WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK 

RETENCJI W TECHNICE HPLC 

 

1. WPROWADZENIE 

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) 

Jest uniwersalną metodą analityczną, stosowaną  głównie do analiz wieloskładnikowych 

próbek, zwłaszcza zawierających nielotne, także wielkocząsteczkowe związki chemiczne, a 

nawet substancje biologiczne czynne. W chromatografii cieczowej fazą stacjonarną, 

nieruchomą jest zwykle porowate wypełnienie a fazą ruchomą, eluentem ciecz. HPLC różni 

się od klasycznej chromatografii cieczowej wysokim ciśnieniem fazy ruchomej koniecznym 

do uzyskania przepływu tej fazy przez kolumnę chromatograficzną. 

Można wyróżnić wiele rodzajów chromatografii cieczowej. Jednym z kryteriów 

klasyfikacji jest natura stosowanej w kolumnie fazy stacjonarnej i rodzaj zachodzących 

procesów separacji. Według tego kryterium wydzielić chromatografię na: 

 

chromatografię adsorpcyjna: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem 

różnic między zdolnościami składników próbki do adsorbowania się na powierzchni 

aktywnego ciała stałego 

 

chromatografię podziałową: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem 

różnej rozpuszczalności składników próbki w fazie ruchomej i stacjonarnej 

 

chromatografię jonowymienna: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem 

różnej zdolności składników próbki do ulegania wymianie jonowej 

 

chromatografię wykluczania: technikę, w której do rozdzielania wykorzystuje się 

efekty wykluczania, wynikające z różnic w wielkościach  cząsteczek i/lub w ich 

kształcie albo ładunku. W przypadku gdy rozdział zależy od wielkości cząsteczek 

metodę określa się terminem „chromatografię wykluczania zależnego  od wielkości 

cząstek” natomiast gdy rozdział zależy np. od stopnia dysocjacji rozdzielanych 

związków – „chromatografią wykluczania jonów” 

Ponieważ  ćwiczenie dotyczy zastosowania techniki chromatografii adsorpcyjnej tylko 

ona będzie przedmiotem bardziej szczegółowej charakterystyki. 

Chromatografia adsorpcyjna 

Chromatografia adsorpcyjna jest, jak zaznaczono wyżej, techniką, w której rozdzielanie 

jest głównie wynikiem różnic między zdolnościami składników próbki do adsorbowania się 

 

1

na powierzchni aktywnego ciała stałego. Chromatografia adsorpcyjna dzielona bywa według 

podziału zgodnie z względną różnicą w polarnością polarności fazy ruchomej i stacjonarnej: 

•  Chromatografia w normalnym układzie faz. W tym układzie faza stacjonarna 

jest silnie polarnej natury np. silikażel a faza ruchoma jest niepolarna. 

Typowymi fazami ruchomymi są tu n-heksan lub tetrahydrofuran. Składniki 

próbki o polarnej strukturze są zatrzymywane dłużej na polarnej powierzchni 

fazy stałej niż składniki mniej polarne, czyli ich czas elucji z kolumny jest 

dłuższy, dłuższy jest też więc czas retencji tych związków. Im bardziej polarna 

faza ruchoma tym krótszy czas retencji. Słabością układów normalnofazowych 

jest istotna zależność retencji od nawet niewielkich ilości wody w fazach 

ruchomych. Nawet bowiem niewielkie zawilgocenie stosunkowo niepolarnych 

faz ruchomych w zdecydowany sposób wpływa na retencję co sprawia 

olbrzymie problemy z powtarzalnością analizy. 

•  Chromatografia w odwróconym układzie faz jest przeciwstawieniem tej 

pierwszej. Faza stacjonarna ma naturę niepolarną, hydrofobową natomiast fazą 

ruchomą jest ciecz polarna. W odwróconym układzie faz dokonuje się dzisiaj 

przeważającej części rozdziałów chromatograficznych w HPLC. Typowymi 

fazami ruchomymi są tu mieszaniny wody z metanolem, izopropanolem lub 

acetonitrylem. Typowymi fazami stacjonarnymi są krzemionki modyfikowane 

(hydrofobizowane) poprzez reakcję ze związkami krzemoorganicznymi. W 

chromatografii w odwróconym układzie faz związki mniej polarne 

zatrzymywane są mocniej przez hydrofobową powierzchnię fazy stałej niż 

składniki bardziej polarne, czyli ich czas elucji z kolumny jest dłuższy, dłuższy 

jest też więc czas retencji tych związków. Im mniej polarna faza ruchoma tym 

krótszy czas retencji. 

Polarność eluentu pełni zasadniczą rolę w każdym rodzaju technik HPLC. W 

przypadku chromatografii w odwróconym układzie faz woda jest polarnym 

składnikiem fazy ruchomej zaś metanol, izopropanol i acetonitryl pełnią rolę 

składników zmniejszających polarność fazy ruchomej. Organiczne  składniki fazy 

ruchomej mające bardziej hydrofobowy charakter, łatwiej uruchamiają analit 

zatrzymywany na fazie stacjonarnej, skracając tym samym czas elucji czyli skracając 

czas retencji związku. 

 Generalnie stosuje się dwa typy elucji: izokratyczną i gradientową. W pierwszym 

przypadku faza ruchoma o niezmiennym składzie pompowana jest poprzez kolumnę w 

 

2

czasie całego cyklu analizy. W przypadku elucji gradientowej skład fazy ruchomej  

zmienia się podczas cyklu analizy. 

Kolumny chromatograficzne stosowane w technice z odwróconym układem faz 

HPLC 

Kolumna wraz z wypełnieniem stanowi najistotniejszy element układu 

chromatograficznego, w którym zachodzi właściwy proces rozdziału. W zależności od 

wielkości próbki stosuje się w technice HPLC kolumny analityczne, mikrokolumny i 

kolumny preparatywne. Są to najczęściej rurki ze stali nierdzewnej o wypolerowanej 

powierzchni wewnętrznej różnej długości i średnicy wewnętrznej Do celów analitycznych z 

reguły stosuje się kolumny analityczne. Kolumnę chromatograficzną w technice HPLC, z 

technicznego punktu widzenia, charakteryzują następujące parametry: 

•  Średnica wewnętrzna kolumny: 0,3-0,46 cm dla kolumn analitycznych, 0,1 lub 

0,21 cm dla mikro kolumn, 0,8-1,0 cm dla kolumn semipreparatywnych i 2,0-

5,0 cm dla kolumn preparatywnych 

•  Długość kolumny: 3-25 cm dla kolumn analitycznych, 15 lub 25 cm dla mikro 

kolumn, 10-25 cm dla kolumn semipreparatywnych i preparatywnych 

(wyjątkiem są kolumny jonowymienne, których długość sięga 30 cm) 

•  Średnica ziaren wypełnienia wyrażana w µm: 3-10 dla kolumn analitycznych, 

3-8 dla mikro kolumn, 5-20 dla kolumn semipreparatywnych i 

preparatywnych. Jest to bardzo ważny parametr w technice HPLC. Wymiary 

cząstek 5 

µm to, w przypadku kolumn analitycznych, dobry kompromis 

pomiędzy skutecznością rozdziału na kolumnie, ciśnieniem zwrotnym i 

trwałością kolumny. Natomiast 3 µm ziarno umożliwia prowadzenie znaczenie 

szybszych rozdziałów chromatograficznych ponieważ umożliwia stosowanie 

wyższych przepływów fazy ruchomej niż to ma  miejsce w przypadku ziaren 

wypełnienia o większych rozmiarach. Mniejsze średnice ziaren to krótsze drogi 

dyfuzji i dlatego możliwe jest wykorzystanie wyższych przepływów bez utraty 

sprawności kolumny. Szczególne zastosowanie znalazły wypełnienia 

nieporowate o średnicy  ziaren ok. 1 –1,5 µm w analizie biomakromolekuł . 

•  Średnica porów wyrażana jest w nm lub Å. Średnica tych porów waha się od 7 

do 100 nm (70 do 1000 Å) przy czym w kolumnach analitycznych 

przeznaczonych do rozdziału substancji o  małych masach wykorzystuje się 

wypełnienia z wąskimi porami 7-12 nm, natomiast do rozdziału związków 

 

3

wielkocząsteczkowych z porami szerokimi tj. 15-100 nm. Wielkość  średnicy 

porów podawana jest w charakterystyce kolumny HPLC. 

Istotnym parametrem jest  średnica kolumny. Kolumna o mniejszej średnicy powoduje 

duże oszczędności w zużyciu fazy ruchomej, bez zmniejszenia liniowej prędkości przepływu 

zachowując przy tym taki czas analizy, żeby współczynnik retencji nie przekroczył wartości 

20 (Definicja współczynnika retencji, patrz p. 5.4). Jest to również czasem wprost wymogiem 

wobec zastosowanego detektora mas lub innego wymagającego minimalnej ilości 

wprowadzanego rozpuszczalnika (fazy ruchomej). 

W celu ochrony fazy stacjonarnej przed kolmatacją cząstkami stałymi, kolumny są 

zamknięte z dwóch końców filtrami (najczęściej ze stali nierdzewnej o średnicy porów 0,5-2 

µm) i łącznikami do połączenia z dozownikiem i detektorem.  

Ponieważ napełnianie kolumn do HPLC wymaga dobrego przygotowania i 

profesjonalnego oprzyrządowania, dlatego preferowaną drogą zaopatrywania się w kolumny 

jest zakup w specjalistycznej firmie dostarczającej wyposażenie chromatograficzne. Kolumny 

można napełniać techniką suchą i mokrą. Lepsze efekty przy małych ziarnach dają techniki 

mokre. Ich zasada polega na tym, że sporządza się zawiesinę wypełnienia w rozpuszczalniku 

o gęstości zbliżonej do wypełnienia i zawiesinę taką pompuje się przez kolumnę, stosując 

wysokie ciśnienie w granicach 50-100 MPa.  

Krzemionkowe wypełnienia stosowane w chromatografii z odwróconym układem faz 

wytwarzane są przeważnie drogą związania kowalencyjnymi wiązaniami organicznych 

silanów (tzw. fazy związane) lub osadzenia organicznych polimerowych warstw na 

powierzchniach podtrzymujących takich jak krzemionki lub Al

2

O

3

. Najczęściej 

wykorzystywane wypełnienia są wytwarzane w reakcjach powierzchniowych silanoli (grup 

Si-OH występujących na powierzchni SiO

2

) z chlorodimetyloalkilosilanami, reakcjach 

silanoli z trójfunkcyjnymi chloroalkilosilanami lub silanoli z trójfunkcyjnymi 

alkoksysilanami. Wśród wymienionych wyżej procesów najczęściej wykorzystywany jest 

pierwszy z nich tj. reakcja silanoli  z chlorodimetyloalkilosilanami.  

 Zaletą wytwarzania wypełnień metodą reakcji silanów z jedną grupą funkcyjną z 

silanolami jest jej powtarzalność ponieważ jedna grupa silanolowa reaguje z jedną cząsteczką 

chlorodimetylosilanu tworząc przewidywalna strukturę. Wypełnienia wykonywane tym 

sposobem charakteryzują się wysoką sprawnością dzięki szybkiej dyfuzji do wewnątrz i na 

zewnątrz cienkiego złoża fazy stacjonarnej. Retencja analizowanych próbek przeważnie 

rośnie wraz z długością  łańcucha węglowego (C

18

>C

8

>C

3

>C

1

), jakkolwiek nie należy 

oczekiwać zasadniczych różnic dla dłuższych  łańcuchów węglowych tj. C

8

 i C

18. 

Istotnym 

 

4

parametrem charakteryzującym fazę ruchoma jest natomiast powierzchniowe stężenie grup 

C

18

 wyrażane w 

µmol/m

2

. 

Jak wspomniano wyżej, niektóre wypełnienia kolumn mogą zawierać osadzane na 

nośniku fazy stacjonarne wytwarzane drogą polimeryzacji różnego typu monomerów. W 

handlu dostępne są także kolumny z fazą stacjonarną z tlenku glinu modyfikowanego 

polibutadienem czy z dwutlenkiem cyrkonu jako fazą stacjonarną. Fazy stacjonarne na bazie 

dwutlenku cyrkonu charakteryzują się wysoką odpornością termiczną oraz możliwością pracy 

w całym zakresie pH w przeciwieństwie do wypełnień opartych na SiO

2

, których zakres pracy 

mieści się granicach 1,5< pH <8. 

Detektory stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. 

Detektory to jedne z głównych elementów składowych wysokosprawnego 

chromatografu cieczowego. Rolą detektora jest dostarczanie w sposób ciągły informacji o 

składzie eluatu wypływającego z kolumny. Dobry detektor charakteryzować się musi 

odpowiednio wysoką czułością i małą objętością komory pomiarowej.  

Najczęściej stosowanymi detektorami w technice HPLC są: 

•  Detektor absorpcji w nadfiolecie i świetle widzialnym (UV-VIS) 
Jest to najczęściej stosowany detektor, którego działanie polega na pomiarze 

absorbancji w warunkach przepływowych w kuwecie o objętości 1 

µl. Źródłem światła jest tu 

niskociśnieniowa lampa rtęciowa umożliwiająca pomiar absorpcji w zakresie 200 – 600 nm, 

przy czym typową analityczną długością fali jest promieniowanie o 

λ= 254 nm. Ta długość 

fali absorbowana jest przez większość związków organicznych.  

Za absorpcję promieniowania odpowiedzialne są tzw. chromofory, grupy absorbujące 

promieniowanie UV w charakterystycznych dla siebie zakresach promieniowania. 

Chromoforami są np. podwójne wiązania C=C, zarówno alifatyczne jak i aromatyczne, 

wiązania C=N, N=O i inne. Czułość detektora  UV-VIS jest bardzo wysoka i dla silnie 

absorbujących związków dochodzi do 10

-11

 g oznaczanej substancji. Współczesne detektory 

umożliwiają  programowalną, w czasie cyklu chromatograficznego, zmianę długości fali, na 

optymalną dla w analizowanego tym momencie związku.  

 Jeszcze 

lepsze 

możliwości analityczne zapewnia modyfikacja detektora UV-VIS 

znana jako układ szeregu diodowego (angielska nazwa systemu to Diode-Array). W tym 

systemie przez próbkę w kuwecie przepływowej przechodzi światło polichromatyczne w 

zakresie UV-VIS i dopiero za kuwetą jest rozszczepiane na siatce dyfrakcyjnej. Następnie 

światło pada na zestaw fotodiod rozmieszczonych liniowo, tak, że każda z diod rejestruje 

 

5

tylko wąski (rzędu 2 nm) zakres światła. Z funkcjonalnego punktu widzenia jest to jakby 

zestaw równocześnie pracujących detektorów obejmujących swym zakresem całe widmo UV-

VIS. Zaletami tego systemu są: 

- możliwość rejestrowania całego widma UV-VIS dla każdej z eluowanych 

substancji 

- możliwość sprawdzania czystości eluowanego piku – eliminuje możliwość 

przeoczenia nakładających się substancji 

- daje 

możliwość korekcji linii podstawowej w przypadku wzrostu absorbancji na 

skutek stosowania gradientu. 

•  Refraktometr różnicowy. 
Opiera się na pomiarze różnicy współczynnika załamania światła między czysta fazą 

ruchomą a fazą zawierającą wymywany składnik. Zasadniczą wadą tego detektora jest 

wysoka wrażliwość na nawet małe zmiany temperatury -  wymaga stabilizacji temperatury ± 

0,001 

o

C aby osiągnąć czułość 10

-7

 jednostki współczynnika załamania. Jest więc detektorem 

mało wygodnym w użyciu. Ponadto detektor ten wyklucza stosowanie gradientu fazy 

ruchomej. 

•  Detektor fluorymetryczny (fluorescencyjny) 
Detektor fluorescencyjny jest około 100 razy czulszy (dla związków fluoryzujących) i 

znacznie bardziej selektywny niż detektor UV. Detektor ten wykorzystuje zjawisko 

fluorescencji tj. emisji światła przez substancję wzbudzone wysokoenergetycznym 

promieniowaniem UV. Jest detektorem selektywnym, gdyż związki mogą zostać wzbudzane 

tylko  światłem o określonej długości fali. Emitowane promieniowanie mierzone jest 

fotopowielaczem ustawionym pod kątem 90

o

 do źródła wzbudzenia. Detektor ten może 

wykrywać pikogramowe ilości (10

-12

 g) substancji. Stosuje się go często  w analityce 

wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA). Źródła wzbudzenia są takie 

jak te używane w konwencjonalnych spektrofluorymetrach: lampy rtęciowe, lampy 

ksenonowe, kwarcowe lampy halogenowe oraz lampy deuterowe. Najciekawsze efekty osiąga 

się przy pomocy laserów. Światło laserowe można skupić na bardzo małej powierzchni co 

skutkuje detektorami o bardzo małej komorze pomiarowej rzędu 1 nL. Tego typu detektory 

stosować można w mikrochromatografii cieczowej wykorzystując mikrokolumny lub 

kolumny kapilarne. 

•  Detektory elektrochemiczne 
Do tej grupy zaliczają się detektory kulometryczny i detektor polarograficzny. 

Detektorów tych zwykle używa się przy fazach zawierających wodę a takie właśnie fazy 

 

6

stosowane są szeroko w HPLC, dlatego można się spodziewać wzrostu ich znaczenia. 

Detektory te są detektorami selektywnymi o wielkiej czułości, jednak ich stosowanie uważa 

się za uciążliwe. 

•  Detektor konduktometryczny 
Zasada działania tego detektora opiera się na pomiarze przewodnictwa, stosowany jest 

w chromatografii jonowej 

•  Inne detektory stosowane w HPLC 
W HPLC stosuje się również detektory przejęte z chromatografii gazowej jak FID, 

ECD, PID czy MSD ale wiąże się to z rozwiązaniem problemu transportu całości lub części 

wycieku z kolumny LC, odparowaniu rozpuszczalnika po drodze i dostarczeniu nielotnych 

substancji do detektora. Z powyższych powodów w technice HPLC znalazł praktyczne 

zastosowanie tylko detektor masowy MSD, którego zalety rekompensują opisane wyżej 

problemy. 

 

2. CEL 

ĆWICZENIA 

Określenie wpływu polarności fazy ruchomej na retencję polarnych i niepolarnych związków 

analizowanych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Ponadto ćwiczenie 

służyć ma zapoznanie się z: 

•  Budową, zasadą działania i właściwościami detektorów stosowanych w wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej. 

•  Wykorzystaniem detektora UV-VIS w analizie związków organicznych.  
•  Wyznaczenie maksimum absorpcji badanego związku w oparciu o widmo UV-VIS. 
 

3. ZAKRES  MATERIAŁU WYMAGANY PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO 

WYKONYWANIA ĆWICZENIA. 

Charakterystyka i budowa kolumn stosowanych w wysokosprawnej chromatografii 

cieczowej: 

•  Rodzaje fazy stacjonarnej stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. 
•  Pojęcie uziarnienia i wielkości porów jako czynników charakteryzujących kolumnę, 

stosowane jednostki 

•  Pojęcia chromatografii w normalnym i odwróconym układzie faz. 

Detektory stosowane w chromatografii cieczowej 

•  Budowa i zasada działania 

 

7

•  Czułość i współczynnik odpowiedzi detektora 
•  Chromofory i ich charakterystyczne pasma absorpcji 

Pojęcia czasu retencji i indeksu retencji 

Zalecana literatura:  

J. Nawrocki, I. Obst : „Metody analizy zanieczyszczeń powietrza atmosferycznego i 

organicznych zanieczyszczeń wody pitnej” Wydawnictwo Naukowe UAM 

L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glach: „Practical HPLC method development” Second 

Edition, John Wiley & Sons, Inc. NewYork 1997 

 

4. SPRZĘT I ODCZYNNIKI 

•  Chromatograf cieczowy WATERS 2690 wyposażony w kolumnę SYMMETRY C18 2,1 

x 150 mm i detektor Waters 486 (UV-VIS) oraz automatyczny system nastrzyku próbki. 

•  Spektrofotometr UV-VIS HACH DR 4000U 
•  Warunki analizy: Składnik A: woda wysokiej czystości, składnik C: MeOH HPLC grade 

przepływ 1 ml/min, 

λ=230 nm 

•  Pipety automatyczne 20-200 µl, 100-1200 µl, 1000-5000 µl  
•  Naczyńka laboratoryjne o pojemności 1800 µl 

•  Podstawowe, metanolowe, roztwory toluenu (metylobenzenu) – związku niepolarnego 

oraz kwasu benzoesowego – związku polarnego, w stężeniach po 0,5 mg/ml. 

•  Metanol – cz.d.a. 
•  Azotan sodowy – roztwór 10 mg/L 

 

5. SPOSÓB WYKONANIA ĆWICZENIA 

5.1.WYZNACZENIE DŁUGOŚCI FALI ODPOWIADAJĄCEJ MAKSIMUM ABSORPCJI 

TOLUENU I KWASU BENZOESOWEGO 

 

8

 Wykorzystując spektrofotometr HACH DR 4000U wykonać analizę 

spektrofotometryczną roztworów toluenu i kwasu benzoesowego. Odczytać  długości fali 

odpowiadające maksimom absorpcji toluenu i kwasu benzoesowego wykorzystując do tego 

celu roztwory obu związków. Stwierdzić czy wśród wartości uzyskanych dla obu związków 

są długości fali wspólne dla obu związków identyczne czy też różnią się znacznie. W drugim 

przypadku istnieje konieczność zmiany długości fali detektora UV-VIS w trakcie 

prowadzenia analizy. 

5.2. WYKONANIE ROBOCZYCH ROZTWORÓW TOLUENU, KWASU 

BENZOESOWEGO ORAZ MIESZANINY OBU ZWIĄZKÓW 

Naczyńko laboratoryjne oznaczone TOLUEN zawiera podstawowy metanolowy roztwór 

toluenu (0,5 mg/ml) a naczyńko oznaczone K_BENZ podstawowy metanolowy roztwór 

kwasu benzoesowego (0,5 mg/ml).  

W naczyńkach laboratoryjnych o pojemności 1,8 ml wykonać rozcieńczenia roztworów 

podstawowych  TOLUEN i K_BENZ w celu osiągnięcia stężeń 10 mg/L oraz ich mieszaniny 

o stężeniu po 10 mg/L każdego z obu składników. W tym celu automatyczną pipetą pobrać 

porcje metanolu po 1500 µl i wprowadzić do naczyniek o pojemności 1,8 ml wstępnie 

opisanych jako TOLUEN-rob, K_BENZ-rob i MIX. Automatyczną pipetą o pojemności 20-

200 ul. usunąć z naczyniek TOLUEN-rob, K_BENZ-rob po 30 µl metanolu a z naczyńka 

MIX 60 

µl metanolu. Następnie z naczyńka TOLUEN pobrać porcje roztworu po 30 µl i 

przenieść je do naczyniek oznaczonych TOLUEN-rob i MIX a  z naczyńka K_BENZ pobrać 

porcje roztworu po 30 

µl i przenieść je do naczyniek oznaczonych K_BENZ-rob i MIX.  

Naczyńka szczelnie zamknąć nakrętką i wstrząsając nim wymieszać zawartość.  

5.3. ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA 

1. Na panelu kontrolnym chromatografu Waters ustawić skład fazy ruchomej na Składnik 

A (Woda) =50%, Składnik B=0%, Składnik C (Metanol) =50%, Składnik D=0% oraz 

przepływ na 1 ml/min. 

2. Wybrać  PROJECT „FAZY” w programie CSW. Przygotowane wzorce, w kolejności 

TOLUEN-rob, K_BENZ-rob i MIX umieścić w magazynku autosamplera. W oknie opisu 

próbek projektu „FAZY” wpisać informacje dotyczące, w przypadku pierwszej analizy, 

próbki TOLUEN-rob a drugiej próbki K_BENZ-rob.  

3. Nastawić na panelu sterującym chromatografu Waters, wyznaczoną 

spektrofotometrycznie wspólna dla obu związków długość fali detektora UV-VIS (w 

przypadku różnych wartości dla obu związków, pierwotnie zaprogramować  długości fali 

 

9

odpowiadającej maksimum absorpcji TOLUENU a przed wykonaniem drugiej analizy, 

długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji KWASU BENZOESOWEGO. 

4. Uruchomić bieg programu chromatograficznego z panelu sterującego chromatografu 

Waters wybierając analizę próbki nr jeden i objętość nastrzyku 20 

µl. Po analizie zebrać  i 

wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji 

TOLUENU.  

5. Jeśli wybrano dla obu związków różne długości fal, na panelu kontrolnym 

chromatografu Waters zmienić  długość fali na tę spektrofotometrycznie wyznaczoną dla 

KWASU BENZOESOWEGO. Powtórnie uruchomić program chromatograficzny z panelu 

sterującego chromatografu Waters wybierając analizę próbki nr dwa i objętość nastrzyku 20 

µl a po analizie zebrać  i wydrukować otrzymany chromatogram wyznaczając wysokość, pole 

i czas retencji KWASU BENZOESOWEGO. Zebrane wartości umieścić w tabeli. 

6. Jeśli wybrano dla obu związków różne długości fal, na panelu kontrolnym 

chromatografu Waters wybrać opcję zmiany długość fali w trakcie trwania cyklu 

chromatograficznego. Na panelu kontrolnym chromatografu Waters ustawić skład fazy 

ruchomej na Składnik A=10%, Składnik B=0%, Składnik C=90%, Składnik D=0% Po raz 

trzeci uruchomić bieg programu chromatograficznego z panelu sterującego chromatografu 

Waters wybierając analizę próbki nr 3 i objętość nastrzyku 20 

µl. Po analizie zebrać    i 

wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji 

TOLUENU i KWASU BENZOESOWEGO umieszczając zebrane wartości w tabeli.  

7. Powtarzać analizę opisaną powyżej (p.6) zmieniając skład fazy ruchomej zgodnie ze 

schematem umieszczonym w tabeli. Każdorazowo po analizie zebrać  i wydrukować 

otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji TOLUENU i KWASU 

BENZOESOWEGO umieszczając zebrane wartości w tabeli. 

5.4. WYZNACZENIE WSPÓŁCZYNNIKÓW RETENCJI. 

  

Współczynnik retencji definiowany jest wzorem: 

 

 

 

 

 

k=(t

R

-t

0

)/t

0

a martwy czas retencji: 

 

 

 

 

 

t

0

=V

m

/F 

gdzie: 

k – współczynnik retencji 

t

R

 – czas retencji piku w min 

t

0

 – martwy czas retencji w min 

 

10

V

m

 – martwa objętość kolumny (objętość fazy ruchomej w kolumnie) w ml 

F- przepływ przez kolumnę w ml/min 

Martwą objętość kolumny można wyznaczyć z przybliżonego wzoru: 

V

m

 

≈ 0,5

.

L

.

d

c

2

gdzie: 

L - długość kolumny w cm 

d

c

 – wewnętrzna średnica kolumny w cm 

Martwy czas retencji można również stosunkowo łatwo wyznaczyć doświadczalnie 

analizując roztwór NaNO

3

 lub roztwór uracylu. W tym celu wykorzystując spektrofotometr 

HACH DR 4000U wykonać analizę spektrofotometryczną przygotowanego roztworu NaNO

3

. 

Odczytać  długości fali odpowiadające maksimom absorpcji azotanu sodowego 

wykorzystujące do tego celu otrzymany roztwór związku. 

Wykonać analizę chromatograficzną roztworu w warunkach analizy opisanych w 

p.5.3.1. tj. A (Woda) =50%, Składnik B=0%, Składnik C (Metanol) =50%, Składnik D=0% 

oraz przepływ na 1 ml/min, nastawiając długość fali na wartość odpowiadającą maksimum 

absorpcji azotanu sodowego. Czas retencji związku jest martwym czasem retencji układu. 

Porównać uzykaną wartość z wyliczoną teoretycznie. 

 

6. OPRACOWANIE WYNIKÓW 

W sprawozdaniu z przebiegu ćwiczenia umieścić wyliczony i wyznaczony martwy czas 

retencji oraz tabelę (patrz wzór tab.) wraz z wyliczonymi współczynnikami retencji oraz 

ocenę: 

•  Wpływu polarności fazy ruchomej na wysokość, pole piku oraz współczynnik retencji 

obu związków. 

•  Korelacji pomiędzy polarnością fazy ruchomej a wysokością, polem piku oraz 

współczynnikiem retencji związku w zależności od jego polarności 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

11

Wzorcowa tabela wyników.  

Lp. Nazwa 

próbki  Udział 

składnika 

A w fazie 

ruchomej 

[%] 

Udział 

składnika 
C w fazie 

ruchomej

[%] 

Wsp. 

retencji 
toluenu 

[-] 

 

Wsp. 

retencji 

kwasu 

benzoes

owego 

[-] 

 

Wysokość/ 

pole piku 

toluenu 

[mV]/[mV

.

s] 

Wysokość/ 

pole piku 

kwasu 

benzoesowe

go 

[mV]/[mV

.

s]

1 

TOLUEN-rob 

50 50     

 

 

2 

K_BENZ-rob 

50 50 

 

 

 

 

3 

MIX 

10 90 

 

 

 

 

4 

MIX 

20 80 

 

 

 

 

5 

MIX 

30 70 

 

 

 

 

6 

MIX

 

40 60 

 

 

 

 

7 

MIX

 

50 50 

 

 

 

 

8 

MIX

 

60 40 

 

 

 

 

9 

MIX 

70 30 

 

 

 

 

10 

MIX

 

80 20 

 

 

 

 

11 

MIX

 

90 10 

 

 

 

 

 

 

12