WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK

RETENCJI W TECHNICE HPLC

1. WPROWADZENIE

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

Jest uniwersalną metodą analityczną, stosowaną głównie do analiz wieloskładnikowych

próbek, zwłaszcza zawierających nielotne, także wielkocząsteczkowe związki chemiczne, a

nawet substancje biologiczne czynne. W chromatografii cieczowej fazą stacjonarną,

nieruchomą jest zwykle porowate wypełnienie a fazą ruchomą, eluentem ciecz. HPLC różni

się od klasycznej chromatografii cieczowej wysokim ciśnieniem fazy ruchomej koniecznym

do uzyskania przepływu tej fazy przez kolumnę chromatograficzną.

Można wyróżnić wiele rodzajów chromatografii cieczowej. Jednym z kryteriów

klasyfikacji jest natura stosowanej w kolumnie fazy stacjonarnej i rodzaj zachodzących

procesów separacji. Według tego kryterium wydzielić chromatografię na:

chromatografię adsorpcyjna: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem

różnic między zdolnościami składników próbki do adsorbowania się na powierzchni

aktywnego ciała stałego

chromatografię podziałową: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem

różnej rozpuszczalności składników próbki w fazie ruchomej i stacjonarnej

chromatografię jonowymienna: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem

różnej zdolności składników próbki do ulegania wymianie jonowej

chromatografię wykluczania: technikę, w której do rozdzielania wykorzystuje się

efekty wykluczania, wynikające z różnic w wielkościach cząsteczek i/lub w ich

kształcie albo ładunku. W przypadku gdy rozdział zależy od wielkości cząsteczek

metodę określa się terminem „chromatografię wykluczania zależnego od wielkości

cząstek” natomiast gdy rozdział zależy np. od stopnia dysocjacji rozdzielanych

związków – „chromatografią wykluczania jonów”

Ponieważ ćwiczenie dotyczy zastosowania techniki chromatografii adsorpcyjnej tylko

ona będzie przedmiotem bardziej szczegółowej charakterystyki.

Chromatografia adsorpcyjna

Chromatografia adsorpcyjna jest, jak zaznaczono wyżej, techniką, w której rozdzielanie

jest głównie wynikiem różnic między zdolnościami składników próbki do adsorbowania się

1

na powierzchni aktywnego ciała stałego. Chromatografia adsorpcyjna dzielona bywa według

podziału zgodnie z względną różnicą w polarnością polarności fazy ruchomej i stacjonarnej:

• Chromatografia w normalnym układzie faz. W tym układzie faza stacjonarna

jest silnie polarnej natury np. silikażel a faza ruchoma jest niepolarna.

Typowymi fazami ruchomymi są tu n-heksan lub tetrahydrofuran. Składniki

próbki o polarnej strukturze są zatrzymywane dłużej na polarnej powierzchni

fazy stałej niż składniki mniej polarne, czyli ich czas elucji z kolumny jest

dłuższy, dłuższy jest też więc czas retencji tych związków. Im bardziej polarna

faza ruchoma tym krótszy czas retencji. Słabością układów normalnofazowych

jest istotna zależność retencji od nawet niewielkich ilości wody w fazach

ruchomych. Nawet bowiem niewielkie zawilgocenie stosunkowo niepolarnych

faz ruchomych w zdecydowany sposób wpływa na retencję co sprawia

olbrzymie problemy z powtarzalnością analizy.

• Chromatografia w odwróconym układzie faz jest przeciwstawieniem tej

pierwszej. Faza stacjonarna ma naturę niepolarną, hydrofobową natomiast fazą

ruchomą jest ciecz polarna. W odwróconym układzie faz dokonuje się dzisiaj

przeważającej części rozdziałów chromatograficznych w HPLC. Typowymi

fazami ruchomymi są tu mieszaniny wody z metanolem, izopropanolem lub

acetonitrylem. Typowymi fazami stacjonarnymi są krzemionki modyfikowane

(hydrofobizowane) poprzez reakcję ze związkami krzemoorganicznymi. W

chromatografii w odwróconym układzie faz związki mniej polarne

zatrzymywane są mocniej przez hydrofobową powierzchnię fazy stałej niż

składniki bardziej polarne, czyli ich czas elucji z kolumny jest dłuższy, dłuższy

jest też więc czas retencji tych związków. Im mniej polarna faza ruchoma tym

krótszy czas retencji.

Polarność eluentu pełni zasadniczą rolę w każdym rodzaju technik HPLC. W

przypadku chromatografii w odwróconym układzie faz woda jest polarnym

składnikiem fazy ruchomej zaś metanol, izopropanol i acetonitryl pełnią rolę

składników zmniejszających polarność fazy ruchomej. Organiczne składniki fazy

ruchomej mające bardziej hydrofobowy charakter, łatwiej uruchamiają analit

zatrzymywany na fazie stacjonarnej, skracając tym samym czas elucji czyli skracając

czas retencji związku.

Generalnie stosuje się dwa typy elucji: izokratyczną i gradientową. W pierwszym

przypadku faza ruchoma o niezmiennym składzie pompowana jest poprzez kolumnę w

2

czasie całego cyklu analizy. W przypadku elucji gradientowej skład fazy ruchomej

zmienia się podczas cyklu analizy.

Kolumny chromatograficzne stosowane w technice z odwróconym układem faz

HPLC

Kolumna wraz z wypełnieniem stanowi najistotniejszy element układu

chromatograficznego, w którym zachodzi właściwy proces rozdziału. W zależności od

wielkości próbki stosuje się w technice HPLC kolumny analityczne, mikrokolumny i

kolumny preparatywne. Są to najczęściej rurki ze stali nierdzewnej o wypolerowanej

powierzchni wewnętrznej różnej długości i średnicy wewnętrznej Do celów analitycznych z

reguły stosuje się kolumny analityczne. Kolumnę chromatograficzną w technice HPLC, z

technicznego punktu widzenia, charakteryzują następujące parametry:

• Średnica wewnętrzna kolumny: 0,3-0,46 cm dla kolumn analitycznych, 0,1 lub

0,21 cm dla mikro kolumn, 0,8-1,0 cm dla kolumn semipreparatywnych i 2,0-

5,0 cm dla kolumn preparatywnych

• Długość kolumny: 3-25 cm dla kolumn analitycznych, 15 lub 25 cm dla mikro

kolumn, 10-25 cm dla kolumn semipreparatywnych i preparatywnych

(wyjątkiem są kolumny jonowymienne, których długość sięga 30 cm)

• Średnica ziaren wypełnienia wyrażana w µm: 3-10 dla kolumn analitycznych,

3-8 dla mikro kolumn, 5-20 dla kolumn semipreparatywnych i

preparatywnych. Jest to bardzo ważny parametr w technice HPLC. Wymiary

cząstek 5

µm to, w przypadku kolumn analitycznych, dobry kompromis

pomiędzy skutecznością rozdziału na kolumnie, ciśnieniem zwrotnym i

trwałością kolumny. Natomiast 3 µm ziarno umożliwia prowadzenie znaczenie

szybszych rozdziałów chromatograficznych ponieważ umożliwia stosowanie

wyższych przepływów fazy ruchomej niż to ma miejsce w przypadku ziaren

wypełnienia o większych rozmiarach. Mniejsze średnice ziaren to krótsze drogi

dyfuzji i dlatego możliwe jest wykorzystanie wyższych przepływów bez utraty

sprawności kolumny. Szczególne zastosowanie znalazły wypełnienia

nieporowate o średnicy ziaren ok. 1 –1,5 µm w analizie biomakromolekuł .

• Średnica porów wyrażana jest w nm lub Å. Średnica tych porów waha się od 7

do 100 nm (70 do 1000 Å) przy czym w kolumnach analitycznych

przeznaczonych do rozdziału substancji o małych masach wykorzystuje się

wypełnienia z wąskimi porami 7-12 nm, natomiast do rozdziału związków

3

wielkocząsteczkowych z porami szerokimi tj. 15-100 nm. Wielkość średnicy

porów podawana jest w charakterystyce kolumny HPLC.

Istotnym parametrem jest średnica kolumny. Kolumna o mniejszej średnicy powoduje

duże oszczędności w zużyciu fazy ruchomej, bez zmniejszenia liniowej prędkości przepływu

zachowując przy tym taki czas analizy, żeby współczynnik retencji nie przekroczył wartości

20 (Definicja współczynnika retencji, patrz p. 5.4). Jest to również czasem wprost wymogiem

wobec zastosowanego detektora mas lub innego wymagającego minimalnej ilości

wprowadzanego rozpuszczalnika (fazy ruchomej).

W celu ochrony fazy stacjonarnej przed kolmatacją cząstkami stałymi, kolumny są

zamknięte z dwóch końców filtrami (najczęściej ze stali nierdzewnej o średnicy porów 0,5-2

µm) i łącznikami do połączenia z dozownikiem i detektorem.

Ponieważ napełnianie kolumn do HPLC wymaga dobrego przygotowania i

profesjonalnego oprzyrządowania, dlatego preferowaną drogą zaopatrywania się w kolumny

jest zakup w specjalistycznej firmie dostarczającej wyposażenie chromatograficzne. Kolumny

można napełniać techniką suchą i mokrą. Lepsze efekty przy małych ziarnach dają techniki

mokre. Ich zasada polega na tym, że sporządza się zawiesinę wypełnienia w rozpuszczalniku

o gęstości zbliżonej do wypełnienia i zawiesinę taką pompuje się przez kolumnę, stosując

wysokie ciśnienie w granicach 50-100 MPa.

Krzemionkowe wypełnienia stosowane w chromatografii z odwróconym układem faz

wytwarzane są przeważnie drogą związania kowalencyjnymi wiązaniami organicznych

silanów (tzw. fazy związane) lub osadzenia organicznych polimerowych warstw na

powierzchniach podtrzymujących takich jak krzemionki lub Al

2

O

3

. Najczęściej

wykorzystywane wypełnienia są wytwarzane w reakcjach powierzchniowych silanoli (grup

Si-OH występujących na powierzchni SiO

2

) z chlorodimetyloalkilosilanami, reakcjach

silanoli z trójfunkcyjnymi chloroalkilosilanami lub silanoli z trójfunkcyjnymi

alkoksysilanami. Wśród wymienionych wyżej procesów najczęściej wykorzystywany jest

pierwszy z nich tj. reakcja silanoli z chlorodimetyloalkilosilanami.

Zaletą wytwarzania wypełnień metodą reakcji silanów z jedną grupą funkcyjną z

silanolami jest jej powtarzalność ponieważ jedna grupa silanolowa reaguje z jedną cząsteczką

chlorodimetylosilanu tworząc przewidywalna strukturę. Wypełnienia wykonywane tym

sposobem charakteryzują się wysoką sprawnością dzięki szybkiej dyfuzji do wewnątrz i na

zewnątrz cienkiego złoża fazy stacjonarnej. Retencja analizowanych próbek przeważnie

rośnie wraz z długością łańcucha węglowego (C

18

>C

8

>C

3

>C

1

), jakkolwiek nie należy

oczekiwać zasadniczych różnic dla dłuższych łańcuchów węglowych tj. C

8

i C

18.

Istotnym

4

parametrem charakteryzującym fazę ruchoma jest natomiast powierzchniowe stężenie grup

C

18

wyrażane w

µmol/m

2

.

Jak wspomniano wyżej, niektóre wypełnienia kolumn mogą zawierać osadzane na

nośniku fazy stacjonarne wytwarzane drogą polimeryzacji różnego typu monomerów. W

handlu dostępne są także kolumny z fazą stacjonarną z tlenku glinu modyfikowanego

polibutadienem czy z dwutlenkiem cyrkonu jako fazą stacjonarną. Fazy stacjonarne na bazie

dwutlenku cyrkonu charakteryzują się wysoką odpornością termiczną oraz możliwością pracy

w całym zakresie pH w przeciwieństwie do wypełnień opartych na SiO

2

, których zakres pracy

mieści się granicach 1,5< pH <8.

Detektory stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Detektory to jedne z głównych elementów składowych wysokosprawnego

chromatografu cieczowego. Rolą detektora jest dostarczanie w sposób ciągły informacji o

składzie eluatu wypływającego z kolumny. Dobry detektor charakteryzować się musi

odpowiednio wysoką czułością i małą objętością komory pomiarowej.

Najczęściej stosowanymi detektorami w technice HPLC są:

• Detektor absorpcji w nadfiolecie i świetle widzialnym (UV-VIS)
Jest to najczęściej stosowany detektor, którego działanie polega na pomiarze

absorbancji w warunkach przepływowych w kuwecie o objętości 1

µl. Źródłem światła jest tu

niskociśnieniowa lampa rtęciowa umożliwiająca pomiar absorpcji w zakresie 200 – 600 nm,

przy czym typową analityczną długością fali jest promieniowanie o

λ= 254 nm. Ta długość

fali absorbowana jest przez większość związków organicznych.

Za absorpcję promieniowania odpowiedzialne są tzw. chromofory, grupy absorbujące

promieniowanie UV w charakterystycznych dla siebie zakresach promieniowania.

Chromoforami są np. podwójne wiązania C=C, zarówno alifatyczne jak i aromatyczne,

wiązania C=N, N=O i inne. Czułość detektora UV-VIS jest bardzo wysoka i dla silnie

absorbujących związków dochodzi do 10

-11

g oznaczanej substancji. Współczesne detektory

umożliwiają programowalną, w czasie cyklu chromatograficznego, zmianę długości fali, na

optymalną dla w analizowanego tym momencie związku.

Jeszcze

lepsze

możliwości analityczne zapewnia modyfikacja detektora UV-VIS

znana jako układ szeregu diodowego (angielska nazwa systemu to Diode-Array). W tym

systemie przez próbkę w kuwecie przepływowej przechodzi światło polichromatyczne w

zakresie UV-VIS i dopiero za kuwetą jest rozszczepiane na siatce dyfrakcyjnej. Następnie

światło pada na zestaw fotodiod rozmieszczonych liniowo, tak, że każda z diod rejestruje

5

tylko wąski (rzędu 2 nm) zakres światła. Z funkcjonalnego punktu widzenia jest to jakby

zestaw równocześnie pracujących detektorów obejmujących swym zakresem całe widmo UV-

VIS. Zaletami tego systemu są:

- możliwość rejestrowania całego widma UV-VIS dla każdej z eluowanych

substancji

- możliwość sprawdzania czystości eluowanego piku – eliminuje możliwość

przeoczenia nakładających się substancji

- daje

możliwość korekcji linii podstawowej w przypadku wzrostu absorbancji na

skutek stosowania gradientu.

• Refraktometr różnicowy.
Opiera się na pomiarze różnicy współczynnika załamania światła między czysta fazą

ruchomą a fazą zawierającą wymywany składnik. Zasadniczą wadą tego detektora jest

wysoka wrażliwość na nawet małe zmiany temperatury - wymaga stabilizacji temperatury ±

0,001

o

C aby osiągnąć czułość 10

-7

jednostki współczynnika załamania. Jest więc detektorem

mało wygodnym w użyciu. Ponadto detektor ten wyklucza stosowanie gradientu fazy

ruchomej.

• Detektor fluorymetryczny (fluorescencyjny)
Detektor fluorescencyjny jest około 100 razy czulszy (dla związków fluoryzujących) i

znacznie bardziej selektywny niż detektor UV. Detektor ten wykorzystuje zjawisko

fluorescencji tj. emisji światła przez substancję wzbudzone wysokoenergetycznym

promieniowaniem UV. Jest detektorem selektywnym, gdyż związki mogą zostać wzbudzane

tylko światłem o określonej długości fali. Emitowane promieniowanie mierzone jest

fotopowielaczem ustawionym pod kątem 90

o

do źródła wzbudzenia. Detektor ten może

wykrywać pikogramowe ilości (10

-12

g) substancji. Stosuje się go często w analityce

wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA). Źródła wzbudzenia są takie

jak te używane w konwencjonalnych spektrofluorymetrach: lampy rtęciowe, lampy

ksenonowe, kwarcowe lampy halogenowe oraz lampy deuterowe. Najciekawsze efekty osiąga

się przy pomocy laserów. Światło laserowe można skupić na bardzo małej powierzchni co

skutkuje detektorami o bardzo małej komorze pomiarowej rzędu 1 nL. Tego typu detektory

stosować można w mikrochromatografii cieczowej wykorzystując mikrokolumny lub

kolumny kapilarne.

• Detektory elektrochemiczne
Do tej grupy zaliczają się detektory kulometryczny i detektor polarograficzny.

Detektorów tych zwykle używa się przy fazach zawierających wodę a takie właśnie fazy

6

stosowane są szeroko w HPLC, dlatego można się spodziewać wzrostu ich znaczenia.

Detektory te są detektorami selektywnymi o wielkiej czułości, jednak ich stosowanie uważa

się za uciążliwe.

• Detektor konduktometryczny
Zasada działania tego detektora opiera się na pomiarze przewodnictwa, stosowany jest

w chromatografii jonowej

• Inne detektory stosowane w HPLC
W HPLC stosuje się również detektory przejęte z chromatografii gazowej jak FID,

ECD, PID czy MSD ale wiąże się to z rozwiązaniem problemu transportu całości lub części

wycieku z kolumny LC, odparowaniu rozpuszczalnika po drodze i dostarczeniu nielotnych

substancji do detektora. Z powyższych powodów w technice HPLC znalazł praktyczne

zastosowanie tylko detektor masowy MSD, którego zalety rekompensują opisane wyżej

problemy.

2. CEL

ĆWICZENIA

Określenie wpływu polarności fazy ruchomej na retencję polarnych i niepolarnych związków

analizowanych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Ponadto ćwiczenie

służyć ma zapoznanie się z:

• Budową, zasadą działania i właściwościami detektorów stosowanych w wysokosprawnej

chromatografii cieczowej.

• Wykorzystaniem detektora UV-VIS w analizie związków organicznych.
• Wyznaczenie maksimum absorpcji badanego związku w oparciu o widmo UV-VIS.

3. ZAKRES MATERIAŁU WYMAGANY PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO

WYKONYWANIA ĆWICZENIA.

Charakterystyka i budowa kolumn stosowanych w wysokosprawnej chromatografii

cieczowej:

• Rodzaje fazy stacjonarnej stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
• Pojęcie uziarnienia i wielkości porów jako czynników charakteryzujących kolumnę,

stosowane jednostki

• Pojęcia chromatografii w normalnym i odwróconym układzie faz.

Detektory stosowane w chromatografii cieczowej

• Budowa i zasada działania

7

• Czułość i współczynnik odpowiedzi detektora
• Chromofory i ich charakterystyczne pasma absorpcji

Pojęcia czasu retencji i indeksu retencji

Zalecana literatura:

J. Nawrocki, I. Obst : „Metody analizy zanieczyszczeń powietrza atmosferycznego i

organicznych zanieczyszczeń wody pitnej” Wydawnictwo Naukowe UAM

L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glach: „Practical HPLC method development” Second

Edition, John Wiley & Sons, Inc. NewYork 1997

4. SPRZĘT I ODCZYNNIKI

• Chromatograf cieczowy WATERS 2690 wyposażony w kolumnę SYMMETRY C18 2,1

x 150 mm i detektor Waters 486 (UV-VIS) oraz automatyczny system nastrzyku próbki.

• Spektrofotometr UV-VIS HACH DR 4000U
• Warunki analizy: Składnik A: woda wysokiej czystości, składnik C: MeOH HPLC grade

przepływ 1 ml/min,

λ=230 nm

• Pipety automatyczne 20-200 µl, 100-1200 µl, 1000-5000 µl
• Naczyńka laboratoryjne o pojemności 1800 µl

• Podstawowe, metanolowe, roztwory toluenu (metylobenzenu) – związku niepolarnego

oraz kwasu benzoesowego – związku polarnego, w stężeniach po 0,5 mg/ml.

• Metanol – cz.d.a.
• Azotan sodowy – roztwór 10 mg/L

5. SPOSÓB WYKONANIA ĆWICZENIA

5.1.WYZNACZENIE DŁUGOŚCI FALI ODPOWIADAJĄCEJ MAKSIMUM ABSORPCJI

TOLUENU I KWASU BENZOESOWEGO

8

Wykorzystując spektrofotometr HACH DR 4000U wykonać analizę

spektrofotometryczną roztworów toluenu i kwasu benzoesowego. Odczytać długości fali

odpowiadające maksimom absorpcji toluenu i kwasu benzoesowego wykorzystując do tego

celu roztwory obu związków. Stwierdzić czy wśród wartości uzyskanych dla obu związków

są długości fali wspólne dla obu związków identyczne czy też różnią się znacznie. W drugim

przypadku istnieje konieczność zmiany długości fali detektora UV-VIS w trakcie

prowadzenia analizy.

5.2. WYKONANIE ROBOCZYCH ROZTWORÓW TOLUENU, KWASU

BENZOESOWEGO ORAZ MIESZANINY OBU ZWIĄZKÓW

Naczyńko laboratoryjne oznaczone TOLUEN zawiera podstawowy metanolowy roztwór

toluenu (0,5 mg/ml) a naczyńko oznaczone K_BENZ podstawowy metanolowy roztwór

kwasu benzoesowego (0,5 mg/ml).

W naczyńkach laboratoryjnych o pojemności 1,8 ml wykonać rozcieńczenia roztworów

podstawowych TOLUEN i K_BENZ w celu osiągnięcia stężeń 10 mg/L oraz ich mieszaniny

o stężeniu po 10 mg/L każdego z obu składników. W tym celu automatyczną pipetą pobrać

porcje metanolu po 1500 µl i wprowadzić do naczyniek o pojemności 1,8 ml wstępnie

opisanych jako TOLUEN-rob, K_BENZ-rob i MIX. Automatyczną pipetą o pojemności 20-

200 ul. usunąć z naczyniek TOLUEN-rob, K_BENZ-rob po 30 µl metanolu a z naczyńka

MIX 60

µl metanolu. Następnie z naczyńka TOLUEN pobrać porcje roztworu po 30 µl i

przenieść je do naczyniek oznaczonych TOLUEN-rob i MIX a z naczyńka K_BENZ pobrać

porcje roztworu po 30

µl i przenieść je do naczyniek oznaczonych K_BENZ-rob i MIX.

Naczyńka szczelnie zamknąć nakrętką i wstrząsając nim wymieszać zawartość.

5.3. ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA

1. Na panelu kontrolnym chromatografu Waters ustawić skład fazy ruchomej na Składnik

A (Woda) =50%, Składnik B=0%, Składnik C (Metanol) =50%, Składnik D=0% oraz

przepływ na 1 ml/min.

2. Wybrać PROJECT „FAZY” w programie CSW. Przygotowane wzorce, w kolejności

TOLUEN-rob, K_BENZ-rob i MIX umieścić w magazynku autosamplera. W oknie opisu

próbek projektu „FAZY” wpisać informacje dotyczące, w przypadku pierwszej analizy,

próbki TOLUEN-rob a drugiej próbki K_BENZ-rob.

3. Nastawić na panelu sterującym chromatografu Waters, wyznaczoną

spektrofotometrycznie wspólna dla obu związków długość fali detektora UV-VIS (w

przypadku różnych wartości dla obu związków, pierwotnie zaprogramować długości fali

9

odpowiadającej maksimum absorpcji TOLUENU a przed wykonaniem drugiej analizy,

długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji KWASU BENZOESOWEGO.

4. Uruchomić bieg programu chromatograficznego z panelu sterującego chromatografu

Waters wybierając analizę próbki nr jeden i objętość nastrzyku 20

µl. Po analizie zebrać i

wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji

TOLUENU.

5. Jeśli wybrano dla obu związków różne długości fal, na panelu kontrolnym

chromatografu Waters zmienić długość fali na tę spektrofotometrycznie wyznaczoną dla

KWASU BENZOESOWEGO. Powtórnie uruchomić program chromatograficzny z panelu

sterującego chromatografu Waters wybierając analizę próbki nr dwa i objętość nastrzyku 20

µl a po analizie zebrać i wydrukować otrzymany chromatogram wyznaczając wysokość, pole

i czas retencji KWASU BENZOESOWEGO. Zebrane wartości umieścić w tabeli.

6. Jeśli wybrano dla obu związków różne długości fal, na panelu kontrolnym

chromatografu Waters wybrać opcję zmiany długość fali w trakcie trwania cyklu

chromatograficznego. Na panelu kontrolnym chromatografu Waters ustawić skład fazy

ruchomej na Składnik A=10%, Składnik B=0%, Składnik C=90%, Składnik D=0% Po raz

trzeci uruchomić bieg programu chromatograficznego z panelu sterującego chromatografu

Waters wybierając analizę próbki nr 3 i objętość nastrzyku 20

µl. Po analizie zebrać i

wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji

TOLUENU i KWASU BENZOESOWEGO umieszczając zebrane wartości w tabeli.

7. Powtarzać analizę opisaną powyżej (p.6) zmieniając skład fazy ruchomej zgodnie ze

schematem umieszczonym w tabeli. Każdorazowo po analizie zebrać i wydrukować

otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji TOLUENU i KWASU

BENZOESOWEGO umieszczając zebrane wartości w tabeli.

5.4. WYZNACZENIE WSPÓŁCZYNNIKÓW RETENCJI.

Współczynnik retencji definiowany jest wzorem:

k=(t

R

-t

0

)/t

0

a martwy czas retencji:

t

0

=V

m

/F

gdzie:

k – współczynnik retencji

t

R

– czas retencji piku w min

t

0

– martwy czas retencji w min

10

V

m

– martwa objętość kolumny (objętość fazy ruchomej w kolumnie) w ml

F- przepływ przez kolumnę w ml/min

Martwą objętość kolumny można wyznaczyć z przybliżonego wzoru:

V

m

≈ 0,5

.

L

.

d

c

2

gdzie:

L - długość kolumny w cm

d

c

– wewnętrzna średnica kolumny w cm

Martwy czas retencji można również stosunkowo łatwo wyznaczyć doświadczalnie

analizując roztwór NaNO

3

lub roztwór uracylu. W tym celu wykorzystując spektrofotometr

HACH DR 4000U wykonać analizę spektrofotometryczną przygotowanego roztworu NaNO

3

.

Odczytać długości fali odpowiadające maksimom absorpcji azotanu sodowego

wykorzystujące do tego celu otrzymany roztwór związku.

Wykonać analizę chromatograficzną roztworu w warunkach analizy opisanych w

p.5.3.1. tj. A (Woda) =50%, Składnik B=0%, Składnik C (Metanol) =50%, Składnik D=0%

oraz przepływ na 1 ml/min, nastawiając długość fali na wartość odpowiadającą maksimum

absorpcji azotanu sodowego. Czas retencji związku jest martwym czasem retencji układu.

Porównać uzykaną wartość z wyliczoną teoretycznie.

6. OPRACOWANIE WYNIKÓW

W sprawozdaniu z przebiegu ćwiczenia umieścić wyliczony i wyznaczony martwy czas

retencji oraz tabelę (patrz wzór tab.) wraz z wyliczonymi współczynnikami retencji oraz

ocenę:

• Wpływu polarności fazy ruchomej na wysokość, pole piku oraz współczynnik retencji

obu związków.

• Korelacji pomiędzy polarnością fazy ruchomej a wysokością, polem piku oraz

współczynnikiem retencji związku w zależności od jego polarności

11

Wzorcowa tabela wyników.

Lp. Nazwa

próbki Udział

składnika

A w fazie

ruchomej

[%]

Udział

składnika
C w fazie

ruchomej

[%]

Wsp.

retencji
toluenu

[-]

Wsp.

retencji

kwasu

benzoes

owego

[-]

Wysokość/

pole piku

toluenu

[mV]/[mV

.

s]

Wysokość/

pole piku

kwasu

benzoesowe

go

[mV]/[mV

.

s]

1

TOLUEN-rob

50 50

2

K_BENZ-rob

50 50

3

MIX

10 90

4

MIX

20 80

5

MIX

30 70

6

MIX

40 60

7

MIX

50 50

8

MIX

60 40

9

MIX

70 30

10

MIX

80 20

11

MIX

90 10

12