Czynniki, które decydują o wyborze metody diagnostycznej



Właściwości próbki



Charakterystyka celu molekularnego



Czułośd i specyficznośd metody



Powtarzalnośd



Potencjał różnicujący metody



Stopieo trudności metody (doświadczenia personelu)



Zaplecze badawcze (sprzęt jakim dysponujemy)



Łatwośd interpretacji wyników



Czas wymagany do analizy



Całkowite koszty stosowanej metody



Koszty pojedynczej próbki

Wybór metody diagnostycznej zależy od poruszanego problemu



Wykrywanie



Identyfikacja



Typowanie(różnicowanie)



Badania taksonomiczne; filogeneza

TECHNIKI NIEOPARTE NA AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH
Analiza profili plazmidowych (ang. PPA, Plasmid Profile Analysis)



Po raz pierwszy została zastosowana w badaniach epidemiologicznych w roku 1988



Uważa się ze szczepy izogeniczne (należące do tej samej grupy) maja identyczny zestaw plazmidów



Technika prosta, ale ograniczona do szczepów posiadających plazmidy, szczepy bezplazmidowe są nietypowalne



Komórki niektórych gatunków bakterii, nawet szczepów, nabywają i tracą plazmidy spontanicznie

REAP - Restriction Enzyme Analysis of Plasmid

W przypadku dużych plazmidów (100-150 kpz) ze względu na ich niską rozdzielczośd w tradycyjnej elektroforezie stosuje się trawienie

DNA plazmidowego komercyjnymi restryktazami, co pozawala na różnicowanie szczepów na podstawie różnorodności profili restrykcyjnych -
REAP.

Liczba i wielkośd uzyskanych fragmentów DNA determinowana jest przez długośd sekwencji rozpoznania dla określonego enzymu

restrykcyjnego oraz charakter trawionego DNA (% składu par zasad GC).

Statystycznie w przypadku DNA z zawartością par GC około 50% 4-nukleotydowa sekwencja rozpoznania powinna występowad co 256

pz, 6-nukleotydowa co 4 kpz, a sekwencja 8-nukleotydowa co 65 kpz.

Zastosowanie



Analiza szpitalnych izolatów K.pneumoniae (zawierają co najmniej 3 plazmidy)



Badanie rozprzestrzeniania się lekooporności kodowanej plazmidowo



Przydatna w śledzeniu zakażeo, których przyczyna są bakterie z rodzaju Staphylococcus

Wady



Szybki transfer DNA na drodze koniugacji wykazuje podobne profile u różnych bakterii



Mała uniwersalnośd



Brak możliwości badania interakcji pomiędzy szczepami

METODY OPARTE NA HYBRYDYZACJI

Metoda hybrydyzacji wykorzystuje zjawisko tworzenia dwuniciowych kompleksów pomiędzy komplementarnymi, jednoniciowymi

odcinkami kwasów nukleinowych.

Metoda ta umożliwia lokalizację określonych sekwencji w długiej cząsteczce DNA, co pozwala na porównywanie podobieostwa różnych

fragmentów kwasów nukleinowych.

Stabilnośd dwuniciowego kompleksu jest tym większa im dłuższe odcinki wykazują komplementarnośd nukleotydów.
W metodzie hybrydyzacji mogą byd porównywane fragmenty kwasów nukleinowych, pochodzące zarówno od tego samego jak i

różnych organizmów.

Hybrydyzacja może mied miejsce zarówno pomiędzy dwoma



Cząsteczkami DNA



DNA i RNA

Hybrydyzacja

1. Hybrydyzacja standardowa: sonda wyznakowana w roztworze, niewyznakowany target związany z fazą stałą
2. Reverse nucleic hybridization assay - znakowany target w roztworze, nieznakowana sonda związana z podłożem stałym

STANDARDOWE TECHNIKI HYBRYDYZACYJNE

Techniki "blottingu"



DOT – kropka



SPLOT – plamka, punkcik



SLOT – szczelina, otwór



Southern blotting



Northern blotting

Reakcje hybrydyzacji blotting są wysoce swoiste, ich zasada polega na zastosowaniu jednoniciowego kwasu nukleinowego (DNA, RNA)- sondy,
który komplementarnie wiąże się z DNA lub RNA znajdującym się w próbce badanej.

TECHNIKI HYBRYDYZACYJNE OPARTE O ODWROTNĄ HYBRYDYZACJĘ

Rodzaj hybrydyzacji

Znakowany target w roztworze

Niewyznakowana sonda na podłożu

stałym

Odwrotny dot-blot

DNA

Oligonukleotydy związane z membraną

Mikromacierze cDNA

DNA

DNA mechanicznie związane do szkiełka

mikroskopowego

Mikromacierze oligonukleotydowe

(Chipy DNA)

DNA

Oligonukleotydy syntezowane na

szkiełku

Rodzaj hybrydyzacji

Znakowana sonda w roztworze

Niewyznakowany target związany z fazą

stałą

Dot – blot

DNA lub RNA, często oligonukleotydy

DNA czy RNA związane z membraną

Southern blot

Dowolne sondy

Często genomowe DNA, trawione enzymem

restrykcyjnym, rozdzielone elektroforetycznie

i przeniesione na membranę (transfer)

Northern blot

Dowolne sondy

RNA rozdzielone elektroforetycznie, transfer

na membranę

Hybrydyzacja do

chromosomu in situ

Wyznakowane genomowe DNA

DNA chromosomu lizowanych komórek na

szkiełku mikroskopowym

Hybrydyzacja do tkanki in

situ

Wyznakowana antysensowna sonda rRNA lub

oligonukleotydy

RNA wewnątrz komórek budujących tkanki

związane ze szkiełkiem mikroskopowym

Hybrydyzacja do kolonii in

situ

Dowolne sondy

Komórki – kolonie przeniesione na agar,

potem membranę

Hybrydyzacja do łysinki in

situ

Dowolne sondy

Łysinki z agaru przeniesione na membranę

We wszystkich wariantach metody hybrydyzacji jeden z elementów uczestniczący w procesie pełni rolę sondy molekularnej o określonej
sekwencji nukleotydów i uzyskiwanej na drodze



Klonowania



Syntezy chemicznej

Sondy genetyczne:
Sondy oligonukleotydowe
Sondy polinukleotydowe
Sondy jednego locus
Sondy wielu loci

Środowisko hybrydyzacji ma większy wpływ na krótsze sondy niż na sondy dłuższe.

Charakterystyka sond i ich wielkośd

Typ

DNA

RNA

Oligonukleotydy

Źródło pochodzenia

DNA komórkowe - klonowanie lub

PCR

Transkrypcja insertu po

klonowaniu do odpowiedniego

wektora

Synteza chemiczna

Charakterystyka

dsDNA od 0,1 do kilkuset kpz dla

konwencjonalnych klonów DNA 0,1

do 20 i > kpz dla produktów PCR

ssDNA; długośd do kilku tysięcy

zasad

ssDNA; 15-50 nt

Znakowanie

Synteza DNA przez polimerazę DNA

Transkrypcja z klonowanego

DNA

Wyznakowane kooce przez

kinazę polinukleotydową

Sonda hybrydyzuje do



DNA przytwierdzonego na filtrze



DNA preparatów cytologicznych



DNA preparatów histologicznych

Sonda wiąże się tylko do fragmentów DNA, które zawierają sekwencje komplementarne do sekwencji sondy.

Do zidentyfikowania powstałych kompleksów sondę znakuje się



Izotopowo (audioradiografia)



W reakcjach barwnych



Chemilumiscencyjnie

Znakowanie sond DNA i RNA



Znakowanie nowych nici podczas syntezy in vitro DNA/RNA

o

Przemieszczanie pęknięd (nick-translation)

o

Znakowanie metoda wydłużania startera (ang. random primed labeling)

o

Za pośrednictwem PCR

o

Fotoznakowanie

o

Znakowanie RNA w systemie transkrypcji "in vitro"



Znakowanie 5’

o

Z użyciem alkalicznej fosfatazy

o

Metoda wymiany 5'-koncowego fosforanu



Znakowanie kooców 3'

o

Z użyciem terminalnej transferazy dla krótkich oligonukleotydów

Hybrydyzacja kanapkowa

A – sonda molekularna
B – sonda znakowana
Hybryd (A-B) przyłączony do identyfikowanego kwasu
nukleinowego
M - membrana
I - identyfikowany kwas nukleinowy

Hybrydyzacja w wyniku konkurencji między sondami

A – sonda nieznakowana
B – sonda znakowana
Z - Hybryd (A-B)
M - membrana
I - identyfikowany kwas nukleinowy

Zalety sond molekularnych stosowanych w hybrydyzacji



Stabilnośd w wysokich temperaturach i wysokim pH (są bardziej stabilne niż białka)



Opornośd na działanie rozpuszczalników organicznych i różnych związków chemicznych (duże znaczenie przy przygotowywaniu próbek
do analiz – oczyszczanie komórek i tkanek z płynów ustrojowych)



Wysoka specyficznośd (większa niż przeciwciał)



Bardzo wysoka czułośd, nawet do 1 μg kwasów nukleinowych odpowiada do 10

6

komórek bakteryjnych czy cząsteczek wirusa



Znajomośd układu sekwencji nukleotydów, do której hybrydyzuje sonda nie jest konieczna



Hybrydyzacja ze strawionym DNA enzymami restrykcyjnymi pozwala na identyfikację zmian sekwencji DNA

Zastosowanie technik hybrydyzacyjnych

1. Wykrywanie specyficznych fragmentów DNA do analizy porównawczej różnych szczepów bakteryjnych

W diagnostyce chorób genetycznych

2. Do ustalenia sekwencji ulegających ekspresji (northern hybrydyzacja)
3. Hybrydyzacja „zoo” do ustalania pokrewieostwa międzygatunkowego
4. Hybrydyzacja „in situ”



Do określania miejsc genów na chromosomie (mapowanie)



Do wizualizacji komórek, w których dochodzi do syntezy określonego rodzaju mRNA

5. Hybrydyzacja „in situ” FISH

Polimorfizm genetyczny

1. Występowanie w populacji więcej niż jednej wersji allelu z częstością większą niż wynikająca z ogólnej częstości mutacji
2. Występowanie najczęstszego allelu w danym locus z częstością mniejszą niż 99%
3. Modyfikacje sekwencji genu, które są akceptowane przez organizmy (zmiana taka zostaje utrwalona i funkcjonuje jako oddzielny

genotyp)



Allel polimorficzny może rozprzestrzeniad się w populacji



Często nie znamy jego wpływu…



Polimorfizm genetyczny jest przyczyną zmienności wewnątrzkomórkowej



Występuje bardzo często w rejonach niekodujących DNA

Skąd się biorą allele?



Błędy replikacji



Mutacje (spontaniczne; indukowane przez środowiskowe czynniki mutagenne: UV, promieniowanie jonizujące, policykliczne
węglowodany aromatyczne, leki) -> powstawanie genów nieaktywnych funkcjonalnie – pseudogenów lub nowych aktywnych genow

Rodzaje polimorfizmów



Mutacje obejmujące większe fragmenty genomu, np. zmiany krotności krótkich tandemowych powtórzeo w sekwencjach
powtarzających się mikrosatelitarnych i minisatelitarnych (STRP)



Polimorfizm długich fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

Technika Southern-blott
do analizowania specyficznych sekwencji DNA w mieszaninie genomowego DNA w różnych sekwencjach, m.in. będących wynikiem polimorfizmu
długich fragmentów restrykcyjnych

VNTR – Jest to szczególny rodzaj polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (VNTR, variable number of tandem repeat)
VNTR-insercja wielu kopii (długośd 10-100bp) w tandemie tzw. sekwencji mini satelitarnych pomiędzy dwa miejsca restrykcyjne



Nawet rodzeostwo ma różne allele genu niosącego sekwencje minisatelitarne

„DNA fingerprints”
pokazuje identycznośd genetyczną (VNTR) bliźniąt jednojajowych (monozygotycznych); technika hybrydyzacji Southerna



Znaczenie polimorfizmów dla zdrowia może się ujawniad pod wpływem czynników zewnętrznych, tj.

o

Kancerogeny chemiczne (m.in. palenie papierosów)

o

UV

o

Czynniki dietetyczne (antyoksydanty, flawonoidy, witaminy antyoksydacyjne, nienasycone kwasy tłuszczowe)



Znaczenie polimorfizmów genetycznych

o

Badanie polimorfizmu jest przydatne w diagnostyce prenatalnej chorób genetycznych (nosiciele heterozygotyczni chorób)

o

Badanie polimorfizmu może służyd wykrywaniu chorób o wysokim lub niskim ryzyku chorób wieku dojrzałego: …

o

Przydatne w kryminalistyce

Zastosowanie technik opierających się o hybrydyzację w diagnostyce
Test paskowy - opiera się na hybrydyzacji DNA-DNA. Sonda zawiera częśd reporterową i częśd wychwytującą interesujący nas target. Sonda
wychwytująca posiada ogon poli-dA, który hybryduje z oligonukleotydem poli-dT związanym z paskiem. Stosowana do identyfikacji
mikroorganizmów np. Mycobacterium tuberculosis
Obecnie jako sondy genetyczne stosowane są



Fragmenty kwasów nukleinowych (DNA,RNA) izolowanych z komórek lub uzyskiwanych w wyniku reakcji PCR



Oligonukleotydy syntezowane chemicznie



Charakterystyczne fragmenty genomowego DNA (sekwencje …)



rRNA, tRNA

Do wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego w komórce lub odpowiednim rejonie chromosomu stosowana jest hybrydyzacja in situ



Fluorescencyjna FISH



Chromogenna CISH



Porównawcza hybrydyzacja genomowa – fiber FISH

Hybrydyzacja in situ (ISH)
Technika ISH pozwala na specyficzne rozpoznawanie sekwencji DNA lub RNA w tkankach lub pojedynczych komórkach.
Technikę tę można stosowad na



Tkankach mrożeniowych



Tkankach parafinowych



Preparatach cytologicznych



Cytospinach (preparaty szpiku kostnego)

ISH znalazła zastosowanie w diagnostyce medycznej w następujących dziedzinach



Wirusologia



Wykrywanie patogenów (bakterie, grzyby, parazyty)



Onkologia



Endokrynologia

-Ocenę preparatów hybrydyzacji in situ przeprowadza się w mikroskopie świetlnym, uwzględniając intensywnośd reakcji histochemicznej.
-Stosując metodę ISH wykorzystując komplementarne sondy (DNA lub RNA) można wykrywad kwasy nukleinowe wirusów i prowirusów w
preparatach tkankowych.
-Dzięki bardzo wysokiej czułości pozwalającej na wykrywanie stosunkowo krótkich fragmentów genomu, możliwe jest wykrycie pojedynczych
prowirusów w komórce.
Najczęściej stosuje się sondy wykrywające kwasy nukleinowe wirusów



HPV – wirus brodawczaka ludzkiego (ang. human papilloma virus)



HSV – wirus opryszczki (ang. herpes simplex virus)

Metoda polega na hybrydyzacji znakowanej sondy z utrwalonym preparatem z tkanki.
Sondy, które nie związały się z komplementarnymi sekwencjami są z łatwością odmywane z tkanki.
Sonda jest wyznakowana



Fluoroforem, gdzie detekcja odbywa się przez obserwację mikroskopową w obecności sekcji emitujących, po wzbudzeniu światło
charakterystyczne dla danego fluoroforu



Haptenem, gdzie możliwe są różne barwienia – od enzymatycznego, gdzie enzym sprzężony z przeciwciałem rozpoznającym antygen
przekształca substrat w nierozpuszczalny barwny produkt



Chemicznie, gdzie np. złoto koloidalne sprzężone z przeciwciałem powoduje wytrącenie się srebra. Ten typ detekcji pozwalający na np.
wykrycie roli niektórych wirusów w nowotworzeniu

ISH (hybrydyzacja in situ)w wykrywalności patogenów pozwala na identyfikację



Bakterii



Mycobacterii



Grzybów



Parazytów

W tego typu analizach najczęściej stosowaną sondą jest DNA natomiast celem molekularnym rRNA.
!! Dlaczego?
rRNA – świadczy o obecności komórek żywych, dających efekt np. w postaci zachorowania (w przypadku identyfikacji DNA dotyczy również
komórek martwych), odpowiedzi immunologicznej;
w komórkach żywych rRNA występuje znacznie więcej kopii niż DNA (kopii genów) -> większa czułośd;
w komórkach występuje duża ilośd kopii rRNA do ilości kopii genów.
-Dzięki tej technice wykrywa się obecnośd Helicobacter pylori w badaniach histopatologicznych fragmentów układu pokarmowego.
-Można wykryd Chlamydia w różnych stanach chorobowych izolowane z układu oddechowego i płciowego.
-Opracowano również protokół identyfikacji Lagionelli pneumophila izolowanej z przewodu oddechowego wykorzystujący ISH.
Dzięki ISH stosunkowo łatwo odróżnid patogenne grzyby krwi tj.



Candida albicans



C.glabrata



C.krusei



C.parapsilosis

Test został opracowany w oparciu o użycie czterech różnych sond równocześnie.
Poprawna identyfikacja genetyczna drożdży jest bardzo istotna, bo C.glabrata i C.krusei są oporne na leki (np. fukonazol) używana w zwalczaniu
C.albicans.
Technika ta pozwala również na lokalizację genów w chromosomach lub ich amplifikację. Powszechnie stosuje się ją obecnie do wykrywania
protoonkogenów HER-2/neu czy też topoizomerazy I i II α.
W przypadku lokalizacji określonych genów w technice ISH i FISH stosuje się trzy rodzaje sond molekularnych



Specyficzne komplementarne do określonego regionu chromosomu, mają zastosowanie w identyfikacji rearanżacji submikroskopowych
onkogenów (HER-2/neu) i unikatowych sekwencji telomerowych



α-satelitarne specyficzne do sekwencji repetytywnych na chromosomie; tzw. sondy telomerowe i centromerowe



Malujące: pokrywają cały chromosom lub jego ramiona; stosowane głównie w identyfikacji chromosomów markerowych, translokacji
złożonych i addycji niewiadomego pochodzenia

FISH (hybrydyzacja fluorescencyjna)
Jednym ze sposobów znakowania sond jest stosowanie barwników fluorescencyjnych (fluorochromów), które w koocowym etapie umożliwiają
detekcję z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego

Zastosowanie FISH w genetyce medycznej
Badania podstawowe



Analiza aberracji chromosomowych



Mapowanie genów i sekwencji DNA



Detekcja genów ulegających amplifikacji



Badanie ekspresji genów



Ewolucjonizm porównawczy

Genetyka kliniczna



Diagnostyka submikroskopowych aberracji chromosomowych



Identyfikacja złożonych aberracji struktury chromosomów



Identyfikacja dodatkowego materiału genetycznego



Identyfikacja chromosomów markerowych



1S0zybka diagnostyka aneuploidii chromosomowych