2.1.ODWRACALNE MODYFIKACJE KOWALENCYJNE KINAZ BIAŁKOWYCH
Aktywność enzymów zmienia się przez tworzenie i rozrywanie wiązań kowalencyjnych między enzymem a grupą niebiałkową, np. fosforylacje prowadzą kinazy białkowe z udziałem ATP; defosforylacje- fosfatazy białkowe.
Fosforylaza- uczestniczy w degradacji polisacharydu do 1-P-glukozy; do aktywacji wymaga fosforylacji reszt Ser, z udziałem kinazy białkowej.
Syntaza glikogenowa- katalizująca syntezę glikogenu przez kolejne dołączanie jednostek glukozy w postaci 1-P-Glc; do
aktywacji wymaga odłączenia reszty P z udziałem fosfatazy białkowej.
Regulacja cyklu komórkowego obejmuje kluczowe dla komórki procesy: -wykrywanie i naprawę błędów materiału genetycznego -zapobieganie niekontrolowanym podziałom komórkiProcesy molekularne, które sterują cyklem komórkowym, są uporządkowane i ukierunkowane, co oznacza że każdy proces następuje w sposób sekwencyjny oraz niemożliwe jest "odwrócenie" cyklu.
ROLA CYKLIN I KINAZ ZALEŻNYCH OD CYKLIN
Kluczowymi cząsteczkami regulatorowymi cyklu komórkowego są 2 grupy cząsteczek:
-cykliny-kinazy zależne od cyklin.
Kinazy białkowe kontrolujące cykl komórkowy są obecne w komórkach dzielących się podczas całego cyklu. Ich aktywacja zachodzi tylko w odpowiednim etapie cyklu, po czym szybko tracą aktywność. Aktywność każdej z tych kinaz cyklicznie zwiększa się i zmniejsza. Aktywność kinaz białkowych regulują białka kontrolne- cykliny.
Cykliny nie mają aktywności enzymatycznej, ale po przyłączeniu do kinaz cyklu komórkowego, mogą uzyskać aktywność enzymatyczną. Stąd kinazy układu kontroli cyklu komórkowego nazywane są kinazami białkowymi zależnymi od cyklin (Cdk). Nazwa cyklin przeciwnie do Cdk sugeruje ich cykliczne zmiany stężenia podczas cyklu komórkowego. Różne geny kodujące Cdk i cykliny są bardzo konserwatywne. Początkowo zmodyfikowano je u drożdży piekarniczych( nadano tym genom nieoficjalną nazwę cdc).
Cykliny i Cdk formują razem aktywny heterodimer, w obrębie którego cykliny tworzą jednostkę regulatorową, a Cdk pełnią rolę katalityczną. Cdk po związaniu się z cyklinami ulegają aktywacji, w wyniku której zdolne są do prowadzenia reakcji fosforylacji białek docelowych. Zaktywowane kinazy przenoszą grupy P-fosforanowe z ATP na odpowiednią resztę aminokwasową białka docelowego. W stanie nieaktywnym miejsce aktywne białek Cdk jest sferycznie zasłonięte, tzw. "pętla T". Związanie cykliny z Cdk odciąga pętlę T i odsłania związaną cząsteczkę ATP, umożliwiając jej kontakt z białkiem. Do pełniej aktywności Cdk potrzebne jest jeszcze jedno białko- kinaza aktywująca Cdk, która fosforyluje Tre w pętli T, a to umożliwia dalsze wiązanie i fosforylację białek docelowych. Inhibitory Cdk nazywane CKI regulują aktywność kinazy poprzez wiązanie się z centrum aktywnym enzymu, co utrudnia dostęp do ATP.
Enzym może wiązać albo substrat, albo inhibitor, ale nigdy oba razem!!!
2.2.CYKLINY
Tworzą kilka grup cyklin:A,B oraz, C,D i E. W czasie cyklu komórkowego cykliny A,C, D i E są syntetyzowane de novo i ich stężenie w komórce rośnie w miarę upływu cyklu. Cyklina B syntetyzowana jest w fazie G2. Maksymalne stężenie cyklin jest w metafazie/anafazie mitozy, po czym ulega ono obniżeniu, na skutek trawienia ich przez proteazy.
Aktywacja kinaz zachodzi w 2 krytycznych przedziałach czasowych(punktach kontrolnych) cyklu komórkowego:
-pod koniec fazy G2 co prowadzi do przejścia do fazy M, czyli zapoczątkowania mitozy - w końcowej fazie G1 co prowadzi do przejścia do fazy S, czyli do zapoczątkowania syntezy DNA.Każdy rodzaj kompleksu cyklina-Cdk fosforyluje różne białka docelowe.
Stężenie różnych typów cyklin:
-okresowo zwiększa się, po czym maleje na skutek degradacji na drodze ubiktywinacji, w określonym czasie cyklu komórkowego. -wzrost stężenia każdego typu cykliny wspomaga aktywację odpowiadającej jej kinazy Cdk, zaś nagły jej spadek przywraca Cdk do stanu nieaktywnego.
-Powolne gromadzenie się cyklin, aż do poziomu krytycznego, jest jedną z metod pomiaru odstępów czasu miedzy kolejnymi etapami cyklu komórkowego.
2.3.PRZEJŚCIE Z PÓŹNEJ FAZY G2 DO FAZY M
Dokonuje się przez aktywację kinazy fazy M znanej jako czynnik wywołujący dojrzewanie (MPF). Jest ona heterodimerem białkowym składającym się z białka o masie 34 kDa i białka o masie 45 kDa(cyklina). W kompleksie tym białko p34 jest kinazą fosforylującą reszty Ser i Tre wielu białek, a kompleks cyklina-białko p34, nadaje aktywnemu kompleksowi powinowactwo do odpowiedniego substratu, czyli białka które ma być ufosforylowane.
2.4.KINAZA FAZY M
Powstaje w fazie G2 w wyniku utworzenia kompleksu białko p34-cyklina B(kinaza MPF). Kinaza MPF fosforyluje wiele kluczowych białek, zmieniając ich właściwości, np.:
-rozpad otoczki jądrowej poprzez fosforylację i demontaż biegnących pod otoczką jądrową filamentów laminy.
-fosforyluje białka towarzyszące mikrotubulom, co zmienia ich właściwości na zdolne do tworzenia wrzeciona podziałowego.-fosforyluje również histon H1, co powoduje kondensację chromosomów.
Aktywne kompleksy cyklina-Cdk fazy S fosforylują, tzw. kompleksy prereplikacyjne, przyłączające się w fazie G1 do sekwencji DNA, od których rozpoczyna się replikacja. Fosforylacja ta ma dwa cele: uaktywnić już przyłączone do DNA kompleksy prereplikacyjne oraz zapobiec tworzeniu nowych kompleksów. Działanie takie zapewnia, że każda część genomu komórki ulegnie replikacji tylko jeden raz.
Zapobieganie przerwom w replikacji, umożliwia komórkom potomnym przeżycie, co jest niemożliwe przy braku kluczowych genów. Z drugiej strony, większa liczba kopii genu w indywidualnym genomie byłaby szkodliwa dla komórek potomnych. Kompleksy mitotyczne cyklina-Cdk, które są nieaktywne w fazach S i G2 sprzyjają rozpoczęciu mitozy przez stymulację kolejnych białek uczestniczących w kondensacji chromatyny i powstaniu wrzeciona podziałowego. Kluczowym kompleksem aktywowanym w czasie tego procesu jest ligaza ubikwityny, zwana kompleksem sprzyjającym w anafazie (APC), która kieruje degradację białek strukturalnych chromosomalnego kinetochoru. APC wyznacza również cykliny mitotyczne, które mogą ulec degradacji, zapewniając postęp telofazy i cytokinezy.

2.5.UBIKWITYNA
Białko obojętne o m.cz. 8,6 kDa( 76 reszt aminokwasowych); pojedynczy łańcuch: 1 odcinek o konformacji alfa i 5 o konformacji beta. Jest wszędobylskim białkiem komórek eukariotycznych. Stanowi barometr procesów komórkowych. Sekwencja aminokwasowa białka jest wysoce konserwatywna, identyczna u przedstawicieli różnorodnych gatunków. Ubikwityna tworzy 2 typy połączeń z innymi białkami:-odwracalne- w modyfikacjach postranslacyjnych
-selektywne, nieodwracalne połączone z destrukcją:
1.białek jądrowych, histonów H2A i H2B w jądrze
2.białek receptorowych w błonach
3.białek cytoszkieletu w cytozolu.
DEGRADACJA BIAŁEK ZALEŻNA OD UBIKWITYNY
Sygnałem proteolizy jest przyłączenie ubikwityny przez glicynę na C-końcu, do grupy
NH2 lizyny białka przeznaczonego do proteolizy. Reguła N-końca mówi, że:
Rodzaj aminokwasu na N- końcu białka jest sygnałem kontrolującym aktywność enzymów proteolitycznych, np. Arg, Lys, Phe, Leu, Trp powodowały bardzo szybką degradację beta-galaktozydazy ( u bakterii i drożdży). Ubikwityna wstępnie jest aktywowana przez 3 różne enzymy: E1, E2, E3.
AKTYWACJA UBIKWITYNY
1.Aktywacja ubikwityny i przyłączenie jej do białka E1- terminalną grupą COOH UB. Tworzy się wiązanie tioestrowe z gr. SH enzymu E1 w reakcji kierowanej przez ATP.
2.Reakcja przeniesienia tioestru zaktywowanej ubikwityny na enzym E2
3. Enzym E3 katalizuje transfer ubikwityny na aminową grupę Lys docelowego białka. E3 jest ligazą (izopeptydazą) która rozpoznaje proleolityczne substraty.
Schemat budowy proteasomu(centrum degradacji białek)
Ubiktywina + białko (koniugat) ?aminokwas
Proteasom- jest to białkowy wielkocząsteczkowy agregat enzymatyczny o masie cząsteczkowej ok. 2 MDa utworzony z białek (kilku rodzajów proteaz) tworzących kształt cylindra. W proteasomie zachodzi degradacja białek "oznakowanych" ubikwityną.
Aktywne kompleksy cyklina-Cdk są motorem napędowym przebiegu cyklu komórkowego. Cyklina D jest pierwszą cykliną wytwarzaną w przebiegu cyklu w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe (np. czynniki wzrostu). Wiąże się ona z Cdk4 (kinazą) tworząc aktywny kompleks cyklina D-Cdk4, który z kolei fosforyluje białko RB. Ufosforylowane białko RB opuszcza kompleks, który był związany z genem E2F zapobiegając jego transkrypcji. Rozpad kompleksu E2F/DP1/RB powoduje aktywację enzymu E2F, co skutkuje transkrypcja różnych genów : cykliny E, cykliny A, polimerazy DNA, kinazy tymidynowej i innych. Utworzona cyklina E wiąże się z kolejną kinazą Cdk2, tworząc kompleks cyklina E-Cdk2. To powoduje przejście komórki z gazy G1 do fazy S. Cyklina A razem z Cdk2 tworzy kompleks cyklina A- Cdk2, który inicjuje przejście z fazy G2 do M. Aktywacja kompleksu cyklina B-Cdk1 powoduje rozpad błony jądrowej oraz rozpoczęcie profazy, a następnie jego inaktywacje- wyjście komórki z mitozy.
3.1.REGULACJA FAZY S
Zachodzi poprzez kontrolę przechodzenia komórki z fazy G1 do S oraz zakończenia syntezy DNA. Białko p34 w fazie G1łaczy się kolejno z cyklinami D, A, E dając kompleks kinazy podobny do kinazy fazy M, nazywany kinazą fazy S. Aktywność tej kinazy prowadzi komórki przez punkt startowy = restrykcyjny ( w późnej gazie G1). Półokres trwania fazy G1 wynosi zaledwie 15 minut, co odpowiada klasie białek niestabilnych(białek U), które znane są od dawna i których nagromadzenie w komórce jest warunkiem przejścia z fazy G1 do S.