Zaprojektuj  reakcję  PCR,  w  której  otrzymasz  fragment  białka  Usp  z  Bombyx  mori,  obejmujący  aminokwasy: 
Val4  –  P80.  Pamiętaj,  że  produkt  reakcji  będzie  w  kolejnym  etapie  wklonowany  do  wektora  ekspresyjnego 
pGEX-3X. Wybierz odpowiednie dwa różne miejsca restrykcyjne ! 

Ogranicz liczbę aminokwasów pochodzących z wektora ! 

A. 

Zaprojektuj dwa startery posiadające odpowiednie miejsca restrykcyjne. 

 

B. 

Podaj składniki mieszaniny reakcyjnej – załóż, że zaprojektowane przez Ciebie „startery” zakupiłeś(aś) 
w  firmie,  która  przysłała  je  podając  następujące  stężenia:  C

R

=32pmol/



l;  C

F

=0,3



g/



l.  Matryca            

z wklonowanym genem całego białka (plazmid BS SK(+)/BmUsp)  ma stężenie: 

        C

DNA

  =  7,5 ng/



l.    

 

C. 

Uzupełnij  schemat  programu  PCR,  przedstawiony  na  stronie  5,  wpisując  m.in.  odpowiednie  wartości 
jednostek, temperatur i czasów.  Załóż, że dysponujesz  polimerazą  Vent  (2U/



l)  o  procesywności  700 

nukleotydów/30s,  optimum  aktywności  (synteza  DNA)  enzym  wykazuje  w  temperaturze  72



C; 

optymalne stężenie dNTP wynosi 0,2 mM (probówka dostarczona przez producenta zawiera dNTP w 
stężeniu 2,5 mM), optymalna liczba jednostek enzymu na jedną reakcję wynosi 1,5U, optymalna ilość 
matrycy wynosi 15 ng, wystarczająca ilość starterów: 50 pmoli. 

 
 
 
 



 

 Sekwencja  cDNA  Usp  z  Bombyx mori  obejmująca reszty:  Met1-Pro80: 

 

 

 1     atgtcgagcgtggcgaagaaagataaacgcacaatgtcggtaactgcgttgatcaatagg    60 
 1     M  S  S  V  A  K  K  D  K  R  T  M  S  V  T  A  L  I  N  R      20 
 
 61    gcgtggccaatgacgcctagcccacagcagcagcagcagatggtgccgtctacacagcat   120         
 21    A  W  P  M  T  P  S  P  Q  Q  Q  Q  Q  M  V  P  S  T  Q  H      40 
 
 121   tcgaatttcctgcacgcaatggctacaccttcaaccacacccaatgttgaactcgatata   180        
 41    S  N  F  L  H  A  M  A  T  P  S  T  T  P  N  V  E  L  D  I      60 
 
 181   caatggctgaacatagagtcagggtttatgtcgcctatgtcaccgcccgaaatgaagcca   240       
 61    Q  W  L  N  I  E  S  G  F  M  S  P  M  S  P  P  E  M  K  P      80 
 
 
 
 
 



 

Polilinker  (MCS) wektora  pGEX-2X: 

 
  
 k

odon startu  

... ATG GTT CCG GAT CCC TGA CGA ATT CGT CCG GTA AGC TTA TAT GGC TGA ... 
               BamHI    

STOP 

  EcoRI

            

HindIII      

     STOP