynik końcowy. Innego sposobu działania ilość wzorca. Wzbogacamy próbę ślepą możemy obliczyć czułość metody.
wymaga sytuacja, gdy należy wyliczyć gra- o określone minimalne stężenie wzorca Selektywność/specyficzność daje nam
nice w oparciu o więcej niż dwie wartości. (może to być stężenie znajdujące się w po- odpowiedz
, jak dokładnie nasza metoda
Możemy mieć do czynienia z dwoma przy- łowie między 0 a punktem 1 na krzywej badawcza jest w stanie wytypować poszuki-
padkami. Pierwszy przypadek ma miejsce, wzorcowej). Trzykrotne odchylenie stan- waną przez nas cechę w złożonej matrycy
gdy w laboratorium w warunkach powta- dardowe będzie interesującą nas granicą oddziałującej w różny sposób na obiekt
rzalności przeprowadzono dwie grupy wykrywalności (LOD), która pomoże nam poszukiwań. Norma ISO/TR 13843:2000
pomiarów i w pierwszej z nich otrzymano wyznaczyć granicę oznaczalności (LOQ) proponuje dla metod mikrobiologicznych
n1 wyników o średniej arytmetycznej y1, za pomocą zależności: określenie czułości, specyficzności oraz
a w drugiej grupie  n2 wyników o śred- selektywności poprzez wykonanie analizy
"
niej y2 . Wtedy odchylenie standardowe LOQ = 3* LOD płytki z pojedynczymi koloniami. Nale-
różnicy ( y1 - y2 ) wynosi: ży dokonać potwierdzeń właściwych dla
W przypadku analiz chromatograficznych metody badawczej i policzyć, ile kolonii

1 1
2 możliwe jest wyznaczenie granicy wykry- prawidłowo uznano za poszukiwane (a),

s sr
n1 n2
walności i oznaczalności na podstawie ile kolonii uznanych za nietypowe okazało

szumów urządzenia pomiarowego. Dla się poszukiwanymi (b), ile kolonii uznano
zaś różnica krytyczna dla | y1 - y2 | metod fizykochemicznych granica ozna- za poszukiwane, a nimi nie było (c), oraz
wynosi: czalności może być pierwszym punktem ile kolonii nietypowych okazało się po-
na krzywej wzorcowej. W przypadku me- szukiwanymi przez nas. Wtedy za czułość
1 1
tod mikrobiologicznych granicą wykry- metody możemy przyjąć iloraz a/(a+b),
CD 2,8sr
2n1 2n2
walności będzie najmniejsze rozcieńcze- specyficzność to d/(c+d), natomiast se-
nie, w jakim jesteśmy w stanie stwierdzić lektywność to log[(a+c)/n].
18
. . . W LABORATORI UM L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9
|
byt restrykcyjne
Zwymagania nałożone
w procesie walidacji powodujÄ…
złożoną wewnętrzną kontrolę
jakości badań, a co za tym
idzie  problemy w utrzymaniu
założonego poziomu jakości.
ODZYSK a co za tym idzie  problemy w utrzymaniu
4. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-
Odzysk informuje nas, jaki wpływ na wy- założonego poziomu jakości, które pro- prawność i precyzja) metod pomiarowych
nik badania mają metoda badawcza oraz wadzą do częstych kalibracji, sprawdzeń, i wyników pomiarów  Część 4: Podstawowe
metody wyznaczania poprawności standardowej
badana matryca  czy powodujÄ… straty a wreszcie rewalidacji metody badawczej.
metody pomiarowej.
obiektu analizowanego. Do próbki badanej Może tak się zdarzyć, gdy walidacja jest
5. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-
możemy dodać fizykochemiczne certyfi- oparta o próby kontaminowane, a nie
prawność i precyzja) metod pomiarowych
kowane wzorce odniesienia lub ilościowe rzeczywiste. Wtedy rutynowa analiza
i wyników pomiarów  Część 5: Alternatyw-
mikrobiologiczne kultury odniesienia i na- próbek rzeczywistych weryfikuje warto-
ne metody wyznaczania precyzji standardowej
stępnie dokonać analizy zgodnie z meto- ści ustalone w czasie walidacji. Jednakże
metody pomiarowej.
dą badawczą. Dzięki znajomości stężenia
doskonała znajomość metody badawczej
6. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-
wzorca lub ilości bakterii wyjściowych oraz
oraz jej wymagań i ograniczeń sprawia,
prawność i precyzja) metod pomiarowych
wyniku naszej analizy możemy obliczyć
iż nadzorowane są wszystkie czynniki
i wyników pomiarów  Część 6: Stoso-
odzysk za pomocą prostej zależności:
mające wpływ na jakość wykonywanych
wanie w praktyce wartości określających
badaÅ„ i ostatecznie na wynik badania.qð
dokładność.
odzysk = (Xk  X0)/Xw
7. Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów
Piśmiennictwo analitycznych. Praca zbiorowa, WNT, War-
gdzie: Xk to stężenie w próbce kontamino- 1. PN-ISO 5725-1:2002 Dokładność (po- szawa 2007.
prawność i precyzja) metod pomiarowych 8. Dobecki M.: Zapewnienie jakości analiz
wanej, X0  stężenie w próbce przed konta-
i wyników pomiarów  Część 1: Ogólne za- chemicznych. IMP, A
ódz
2004.
minacją, natomiast Xw to stężenie wzorca.
sady i definicje. 9. PN-EN ISO/IEC 17025:2005/Ap1:2007
Odzysk należy wyrazić procentowo.
2. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po- Ogólne wymagania dotyczące kompeten-
prawność i precyzja) metod pomiarowych cji laboratoriów badawczych i wzorcu-
PODSUMOWANIE
i wyników pomiarów  Część 2: Podsta- jących.
Analityk musi mieć świadomość, jakie pa-
wowa metoda określania powtarzalności 10. PN-EN ISO 9000:2006 Systemy zarządza-
rametry są niezbędne w procesie walidacji
i odtwarzalności standardowej metody nia jakością  Podstawy i terminologia.
metody analitycznej. Każdy dodatkowy
pomiarowej. 11. EA-04/10 Akredytacja laboratoriów mikro-
parametr wymaga czasu i generuje ramy
3. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po- biologicznych.
dla wewnętrznej kontroli jakości badań.
prawność i precyzja) metod pomiarowych 12. Salata A.: Szacowanie niepewności pomia-
Zbyt restrykcyjne wymagania nałożone
i wyników pomiarów  Część 3: Pośrednie ru w badaniach fizykochemicznych i mikro-
w procesie walidacji powodują złożo- miary precyzji standardowej metody pomia- biologicznych.  Laboratorium  Przegląd
ną wewnętrzną kontrolę jakości badań, rowej. Ogólnopolski , 2009, 3, 28-32.
19
fot. Shutterstock