1

BIOMATERIAŁY

OPRACOWANIE DO PIERWSZEGO KOLOKWIUM

2

SEMINARIUM I

Zajęcia wprowadzające

Podstawowe pojęcia:

Biomateriał - to każda substancja, inna niż lek lub kombinacja substancji syntetycznych i naturalnych, która może
być użyta w całości lub jako część układu, w celu uzupełnienia lub zastąpienia narządu albo jego części lub przyjęcia
czasowego bądź na stałe jego funkcji.

Biomateriał - To materiał syntetyczny lub pochodzenia naturalnego stosowany do otrzymywania urządzeń
przeznaczonych do kontaktu z organizmem w celu częściowego lub całkowitego zastąpienia funkcji tkanek lub
narządów.

Inżynieria biomateriałów – interdyscyplinarna dziedzina wiedzy zajmująca się projektowaniem, wytwarzaniem i
optymalizacją materiałów dla medycyny.

Transplant - organ lub fragment tkanki pobrany od dawcy w celu zastąpienia ubytku u biorcy.

Implant – urządzenie medyczne wykonane z biomateriałów, które jest celowo wprowadzane do organizmu,
umiejscowione całkowicie lub częściowo poniżej powierzchni naskórka, w celu odtworzenia naturalnej funkcji lub
estetyki uszkodzonego organu.

Transplantacja – przeszczepianie tkanki lub organu w obrębie ciała jednego osobnika lub z osobnika na osobnika w
obrębie tego gatunku bądź pomiędzy różnymi gatunkami.

Rodzaje transplantacji :

•

autologiczna – dawca i biorca to te same osoby.

•

izogeniczna – identyczne genetycznie osobniki tego samego gatunku np. bliźnięta monozygotyczne.

•

allogeniczna – różne genetycznie osobniki tego samego gatunku.

•

ksenogeniczna – osobniki różnych gatunków.

Implantacja - wszczepienie sztucznego tworzywa (biomateriał) w obręb tkanki w celu jej zastąpienia, przywrócenia
ciągłości (zespolenia), przejęcia funkcji, wywołania procesu jej regeneracji lub wywołania innych procesów
mających na celu ratowanie zdrowia, życia lub poprawę jego komfortu.

Materiały z których wykonane są implanty:

•

Metaliczne - stal, tytan, stopy,

•

Polimerowe - sztuczne i biopolimery (resorbowalne, trwałe, hydrożele),

•

Ceramiczne - spiekane tlenki, HAP, bioszkło,

•

Węglowe - pokrycia, włókna, węgiel aktywny,

•

Kompozytowe.

3

Wymagania stawiane materiałom implantacyjnym:

•

Biozgodność (biokompatybilność

)

(Biozgodność mechaniczna, biozgodność mikrostrukturalna,

biozgodność chemiczna, elektryczna, magnetyczna)

Biozgodność (biokompatybilność) – to zdolność materiału do wywoływania odpowiedzi gospodarza
zgodnie z przeznaczeniem implantu.

Biomateriał jest biozgodny jeżeli nie wywołuje w tkankach działania:

Drażniącego

Immunologicznego

Alergicznego

Kancerogennego

Genotoksycznego

Teratogennego (Działanie teratogenne to działanie toksyczne substancji na zarodek lub płód).

•

Biofunkcyjność

Biofunkcyjność to zdolność materiału do przejmowania funkcji tkanek i narządów, do leczenia których został
zastosowany.

•

Bioaktywność

- zdolność powierzchni implantu lub powłoki na implancie, do przylegania bezpośrednio

do tkanki miękkiej lub twardej, bez tworzenia warstwy pośredniej zbudowanej ze zmodyfikowanej tkanki.

4

SEMINARIUM II

Przyczyny rozwoju inżynierii biomateriałów.

Implanty w ortopedii.

Co jest przedmiotem działania inżynierii biomateriałów?

Przedmiotem działania inżynierii biomateriałów jest:

Poszukiwanie nowych biomateriałów (materiałów) służących do naprawy, rekonstrukcji, regeneracji
uszkodzonych tkanek i narządów;

Modyfikacja, unowocześnianie już istniejących biomateriałów, implantów;

Badania biomateriałów – badania fizykochemiczne, badania biologiczne, których celem jest stworzenie,
wyselekcjonowanie materiałów o wysokiej biozgodności, właściwościach (mechanicznych, fizycznych,
chemicznych) zbliżonych do naturalnych tkanek;

Konstruowanie implantów na bazie biomateriałów dla różnych rodzajów ubytków: kostnych, chrzęstnych,
nerwowych itp.;

Konstruowanie implantów zindywidualizowanych dostosowanych do potrzeb pacjentów;

Naprawa, regeneracja, zastąpienie zniszczonych chorobowo lub na skutek urazów zewnętrznych tkanek i
narządów;

Poprawa komfortu i stylu życia pacjentów.

Przyczyny rozwoju inżynierii biomateriałów:

Postęp w rozwoju różnych dziedzin chirurgii rekonstrukcyjnej i zabiegowej oraz protetyki;

Starzenie się społeczeństwa;

Wzrost liczby wypadków komunikacyjnych;

Wzrost wypadków związany z uprawianiem sportów w tym sportów ekstremalnych;

Rozwój chorób (nowotworowe, cywilizacyjne);

Ograniczenia, względy etyczne związane z zastosowaniem transplantów (autogennych, allogennych);

Względy estetyczne.

•

Coraz większe zapotrzebowanie na:

Materiały (biomateriały) służące do konstrukcji implantów do zastąpienia, rekonstrukcji, uszkodzonych
tkanek, narządów.

Materiały usprawniających, ułatwiających wykonywanie podstawowych czynności życiowych.

Materiały poprawiających wygląd zewnętrzny.

5

Implant (endoproteza) stawu biodrowego:

Budowa Stawu Biodrowego:

1. Kość miedniczna
2. Więzadło kulszowo-udowe
3. Więzadło biodrowo-udowe
4. Kość udowa

1. Głowa kości udowej
2. Obrąbek panewkowy
3. Panewka
4. Więzadło głowy kości udowej
5. Włókna warstwy okrężnej
6. Szyjka kości udowej

Wskazania do zastosowania endoprotezy stawu biodrowego:

•

Choroba zwyrodnieniowa (osteoarthrosis), która charakteryzuje się zniszczeniem chrząstki stawowej.

•

Zwyrodnienie wtórne – wadliwa budowa anatomiczna (np. staw biodrowy dysplastyczny), wady wrodzone.

•

Choroby reumatoidalne.

•

Zaburzenia ukrwienia (np. jałowa martwica głowy kości udowej).

•

Stany pourazowe.

•

Stany pozapalne.

Implant (endoproteza) stawu biodrowego

:

Panewka stawu biodrowego:

•Jednoczłonowa;
•Dwuczłonowa:
-Część zewnętrzna – metal (stopy na bazie kobaltu,
stopy na bazie tytanu);
-Część wewnętrzna tzw. wkładka – polietylen o
wysokiej masie cząsteczkowej (UHDPE), ceramika:
tlenek glinu (korund), tlenek cyrkonu (cyrkon).

Głowa stawu biodrowego:

-Ceramika (korund lub cyrkon);
-Metal (stopy na bazie kobaltu i tytanu).

Trzpień stawu biodrowego:

-Stopy na osnowie kobaltu;
-Stopy na bazie tytanu.

6

Komplikacje oraz ryzyko wynikające z zastosowania endoprotezy stawu biodrowego:

Tworzenie zakrzepów;

Przemieszczenie endoprotezy;

Infekcje;

Złamania, pęknięcia trzpienia endoprotezy;

Alergie;

Obluzowywanie endoprotezy, ścieranie pary główka –panewka.

Zadanie dla inżynierii biomateriałów:

zastąpienie konwencjonalnych biomateriałów (metale), biomateriałami o lepszych wł. mechanicznych
(kompozyty), tribologicznych; (Tribologia – nauka o procesach zachodzących w ruchomym styku ciał
stałych. W jej skład wchodzą badania nad tarciem, zużywaniem oraz smarowaniem zespołów ruchomych),

modyfikacja powierzchni trzpieni endoprotez (warstwy porowate, hydroksyapatytowe)
(Hydroksyapatyt – minerał zbudowany z hydroksyfosforanu wapnia (sześcioortofosforanu(V)
dwuwodorotlenku dziesięciowapnia) o wzorze chemicznym Ca10(PO4)6(OH)2 [zapisywanym też jako
3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2)]. Stanowi mineralne rusztowanie tkanki łącznej, odpowiedzialnej za mechaniczną
wytrzymałość kości.)

Dla ciekawskich:

http://www.postepy-farmacji.pl/index.php?option=com_content&view=article&id=92:nano-
hydroksyapatyty-w-zastosowaniach-biomedycznych&catid=56&Itemid=227

Kapoplastyka - Zabieg kapo plastyki polega na zastąpieniu powierzchni stawowych głowy kości udowej i panewki
metalowymi nasadami. // ( Kapoplastyka, to nowa metoda operacyjna stawu biodrowego, będąca alternatywą dla
endoprotezo plastyki całkowitej. Technika ta polega na zastąpieniu uszkodzonych powierzchni stycznych metalem
o niskiej ścieralności. Dzięki niej możliwe jest zachowanie naturalnego ustawienia głowy i szyjki kości udowej, przez
co praca stawu jest niemal anatomiczna. )

Etapy implantacji stawu biodrowego:

a) Usunięcie chorej głowy kości udowej;
b) Usunięcie powierzchni panewki;
c) Umieszczenie panewki z tworzywa sztucznego w kości miednicy;
d) Umieszczenie trzpienia endoprotezy w kości udowej.

7

Implant (endoproteza) stawu kolanowego

Budowa stawu kolanowego:

Wskazania do zastosowania endoprotezy stawu kolanowego:

Choroba zwyrodnieniowa (osteoarthrosis);

Zwyrodnienie wtórne –wadliwa budowa anatomiczna (np. kolano szpotawe, kolano koślawe), wady
wrodzone;

Reumatoidalne zapalenie stawów;

Stany pourazowe;

Stany pozapalne.

Rodzaje endoprotez stawu kolanowego:

I.

Protezy jedno przedziałowe, saneczkowe - można implantować w obydwu przedziałach stawu, a zasadą

podstawową jest brak uszkodzeń więzadeł krzyżowych i pobocznych stawu kolanowego.

II.

Protezy częściowo związane, kłykciowe, kondylarne – protezy dwu przedziałowe. Protezy kłykciowe

stosuję się przy większych destrukcjach powierzchni stawowych, zachowanych lub uszkodzonych
więzadłach krzyżowych.

III.

Protezy zawiasowe – wolne i związane. Komponenta udowa i piszczelowa charakteryzują się długimi

trzpieniami i są zwykle połączone z sobą klipsowymi belkami. W latach siedem dziesiątych oprócz
zabezpieczenia ruchów zgięcia i wyprostu, wprowadzono dodatkową możliwość ruchu rotacyjnego.
Protezy te są stosowane w uszkodzeniach więzadeł krzyżowych i pobocznych, także po
niepowodzeniach implantacyjnych w innych typach protez.

8

Materiały na endoprotezy stawu kolanowego:

Podstawowym materiałem polimerowym stosowanym w produkcji endoprotez stawu kolanowego jest polietylen o
ultra wysokiej masie cząsteczkowej (UHDPE). Do najczęściej stosowanych materiałów na elementy ślizgowe w
obrębie stawu kolanowego stosowane są:

CoCrMo – UHDPE,

Ti6Al4V – UHDPE,

Stopy nierdzewne 316L–UHDPE.

Prócz wymienionych stopów metali coraz częściej w endoprotezach stawu kolanowego stosuje się pary trące typu
ceramika-polimer. Najczęściej stosowanymi materiałami ceramicznymi są:

tlenekglinuAl2O3[korund]

tlenekcyrkonuZrO2[cyrkon]

9

SEMINARIUM III

Rola powierzchni w odpowiedzi komórkowej.

Metody oceny właściwości fizykochemicznych powierzchni biomateriałów.

Adhezja – przyleganie, zdolność komórek do łączenia się, oddziaływania z innymi komórkami oraz otoczeniem.
Główną rolę odgrywają białka adhezyjne (selektyna, integryny, IgB, inne immunopodobne).

Kalcytyny – uczestniczą w oddziaływaniach międzykomórkowych poprzez jony Ca2+, są białkami transbłonalnymi.
(Kalcytonina, hormon peptydowy wytwarzany przez komórki C gruczołu tarczowego, powodujący obniżenie
poziomu wapnia we krwi, m.in. przez odkładanie wapnia w kościach zapobiega więc ich demineralizacji
osteoporozie. Działa przeciwstawnie do parathormonu.).

Integryny – glikoproteiny, współdziałają z innymi receptorami błonowymi, umożliwiają agregację komórek oraz ich
ukierunkowaną migrację, orientację, spłaszczenie, łączą się z cytoszkieletem. ( Integryny - są to główne białka
receptorowe, które są wykorzystywane przez komórkę jako receptory dla składników macierzy
zewnątrzkomórkowej oraz jako białka adhezyjne ułatwiające przyłączenie się komórki do macierzy. Integryny
działają jako komórkowe transmembranowe linkery pośredniczące w interakcjach między cytoszkieletem i matriks
zewnątrzkomórkową, przez co regulują kształt, orientację i ruch komórki. Większość integryn wiąże się do pęczków
filamentów aktynowych. W komórkach krwi integryny pomagają w połączeniu jednej komórki z drugą. Integryny są
zbudowane z dwóch niekowalencyjnie związanych podjednostek glikoproteinowych – α i β.).

Adhezja reguluję:

Proliferację (Proliferacja – zdolność
namnażania komórek przez organizmy.),

Apoptoze,

Różnicowanie,

Migrację,

Budowa cytoszkieletu :

Filamenty aktynowe.

Mikrotubule z tubuliny.

Filamenty pośrednie.

CZAS

Adsorpcja wody Etap konieczny do wytworzenia wiązań pomiędzy receptorami
Adsorpcja światła błonowymi komórki a powierzchnią materiału.

Adhezja komórek minuty

Proliferacja komórek

Różnicowanie się dni

Wytwarzanie substancji międzykomórkowej

10

Adhezja odwracalna:

Adsorpcja białek.

siły Van der Waalsa.

Siły Van der Waalsa + siły elektrostatyczne.

>50nm >20nm

Adhezja nieodwracalna:

Siły Van der Waalsa + oddziaływania specyficzne

≤10nm

Oddziaływanie materiału z tkanką

:

skład chemiczny, chemia powierzchni,

chropowatość,

porowatość,

właściwości elektryczne, magnetyczne,

energia powierzchniowa, wytrawianie powierzchni,

morfologia powierzchni,

hydrofilowość, hydrofobowość,

zdefektowania,

ładunek powierzchni,

zwilżalność powierzchni.

11

Czynniki powierzchniowe biomateriałów, wpływające na odpowiedź komórkową:

topografia,

heterogeniczność,

zwilżalność,

energia powierzchniowa.

Gomiometr mierzy kąt zwilżania oraz energię powierzchniową. Pomiary zwilżalności wykonywane są za pomocą
wody dejonizowanej.

Pomiar kąta zwilżania

Równanie Younga

γSG = γSC + γCGcosΘ

γ – energia powierzchniowa między fazami

Θ – kąt zwilżania

Określenie zwilżalności ciał stałych:

Dla θ = 0°, cos θ = 1 – zupełna zwilżalność;
Gdy 0°< θ < 90° – dobre zwilżanie;
Gdy 90°< θ < 180°– złe zwilżanie;
Gdy θ > 180° – całkowity brak zwilżalności.

Kąt zwilżania zależy od:

Heterogeniczności powierzchni

Chropowatości.

12

Podział materiałów ze względu na stopień zwilżalności powierzchni:

•

Powierzchnia hydrofilowa:

Pierwszy rodzaj oddziaływań: oddziaływanie donor –elektron i akceptor –elektron - zasadowa grupa
funkcyjna (NH2, COOH, COC, OH) –donory elektronów;

Drugi rodzaj oddziaływań: oddziaływania międzycząsteczkowe (siły między jonowe, siły van der Waalsa,
oddziaływanie EDA (elektronowo – donorowo - akceptorowe), oddziaływania mostkowe (tlenowe,
wodorowe).

•

Powierzchnia hydrofobowa:

Obecność w warstwie wierzchniej organicznych łańcuchów alifatycznych lub związków aromatycznych
zbudowanych z grup –CH3, -CH2:

Oddziaływanie z łańcuchami organicznymi (w środowisku wodnym) za pomocą sił van der Waalsa.

Badanie składu chemicznego powierzchni:

Spektroskopia w podczerwieni wykorzystuje zjawisko selektywnej absorpcji promieniowania podczerwonego, przez
różne substancje. Absorpcja może występować wówczas, gdy częstość drgań promieniowania podczerwonego jest
równa częstości drgań własnych atomów lub ich ugrupowań koordynacyjnych w krysztale.

Widmo podczerwone obejmuje trzy zakresy:

I. Podczerwień bliska (0,75-2um - 13335-5000cm^-1)
II. Podczerwień środkowa (2-25um - 5000-400cm^-1)
III. Podczerwień daleka (powyżej 25um - poniżej 400cm^1)

Warunkiem absorpcji promieniowania podczerwonego, jest aby drganiom towarzyszyła zmiana momentu
dipolowego ugrupowania atomów - reguła wyboru.

Ruchy atomów w krysztale heterodesmicznym dzielimy na:

I. Ruchy wewnątrzcząsteczkowe;

Drgania rozciągające

Drgania zginające

II. Drgania międzycząsteczkowe;

Translacje – liniowe przesunięcie cząsteczek;

Rotacje – ruch obrotowy cząsteczek wg jednej z osi;

Wibracje – polegają na oscylacjach wokół osi momentu bezwładności

13

Zastosowanie spektroskopii w podczerwieni:

Identyfikacja substancji o znanej strukturze

Określenie wiązań chemicznych na powierzchni materiału

Określenie struktury cząsteczki na podstawie tabeli częstości grupowych

Określenie czystości związków

Kontrola przebiegu reakcji

Analiza Ilościowa

Badanie oddziaływań międzycząsteczkowych

14

SEMINARIUM IV

Badania biozgodności materiałów w warunkach in vitro.

Norma ISO 10993

"Biological evaluation of medical devices"
PN-EN ISO 10993

"Biologiczna ocena wyrobów medycznych"

Arkusz 1: Zalecenia dotyczące doboru badań
Arkusz 2: Zasady dotyczące postępowania ze zwierzętami
Arkusz 7: Badania cytotoksyczności, metoda in vitro
Arkusz 14: Przygotowanie próbek i materiałów kontrolnych

Przy planowaniu badań wyrobów przeznaczonych do implantacji należy:

Wziąć pod uwagę ich przydatność do zamierzonego zastosowania oraz przeanalizować ich właściwości.

Przeanalizować dostępne wyniki badań.

Wziąć pod uwagę rodzaj kontaktu z organizmem.

Badania cytotoksyczności in vitro:

Tego typu badania przeprowadza się głównie z zastosowaniem żywych komórek: hodowli komórkowej, plemników i
pierwotniaków.

Jest pierwszym krokiem w kierunku upewnienia się co do biozgodności badanego biomateriału.

Linie komórkowe to populacja komórek powstająca z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu.

Pasaż zmiana środowiska, np. transport z jednej szalki do drugiej.

Istnieje ryzyko 'przepełnienia hodowli (nawarstwianie się komórek, te na samym dole mają ograniczony dostęp do
pożywki)' wtedy to należy dokonać pasażu.

15

Porównanie linii komórkowych o określonym czasie życia i linii komórkowych
ciągłych.

Linia komórkowa o określonym czasie życia:

Posiada life-span (czas życia),

Komórki prawidłowe nietransofmowane,

Aby żyć muszą przyczepiać się do podłoża,

Podlegają kontaktowemu zahamowaniu
wzrostu i migracji,

Gęstość limituje wzrost,

Wymagają dużych stężeń surowicy w
medium,

Wiek=ilość podwojeń populacji,

Wzrost zależny od obecności czynników
wzrostowych w medium.

Linia komórkowa ciągła:

Są nieśmiertelne,

Komórki nowotworowe lub
transformowane,

Rosną w zawiesinie,

Brak zahamowania kontaktowego wzrostu,

Wzrost limituje dostęp składników medium,

Często nie wymagają dodatku surowicy lub
jej małej ilości,

Wiek = numer pasażu

Wzrost niezależny od obecności czynników
wzrostowych w medium

16

Krzywa wprowadzania i wzrostu linii komórkowej o ograniczonym czasie życia i linii ciągłej:

Banki i rodzaje linii komórkowych:

Europejska kolekcja hodowli komórkowych (ECACC) - założona w 1984 w GB dysponuje 1000 różnymi liniami
komórkowymi pochodzącymi od ponad 45 gatunków zwierząt (w tym ponad 400 linii komórkowych
wyprowadzonych z prawidłowych tkanek ludzkich oraz nowotworów)

Amerykańska kolekcja hodowli komórkowych.

Dostępne linie komórkowe:

HeLa - linia komórkowa wywodząca sie z komórek raka szyjki macicy, linia ciągła.

HEK293 (Human Embryonic Kidney cell) - linia komórkowa nabłonkowa, otrzymane z nerek ludzkich
embrionów.

MG 63 (human osteoblast-like cell).

Pożywka hodowlana:

Rola pożywki hodowlanej dostarczenie komórkom składników odżywczych niezbędnych do przeżywania,
wzrostu i różnicowania.

Rodzaje pożywek:

Naturalne -> limfa, osocze krwi, surowica

Pożywki podstawowe o określonym składzie chemicznym

17

Skład pożywek hodowlanych:

Węglowodany jako źródło energii,

Aminokwasy,

Witaminy zwłaszcza z grupy B,

Hormony i czynniki wzrostu,

Białka,

Kwasy tłuszczowe,

Mikroelementy : Zn, Cu, Se, Fe,

Antybiotyki,

Dlaczego linie komórkowe w badaniach biomateriałów?

Tańsze, krótsze, możliwość wyeliminowania części materiałów implantacyjnych przed badaniami in vivo na
zwierzętach, metody czułe, w doświadczeniach in vitro można przeanalizować znacznie większą liczbę
próbek oraz dokonać licznych powtórzeń, co podwyższa wiarygodność wyników, uniknięcie różnic
gatunkowych.

Ograniczenia:

konieczność utrzymania ścisłej aseptyki,

hodowla komórek jest systemem znacznie upraszczającym naturalne środowisko,

niestabilność dotycząca wielu linii ciągłych.

Co możemy oznaczyć w badaniach biologicznych in vitro?

Z zastosowaniem linii komórkowych:

Zachowanie komórek na materiale (adhezja, rozpłaszczanie)

Żywotność

Proliferacja

czynniki sektrecyjne

DNA, RNA

ekspresja receptorów powierzchniowych

18

Biologiczna ocena wyrobów medycznych

Przygotowanie prób kontrolnych i materiałów odniesienia:

Materiały kontrolne:

a) negatywne - PE, polidimetylosilioksan, stal nierdzewna),
b) pozytywne (PCV plastyfikowany lub zawierający dodatki cynoorganiczne),
Materiały odniesienia (RM - Reference Material)

materiał lub substancja, których jedna lub więcej właściwości są dostatecznie jednorodne i na tyle dobrze

określone, aby mogły być stosowane do kalibracji przyrządu, oceny metody pomiarowej lub do przypisania wartości
cechom materiałów.

Próba ślepa (układ badany bez kontaktu z materiałem) .

Przygotowanie próbek:

Przygotowanie płynnych wyciągów:

W celu określenia potencjalnego zagrożenia toksykologicznego zaleca się aby warunki ekstrakcji symulowały lub
były ostrzejsze niż warunki w których wyrób jest użytkowany klinicznie.

Środki ekstrakcyjne:

Pożywka hodowlana z surowicą

Pożywka hodowlana bez surowicy

Roztwór soli fizjologicznej

Warunki ekstrakcji:
Nie krócej niż 24h w 37°
72h w 50°
24h w 70°
1h w 121°

Wielkość próbki 0,1-0,2g/ml.

19

Procedury badawcze:

Badanie na wyciągach:

odpipetować stałą ilość zawiesiny komórek do odpowiednich naczyń w celu poddania działaniu wyciągów,

inkubować hodowlę w 37^C w atm 5% CO2,

sprawdzić morfologię komórek pod mikroskopem,

przeprowadzić badania na:

•

pierwotnym wyciągu,

•

serii rozcięczeń wyciągu stosując pożywkę hodowlaną jako rozcieńczalnik,

inkubować wyciągi z komórkami przez odpowiedni okres czasu,

oznaczyć działanie cytotoksyczne.

Inkubator CO2

CO2 dostarczane jest z butli z gazem, umieszczonej poza boksem lub

wysterylizowanej w boksie.

Odpowiednia wilgotność zapewniona jest dzięki obecności tacek napełnionych wodą
jałową, dejonizowaną na dnie inkubatora

20

Przygotowanie próbek

Przygotowanie materiału do badań w bezpośrednim kontakcie:

zaleca się aby powierzchnia badana była płaska;

próbki wzięte do badań powinny być jałowe;

pożywka hodowlana powinna być jałowa.

Badanie w bezpośrednim kontakcie:

Próbki umieścić w naczyniach hodowlanych,

Odpipetować stałą ilość zawiesiny komórek do odpowiednich naczyń w celu bezpośredniego kontaktu z
badaną próbką,

inkubować hodowlę w 27° w atmosferze 5% CO2,

sprawdzić morfologie komórki pod mikroskopem,

usunąć pożywkę hodowlaną, dodać świeżej pożywki,

inkubacja tem. 37°C w atm. 5% CO2;

oznaczyć działanie cytotoksyczne.

Jakościowe i ilościowe oznaczenie cytotoksyczności

Ocena jakościowa:

badanie pod mikroskopem z zastosowaniem barwnika cytochemicznego;

ocena dotyczy: ogólnej morfologii, wakuolizacji, oddzielania od podłoża, lizy komórki, integralności błony
komórkowej;

skala cytotoksyczności:
0 –niecytotoksyczne;
1 –łagodnie cytotoksyczne;
2 –umiarkowanie cytotoksyczne;
3 –ostro cytotoksyczne

Ocena ilościowa:

liczba komórek martwych,

stopień zahamowania wzrostu komórek,

zdolność do namnażania i formowania się kolonii,

ilość białek i wydzielanie się enzymów;

21

Test MTT i XTT – oznaczenie żywotności komórek

Polega na redukcji soli tetrazolowych (MTT lub XTT) do formazanu – reakcja barwna.

Redukcja następuje w wyniku działania enzymów mitochondrialnych (dehydrogenaza) powodujących redukcję soli
tetrazolowych do formazanu. Tylko żywe komórki mają zdolność do redukcji.
Ilościowej analizy dokonuje się poprzez badanie absorpcji promieniowania świetlnego o długości fali 570nm (dla
MTT) i 490nm (dla XTT) za pomocą spektrofotomeru.

ELISA

ELISA - czyli test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny – jeden z najpowszechniej stosowanych
testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia
określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych
skoniugowanych z odpowiednim enzymem. W podstawowej wersji testu ELISA, pewna
ilość antygenu unieruchomiona jest na powierzchni fazy stałej. Wykonanie testu polega na wprowadzeniu
materiału biologicznego zawierającego przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu. Przeciwciała te
powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Unieruchomiony antygen i specyficzne
przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem.
Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym związany ze specyficznym
przeciwciałem katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie.

22

SEMINARIUM V

Badania In vivo biomateriałów.
Oddziaływanie na granicy tkanka-biomateriał.

Przy planowaniu badań implantacyjnych należy wziąć pod uwagę:

Dobór zwierząt doświadczalnych w zależności od wieku i kształtu próbek oraz wymagań jakie
stawia się badanym materiałom.

Dobór technik operacyjnych w zależności od funkcji i przeznaczania biomateriału oraz miejsca
implantacji

Dobór badań pooperacyjnych umożliwiających ocenę ogólnej i miejscowej reakcji organizmu na
wszczepiony materiał i ocenę zmian w materiale

Dobór odpowiednich badań patomorfologicznych, pozwalających określić biozgodność i
bifunkcyjność implantu

Obserwacje śródoperacyjne

Co możemy oznaczyć w badaniach biologicznych In vivo?

Badania Implantacyjne:

a) Badania makroskopowe

- oceniamy rodzaj, charakter i rozległość zaobserwowanych zmian zarówno w

implantowanym materiale jak i w otaczających go tkankach.

b) Badania mikroskopowe

na podstawie preparatów histologicznych można określić odczyn tkanek i prześledzić zmiany w
tkankach przylegających i przerastających wszczep:

•

Rozległość stanu zapalnego

•

Wielkość torebki włóknistej

•

Zmiana w strukturze tkanek otaczających

•

Obecność zmian martwiczych

•

Obecność drobin implantu

•

W przypadku materiałów porowatych – ilość i jakość tkanek wypełniających pory.

23

na podstawie preparatów histochemicznych określamy stan czynnościowy komórki – jesteśmy w
stanie wykrywać specyficzne substancje białka, lipidy, enzymy – jesteśmy w stanie określić ich
aktywność, nie tylko samą obecność.

Badania histologiczne:

Najbardziej rozpowszechnione,

Na podstawie preparatów histologicznych ze wszczepów i okolicznych tkanek, wykorzystując
mikroskop biologiczny świetlny możemy ocenić:

•

morfologie otaczających implant tkanek,

•

rozległość stanu zapalnego na podstawie ilości pojawiających się stanów zapalnych.

Przykładowe metody barwienia preparatów histologicznych:

Barwienie metodą May -Grunwalda –Giemsy,

Barwienie metodą PAS,

Barwienie włókien kolagenowych metodą Van Giesona.

Badania histochemiczne:

Badanie histochemiczne opierają się na badaniu składu chemicznego i procesów biochemicznych w
obrębie tkanki stosując metody nieuszkadzające struktury badanego obiektu,

Umożliwiają śledzenie badanych reakcji dokładnie w miejscu powstawania w tkankach,

Jest metodą łączącą badania struktury i metabolizmu komórek,

Pozwala na wykrycie w tkance specyficznych związków chemicznych: białek, cukrów, lipidów, kwasów
nukleinowych, enzymów,

W przypadku enzymów nie ogranicza się jedynie do wykrywania ich jako substancji, lecz także uwidacznia
ich aktywność.

24

Wpływ środowiska biologicznego na biomateriał:

Degradacja, fragmentacja erozja, zmiana parametrów fizycznych i chemicznych materiału,

Utlenianie, korozja,

Depolimeryzacja,

Przebudowa chemicznej struktury powierzchni - adhezja biomolekuł, tworzenie wiązań chemicznych z
otaczającą tkanką,

Rozpuszczanie, hydroliza.

Produkty degradacji korozji mogą powodować działanie:

Toksyczne

Kancerogenne

Mutagenne

Drażniące

Los produktów degradacji w organizmie:

Fragmenty implantu przedostają się do środowiska biologicznego w wyniku ścierania, w trakcie zabiegu
operacyjnego lub degradacji.

Wędrówka cząstek w żywym organizmie zależy od

kształtu (symetryczne, igiełkowate), rozmiaru i

parametrów powierzchni materiału

ruch wymuszony przez mięśnie, transport w naczyniach

krwionośnych,

Cząstki o małych rozmiarach – fagocytoza, węzły chłonne,

Cząstki o dużych rozmiarach – komórki około ciała obcego.

25

Odpowiedź środowiska biologicznego na działanie biomateriału:

Wpływ materiału syntetycznego na środowisko biologiczne:

Zmienia środowisko komórek:

Warunki chemiczne (skład chemiczny),

Pole elektryczne, magnetyczne,

Naprężenia (ekranowanie),

Działanie pobudzające lub hamujące czynności białek enzymatycznych, decydujących o
procesach metabolicznych oraz immunologicznych,

Problemy bakteriologiczne,

Problemy onkologiczne,

Zakłóca transport: energii, informacji, masy w układzie tkanka – komórka.

Wywołuje to reakcje toksyczne, mutagenne, alergiczne, kancerogenne.

26

Problemy bakteriologiczne – powstawanie biofilmu.

1.

Osiadanie bakterii na podłożu i tworzenie przez nie skupisk uniemożliwiających adsorpcję innym
komórkom,

2.

Wydzielenie przez osiadłe bakterie lepkiej substancji pozakomórkowej (ochronna błonka
polisacharydowa),

3.

Przekazanie przez bakterie sygnałów stymulujących je do rozmnażania i tworzenia kolonii,

4.

Powstawanie gradientów chemicznych umożliwiających współistnienie bakterii różnych gatunków i
znajdujących się w rozmaitych stanach metabolicznych,

5.

Opuszczanie biofilmu przez bakterie, które następnie tworzą nowe skupiska.

Reakcja miejscowa na wszczep

Proces naprawczy w tkance:

1.

Przerwanie ciągłości tkanki,

2.

Uaktywnienie płytek krwi i układu krzepnięcia,

3.

Migracja neutrofili

kilka, kilkanaście godzin,

4.

Zmniejszenie liczby neutrofili, wzrost liczby limfocytów T i monocytów, rozwój sieci naczyń
krwionośnych i namnażanie fibroblastów

okres anaboliczny – 4-6 dni,

5.

Tkanka ziarninowa (niezróżnicowana tkanka łączna, liczne naczynka włosowate),

6.

Przebudowa, rekonstrukcja,

7.

Powstawanie tkanki bliznowatej.

Reakcja na granicy implant-tkanka:

Procesy naprawcze w tkance w obecności implantu:

Przerwanie ciągłości tkanki,

Oddziaływanie materiał-krew, stan zapalny: (Zapalenie ostre / Zapalenie chroniczne),

Reakcja około ciała obcego (FBR – Foreign Body Reaction),

Tworzenie ziarniny,

Tworzenie tkanki włóknistej lub tkanki właściwej.

27

Przerwanie ciągłości tkanki:

Oddziaływanie materiał-krew, reakcja zapalna:

Zaburzenie przepływu krwi

Wysięk – wypływ wody, białek (fibryna) elementów morfotycznych krwi z naczyń krwionośnych

Pobudzenie mediatorów procesów zapalnych (histamina, serotonina, cytokiny (TNF IL1), czynniki
wzrostu)

Komórki biorące udział w odpowiedzi zapalnej:

Neutrofile (komórki ostrej fazy) 24-48h.

Monocyty -> makrofagi – tygodnie, miesiące.

Rodzaje reakcji zapalnej:

a) Faza ostra

czas trwania od kilku do kilkudziesięciu godzin,

komórki : neutrofile – fagocytoza mikroorganizmów i ciał obcych,

W zależności od rodzaju biomateriału i jego właściwości pochłonięcie i degradacja może się pojawić
bądź nie.

b) Faza przewlekła (chroniczna)

Czas trwania tygodnie lub miesiące,

Komórki : monocyty, makrofagi – fagocytoza, produkcja substancji biologicznych (enzymy
proteolityczne, czynniki chemotaktyczne, substancje metaboliczne, czynniki wzrostu, cytokiny),

W przypadku materiałów w pełni biozgodnych faza chroniczna zapalenia trwa krótko.

28

Reakcja około ciała obcego (FBR)

Główną rolę w reakcji na ciało obce pełnią makrofagi.

Reakcja na ciało obce zależy od:

Rodzaju biomateriału

Rozmiaru biomateriału

Topografii powierzchni biomateriału

Np.

Pojedyncza bądź podwójna warstwa makrofagów powierzchnia gładka np. implant
silikonowy.

Kilka warstw makrofagów powierzchnia chropowata np. proteza naczyniowa PTFE,
cement kostny PMMA.

Formowanie ziarniny

Proliferacja fibroblastów i komórek nabłonkowych do miejsca implantacji

Tworzenie tkanki

ziarninowej, nowopowstała tkanka łączna zawierająca dużą ilość naczyń włosowatych.

Pojawić się może po 3-5 dni od implantacji, zależy od rozległości miejsca implantacji.

Procesy naprawcze w miejscu implantacji:

Regeneracja – odbudowa naturalnej tkanki,

Materiał porowaty – przerastanie tkanki,

Zastąpienie przez tkankę łączną – wytworzenie otoczki z tkanki włóknistej wokół implantu –
materiał inertny.

Grubość tkanki włóknistej jest odwrotnie proporcjonalna do biozgodności
biomateriału!

29

Barwienie metodą van Giesona:

1.

Płukanie w wodzie destylowanej przygotowanych skrawków,

2.

Barwienie do 10min. w pikrofuksynie nasyconego wodnego kwasu pikrynowego 90ml,

3.

1% fuksyny kwaśnej 10ml,

4.

Szybko płukać w wodzie destylowanej przez około 15 sek.,

5.

Odwodnić od 90% alkoholu,

6.

Wyniki: jądra – czarne, tkanka kolagenowa – czerwono-jaskrawa, mięśnie – żółtawe,
cytoplazma – szarożółta.

Nie umieszczałem w powyższym opracowaniu informacji dotyczących Skaningowego

Mikroskopu Elektronowego, Mikroskopu Sił Atomowych, czy Profilometru ponieważ każdy miał

już laborki z AFM-u i mniej więcej kojarzy tematykę.

Opracowanie ma na celu uporządkowanie wiadomości z którymi zaznajomiliście się na

Seminariach.

Życzę owocnej nauki, w razie jakichkolwiek błędów, pytań, tudzież sugestii proszę o kontakt na

[e-mail]

Pozdrawiam,

Hetman Wielki Litewski, Paweł Pieczarko.