MOLEKULARNE MECHANIZMY PATOGENEZY BAKTERYJNEJ

WYKŁAD 1, 27.02.2014r
Kolokwium końcowe obejmuje ćwiczenia i wykłady – 16 kwiecień; jednorazowa
poprawa w ciągu 8 dni.
dst 52 % dst+ 62 % db 75% db+ 82% bdb 90%

Kontrolowanie - to identyfikacja i leczenie.

Eradykacja – likwidowanie (np. poprzez wprowadzenie obowiązkowych
szczepionek).
Wg WHO rocznie z powodu chorób infekcyjnych umiera aż 15mln osób, w tym 63%
zgonów to dzieci, a 48% dorosłych.
Do 5 roku życia głównie są to choroby związane z infekcją dróg oddechowych i
biegunkami. Natomiast po 5 roku życia to gruźlica, odra, malaria, AIDS oraz infekcje
dróg oddechowych.

Szerzenie się schorzeń masowych:

•wywołane przez organizmy patogenne nowo zidentyfikowane, uprzednio
nieznane czynniki infekcyjne
•nawracające: pojawiają się na nowo, które na drodze mutacji lub
horyzontalnego transferu genów nabyty nowe geny, znacząco zwiększające
ich wirulencję oraz oporność na antybiotyki

Nowe patogeny i choroby:

- wirusy: WZW (wirus zapalenia wątroby) typu C – wszczepienny oraz typu E
- pokarmowe
- priony
- bakterie:

•pałeczki G -: Legionella pneumofila wodująca chorobę legionistów
•krętki G+: Borelia bugdorferi powodująca boreliozę
•spiralne pałeczki G+: Campylobacter jejuni powodująca silne
biegunki
• Staphylococcus aureus wytwarzający superantygen; wstrząs
septyczny, leczony wankomycyną
•pałeczki G- o heliakalnym kształcie, np. Helicobacter pylori,
powodujący wrzody żołądka

•pałeczki G-; grupy enterokrwotoczne E. coli oraz powodujący
hemolityczny zespół nerkowy
•pałeczki G-; Bartonella huselae pochodząca od podrapania przez
kota

Patogeny nawracające:

•prątki kwasoodporne – Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy)

•przecinkowce G - - Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery)

•pałeczki G- - Yersinia pestis powodująca dżumę

•Neisseria meningitidis powodująca meningokokowe zapalenia opon

mózgowordzeniowych

•maczugowce G+ Corynebacterium diptheriae powodujący błonicę

Przyczyny chorób zakaźnych:

-wzrost liczby ludności na kuli ziemskiej
-starzenie się populacji związane z immunosupresją czyli osłabieniem
odpowiedzi immunologicznej
-duża częstość podróży międzynarodowych
-ruchy migracyjne (przenikanie mikroorganizmów z regionów
endemicznych)
-globalny charakter handlu żywnością
-niedostateczna kontrola zakażeń szpitalnych
-nadmierne stosowanie antybiotyków w terapii chorych i hodowli zwierząt

Postulaty Kocha – warunki, jaki musi spełnić drobnoustrój, aby być uznanym za
czynnik etiologiczny;
•być izolowany od wszystkich osób chorych wykazujących identyczne zmiany
chorobowe i objawy kliniczne
•musi być izolowany od chorego w czystej hodowli
•po wyizolowaniu i pasażowaniu w czystej kulturze jest zdolny do wywołania
identycznej choroby u nowego zakażonego osobnika
•należy go ponownie izolowane w czystej kulturze od eksperymentalnie zakażonego,
w celu spełnienia 3 postulatu

Istnieją odstępstwa od postulatów:
•wiele mikroorganizmów patogennych nie wywołuje objawów chorobowych, co
związane jest z nosicielstwem
•u osób z obniżoną odpornością zmiany chorobowe mogą być wywołane przez
organizmy nie patogenne
•nie wszystkie bakterie da się hodować na pożywkach mikrobiologicznych, np. 80%
bakterii z jelita grubego

Molekularne postulaty Kocha, w których przedstawił on kryteria, jakie
powinien spełniać gen, aby był zakwalifikowany do czynników wirulencji:
•gen taki powinien występować tylko w genomie szczepów chorobotwórczych,
natomiast w szczepach nie wirulentnych nie powinien ulegać ekspresji
•powinien ulegać ekspresji na pewnym etapie infekcji, a kodowany przez niego
czynnik wirulencji powinien indukować odpowiedź immunologiczną komórkową lub
humoralną
•inaktywacja genu lub grupy genów kodujących czynnik

Choroba – manifestacja klinicznie widocznych objawów, które pojawiają się w wyniku
kolonizacji i oddziaływania drobnoustroju na organizm gospodarza. Objawy są
wypadkową wzajemnego oddziaływania między patogenem, a reakcjami obronnymi
organizmu gospodarza. Na proces ten mają też wpływ czynniki środowiskowe, np.
dieta, palenie. Jeśli kolonizacja przez mikroorganizmy nie wywołuje objawów
klinicznych, to jest to komensalizm.

Infekcja – zakażenie; proce wniknięcia drobnoustroju zdolnego do wywołania
choroby w wyniku uszkodzenia naturalnych barier ochronnych, namnażania się tych
bakterii oraz kolonizacji gospodarza.

Mikroorganizm patogenny – inaczej chorobotwórczy; zdolny jest do wywołania
choroby w organizmie gospodarza. Do nich zaliczamy bakterie bezwzględnie
chorobotwórcze, np. Vibrio cholerae, Shigella i Salmonella oraz patogeny
oportunistyczne.

Nosiciel – człowiek zdrowy bez zmian chorobowych, u którego w organizmie rezydują
i namnażają się organizmy patogenne.

WYKŁAD 2, 06.03.2014r

Adhezja bakterii do komórek gospodarza:

-fimbrylarne mediatory adhezji

-adhezyny niefimbrylarne

-

Czynniki wirulencji bakterii:
Patogeniczność bakterii wyrażana jest poprzez ich wirulencję. Jest to wieloetapowe
oddziaływanie pomiędzy czynnikami wirulencji i układem odpornościowym
gospodarza. Jest ona uwarunkowana:

•adhezją do komórki gospodarza

•inwazyjnością

•toksycznością

•zdolnością do przyswajania Fe

Adhezja jest pierwszym etapem, który odgrywa kluczową rolę w procesie patogenezy
zakażeń bakteryjnych.
Proces ten umożliwia patogenom kolonizację tkanek i narządów oraz chroni te
bakterie przed działaniem nieswoistych mechanizmów obronnych organizmu
gospodarza..
Wszystkie bakterie patogenne wykształciły mechanizmy warunkujące ich ścisłe
połączenie z komórką gospodarza.
Procesy adhezji zachodzą dwuetapowo:

•Nieswoiste oddziaływania związane z właściwościami fizykochemicznymi
bakterii, np. siły van der Waalsa, potencjał elektrostatyczny, właściwości
hydrofobowe związane z otoczkami bakterii i glikokaliks, warunkujące
przyciąganie mikroorganizmów do komórki gospodarza.

•Specyficzne interakcje, w których biorą udział bakteryjne białka
powierzchniowe – adhezyjny, które wiążą się specyficznie z receptorami
komórki gospodarza.

Receptory adhezyn:
Przeważnie glikoproteiny lub glikolipidy. Na powierzchni komórek nabłonkowych,
adhezyjny bakteryjne rozpoznają determinanty węglowodanowe lub aminokwasowe
receptorów.

Oddziaływanie typu pektynowego – reakcja węglowodan białko

Adhezja bakterii do makrofagów warunkowana jest oddziaływaniami pomiędzy
aminokwasowymi fragmentami receptorów i komplementarnego liganda
bakteryjnego.

Zastosowanie badań nad adhezją
Badania dotyczące procesów adhezji do komórek gospodarza koncentrują się na
poznaniu struktury przestrzennej białek oraz analizie ich wzajemnych oddziaływań.
Dostarczają one informacji umożliwiających zrozumienie zachodzących procesów
oraz mogą być wykorzystywane do opracowania nowych leków będących
inhibitorami białek adhezyjnych.

Rodzaje adhezyn:
-fimbrylarne (fimbrie i pilusy)
-niefimbrylarne

Fimbrie (pilusy)
W procesie adhezji niektórych bakterii G+ (paciorkowców i maczugowców) oraz
większości G- chorobotwórczych do komórek gospodarza biorą udział białkowe
struktury adhezyjne – fimbrie i pile.
Fimbrie uczestniczące w procesie koniugacji to pile i pilusy.

Fimbrie łączą się z receptorami, którymi są cukry wchodzące w skład glikoprotein i
glikolipidów tkanek gospodarza.
Geny kodujące białka, niezbędne do powstawania struktur adhezyjnych, są
zorganizowane w operony, w skład których wchodzą białka strukturalne, pomocnicze
i regulatorowe. Białkowe składniki fimbrii są transportowane przez błonę komórkową
poprzez II system sekrecji.

W przeciwieństwie do cząstek fimbrie mają zróżnicowaną budowę:
▪ mogą różnić się długością 0,2-1 um i średnicą 2-12 um
▪ charakteryzują się zróżnicowaną morfologią (giętkie / sztywne)
▪ wewnątrz może znajdować się kanał biegnący wzdłuż włókna

Rodzaje fimbrii:
W ZALEŻNOŚCI OD FUNKCJI, MECHANIZMÓW EKSPRESJI, BUDOWY I POCHODZENIA:
▪ CFA – związane z kolonizacją, tzw. czynnik kolonizacyjny
▪ Pap – biorące udział w patogenezie odmiedniczkowego zapalenia nerek
▪ S – rozpoznają receptory sjalogalaktozowe
▪ TCP – ich synteza jest regulowana przez toksyny
▪ BFP / TFP – tworzą wiązkę
▪ K88, K99 – pochodzą od różnych serotypów szczepów E.coli

POD WZGLĘDEM BUDOWY:
▪ I klasa – o średnicy 0,7nm, zbudowane z wewnętrznego kanału, części dystalnej i
trzonu, podstawą jest białko błony zewnętrznej, czyli białko adaptorowe i adhezyna,
należą ty fimbrie typu 1 i P
▪II klasa – cienkie, długie, giętkie, o średnicy 2-3 nm, enterotoksyczne szczepy E.coli
▪ III klasa – spiralne, średnica 2-4 nm, silnie zwinięte struktury powierzchniowe
wytwarzane przez szczepy E.coli lub Salmonella
▪IV klasa – giętkie, grube, średnica 6nm, często tworzą wiązki zbudowane z tysięcy
podjednostek zbudowanych z białka – piliny, są to TFP fimbrie, czynniki wirulencji G-.
Mają zdolność do tworzenia mikrokolonii i biofilmów oraz do wiązania fagów.

*jeden gatunek bakterii może wytwarzać wiele rodzajów fimbrii

Tropizm komórkowy
Zasięg aktywności mikroorganizmów chorobotwórczych jest specyficzny dla
określonych gatunków bakterii. To znaczy, że jest widoczna swoistość bakterii do
komórek gospodarza. Nieliczne bakterie G+ (Staphylococcus, Streptococcus) oraz G-
(E.coli) wykazują zdolność kolonizowania różnych tkanek, a większość infekuje
osobniki danego gatunku, zajmując ściśle określone środowisko. Jest to tropizm
tkankowy.
Mechanizm tego procesu jest związany ze specyficznością odpowiednich receptorów
na komórce gospodarza dla adhezyn bakteryjnych.
Przykład:

Szczepy E.coli wytwarzają fimbrie typu P i kolonizują tylko komórki
nabłonkowe nerki oraz wytwołują stany zapalne nerek.

FI wiążą się z białkami połączonymi z mannozą w komórkach pęcherza
moczowego.

Bakterie, u których nie stwierdzono ekspresji fimbrii, nie kolonizują układu
moczowego i nie powodują stanów zapalnych.

Adhezyny niefimbrylarne – składowe ściany komórkowej; wiążą się bezpośrednio z
receptorami komórki gospodarza lub pośrednio poprzez glikoproteiny macierzy
międzykomórkowej.

Bakterie G-:
→ lipooligosacharydy błonowe, np. u Neisseria uczestniczą w adhezji i inwazji
bakterii do komórek nabłonkowych gospodarza, poprzez wiązanie z receptorami
sjaloglikoproteinowymi. Chronią one bakterie przed aktywnością fagocytarną
komórek żernych. Uwalniane są do środowiska w wyniku działania antybiotyków lub
odpowiedzi immunologicznej zakażonego organizmu i powodują lizę komórek
nabłonkowych układu oddechowego. Składniki te są trudno usuwalne z organizmu
gospodarza. Po terapii mogą utrzymywać się w nim przez kilka miesięcy.

→ białka błonowe zewnętrzne OMP – warstwa półprzepuszczalna, zbudowana z
białek, fosfolipidów i LPS. Funkcje:

- czynnik wirulencji

- inwazyny

- tworzą poryny ułatwiające dyfuzję

- warunkują transport bierny

- warunkują transport aktywny

- białka enzymatyczne (proteaza i fosfolipaza)

- uczestniczą w interakcjach z układem odpornościowym gospodarza

- białka strukturalne

- białka receptorowe dla fagów i kolicyn

→ lipoproteiny i lipo polisacharydy ściany komórkowej stanowią molekularne wrota
patogenów, które rozpoznawane są przez receptory na komórce gospodarza

→ białka powierzchniowe UspA łączą się fibronektyną. Lamininą, witronektyną na
powierzchni komórek nabłonkowych, śródbłonka i limfocytów.

Bakterie G+
→ liczne powierzchniowe białka bakteryjne zaliczane do swoiście rozpoznających
glikoproteiny macierzy międzykomórkowej tkanek gospodarza, do których należą
białka globularne w surowicy i płynach ustrojowych oraz jego składniki strukturalne
tkanek. Łączą się z fibronektyną, witronektyną, lamininą, fibrynogenem oraz
plazminogenem. Gronkowce mogą tu powodować zakrzepy przez koagulaty tworzące
stronty.

→ białka powierzchniowe M – wiążą się swoiście z receptorami błonowymi komórki
gospodarza. Ich funkcją jest zapobieganie fagocytozy bakterii przez komórki żerne
gospodarza

→ kw. lipotejchojowe – nadają komórce bakteryjnej właściwości hydrofobowe
poprzez tworzenie kompleksów z białkiem M, co ułatwia nieswoiste łączenie z
komórką gospodarza

Skutki procesu adhezji:
• zapobieganie uwalniania mikroorganizmów poprzez działanie płynów tkankowych
• bezpośredni kontakt bakterii z komórką gospodarza
• agregacja bakterii i tworzenie biofilmów
• umożliwienie kolonizacji organizmu przez przez bakterie patogenne
• ułatwione oddziaływanie toksyn bakterii, np. E.coli
• umożliwienie inwazji mikroorganizmów do komórki i tkanek gospodarza oraz
rozprzestrzenianie się w organizmie, np. Salmonella i Shigella
• indukcja mechanizmów obronnych gospodarza w postaci odpowiedzi komórkowej i
humoralnej
• wytwarzanie cytokin i mediatorów stanów zapalnych

WYKŁAD TRZECI, 13.03.2014r.

Bakterie wewnątrzkomórkowe:
Liczne gatunki bakterii chorobotwórczych to patogeny wewnątrzkomórkowe, zdolne
do wnikania, przeżywania oraz do namnażania się wewnątrz komórek
eukariotycznych, np. w komórkach nabłonkowych, śródbłonka, makrofagach i
hepatocytach.
Wewnątrz komórek gospodarza bakterie stają się niedostępne dla wielu
mechanizmów obronnych.

Do takich patogenów należą:

• pałeczki G- z rodzin Enterobacteriaceae (Salmonella i Shigella)

• pałeczki G- Legionella pneumophila

• pałeczki G+ Listeria monocytogenes

• prątki G+ kwasoodporne Mycobacterium spp. (leprae i tuberculosis)

Niektóre bakterie żyjące poza komórką gospodarza mogą namnażać się w jej wnętrzu:

• ziarniaki G+ Streptococcus i Staphylococcus

• maczugowce G+ Corynebacterium diphteriae

• laseczki G+ beztlenowe Clostridium

• ziarniaki G- Neisseria

Przebudowa cytoszkieletu komórki gospodarza
U bakterii wewnątrzkomórkowych inwazja do komórek eukariotycznych wymaga
indukowania przebudowy cytoszkieletu i kondensacji włókien aktynowych komórek
gospodarza.

Szkielet aktynowy zapewnia zdolność do ruchu komórki i możliwości przemieszczania
się organelli komórkowych oraz podlega stałym przemianom – polimeryzacji
i depolimeryzacji aktyny.

Bakterie patogenne wykorzystują przemiany cytoszkieletu komórek gospodarza do
własnych celów – indukowania inwazji przez stymulowanie budowy aktyny związanej
z błoną komórkową lub też poruszania się w komórce gospodarza poprzez
stymulowanie polimeryzacji aktyny na biegunie komórki bakteryjnej.

Wszystkie patogeny wykorzystują w tym celu białka należące do kompleksu ARP –
bakterie indukujące polimeryzację aktyny.

Mechanizmy inwazji komórek bakterii do komórek gospodarza

1. SUWAKOWY – w przypadku Listeria i Yersinia polega na wiązaniu się
adhezyn z białkami wewnątrzbłonowymi komórki gospodarza, co prowadzi
do polimeryzacji aktyny i zamknięcia bakterii w wakuoli. Białka łączone są
z receptorami.
2. TRIGGER – np. Salmonella i Shigella, warunkowany jest translokacją
bakteryjnych białek efektorowych z działem systemu sekrecji typu III. Białka
te indukują zmiany w cytoszkielecie komórki gospodarza, prowadzą do

pofałdowania błony komórkowej, a w konsekwencji do wchłaniania
patogenów i utworzenia wakuol. Wniknięcie białek do komórki, potem
dopiero indukują. Białka wprowadzane są do wnętrza przez igły.

Wpływ bakterii na reorganizację aktyny
• inwazja
• zapobieganie pochłanianie bakterii przez komórki gospodarza

fagocytoza – hamowanie przez Yersinia poprzez niszczenie aktynowych
części cytoszkieletu; dotyczy to makrofagów i granulocytów. Jest to
mechanizm obronny bakterii
silna adhezja EPEC poprzez polimeryzację aktyny komórek nabłonkowych
jelita, wybrzuszania komórki utrzymujące na powierzchni bakterie

• przemieszczanie się bakterii miedzy komórkami poprzez utworzenie tzw. ogona
aktynowego. Warunkuje to rozwój zakażenia z miejscowego na ogólnoustrojowe.

Sposoby wnikania bakterii do komórek gospodarza:
a) na drodze fagocytozy w sposób bierny – pochłanianie bakterii przez profesjonalne
fagocyty, czyli komórki żerne, np. makrofagi, monocyty i neutrofile. W wyniku tego
następuje internalizacja komórek bakteryjnych na skutek aktywności komórek
eukariotycznych
b) w sposób aktywny:

▪ poprzez indukowaną endocytozę przez nieprofesjonalne fagocyty, np.
komórki nabłonkowe, endotelialne, fibroblasty, hepatocyty, erytrocyty oraz
limfocyty
▪ indukowaną fagocytozę (pobudzenie komórek żernych do pochłaniania)
▪ aktywną inwazję

Inwazyjność bakterii:
Procesy indukujące inwazyjność:

-indukowana endocytoza
-indukowana fagocytoza
-aktywna inwazja

Podczas indukowanej fagocytozy i endocytozy następuje polimeryzacja włókien
aktynowych. Procesy te hamowane są przez cytochalazynę D.

Aktywna inwazja polega na inwazji bakterii, podczas której nie następują zmiany
konformacyjne aktyny. Proces ten nie jest hamowany przez cytochalazynę D.

Tworzenie wakuoli:
Niezależnie od różnic w mechanizmach inwazyjności warunkujących wniknięcie
patogenu do komórki gospodarza, pierwszym etapem procesu inwazji jest otoczenie
bakterii przez błonę komórkową gospodarza i wytworzenie wakuoli. Panujące w niej
warunki szczególnie po fuzji fagosomu z lizosomem są niekorzystne dla patogenów.

Bakterie rozwinęły mechanizmy umożliwiające im przeżycie wewnątrz komórki
gospodarza poprzez:

• modyfikację warunków panujących wewnątrz wakuol (Legionella.
Mycobacteriium i Salmonella)
• ucieczkę do cytozolu komórki gospodarza i namnażanie się w cytoplazmie
(Listeria i Shigella)

Nisze wewnątrzkomórkowe
W wyniku inwazji wewnątrzkomórkowe bakterie wykazują różne strategie do
utrzymania się w komórce. Wykorzystują one 3 różne środowiska:

• Salmonella namnaża się i bytuje w kwaśnym środowisku lizosomów

• namnażanie się w obojętnym pH wakuoli, co zapobiega fuzji z lizosomami

stosują Legionella i Mycobacterium

• liza wakuoli, np. Shigella i Listeria

Etapy fagocytozy:

• chemotaksja – docieranie z krwią do miejsca zakażenia

• rozpoznanie i łączenie z patogenami

• pinocytoza

• tworzenie fagosomu – wodniczka komórek żernych

• tworzenie fagolizosomu

• degradacja patogenu

Indukowana endocytoza i fagocytoza
W wyniku adhezji do komórki gospodarza następuje ścisłe związanie bakterii
z powierzchnią komórki, co pociąga za sobą transdukcję sygnału, który indukuje
zmiany w cytoszkielecie. Prowadzi to do pochłonięcia i fagocytozy patogenów.
Przykładem bakterii, które dokonują inwazji komórek gospodarza na drodze

indukowanej fagocytozy i endocytozy to Listeria monocyogenes, która powoduje
listeriozę pochodzącą z zakażonych produktów spożywczych.
Po przełamaniu bariery przewodu pokarmowego bakterie przemieszczają się
z prądem krwi i limfy do węzłów chłonnych, wątroby i śledziony.
Postaci kliniczne;

-zapalenie opon mózgowordzeniowych

-zapalenie mózgu

-bakteriemia

-zakażenia okołoporodowe

Wewnątrzkomórkowy cykl rozwojowy Listeria monocytogenes:
1. Adhezja oraz inwazja do komórek gospodarza z udziałem białek powierzchniowych,
czyli interna liny A i B oraz hydrolaz ściany komórkowej. Internaliny komórki
bakteryjnej łączą się z receptorem transbłonowym komórki gospodarza, co indukuje
polimeryzację włókien aktynowych i warunkuje wnikanie bakterii do komórki

2. Utworzenie pęcherzyka fagocytarnego, którego szybkie zakwaszenie wymusza na
bakterii reakcję obronną, polegającą na hamowaniu fagosomu i fuzji z lizosomy

3. Aktywne uwalnianie bakterii z wakuoli – listeriolizyna i fosfolipazy powodują lizę
błony i ucieczkę z wakuoli

4. Namnażanie się bakterii w cytoplazmie i gromadzenie się wokół komórki
bakteryjnej fi lamentów aktyny, które organizują się w długie włókna przyłączone do
jednego z biegunów – białko ActA

5. Polimeryzacja włókien wyzwala siłę motoryczną, którą bakterie wykorzystują do
przemieszczania

6. Utworzenie wypustki w wyniku kontaktu bakterii z błoną komórkową. Następuje
inwazja bakterii do sąsiednich komórek.

Inwazyjność bakterii z rodzaju Salmonella
To fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy, który w zależności do serotypu i
gatunku infekowanego gospodarza wywołuje różne objawy chorobowe.

W Polsce występują:

• S. enterica serotyp typhi – patogen tylko człowieka, powoduje dur brzuszny,
czyli ciężkie zatrucie pokarmowe i infekcje ogólnoustrojowe
• S. enterica enteritidis oraz typhimunium powodują salmonellozy człowieka
i zwierząt stałocieplnych

Cechą wszystkich tych bakterii jest zdolność do inwazji komórek nabłonkowych jelit
i komórek M w kępkach Peyera doprowadzając do ich zniszczenia.

Przebieg zakażenia Salmonella i czynniki wirulencji
Adhezja – fimbrie adhezyjne

Inwazja – produkcja genów zlokalizowanych na wyspach patogenności SPI-1-5; białka
III systemu sekrecyjnego, białka inwazyjne Sip. Doustna droga zakażenia.
Apoptoza makrofagów powoduje rozwój procesu zapalnego.
•pokonanie bariery żołądkowej i niekorzystnych czynników w jelitach
•wnikanie do komórki M w kępkach Peyera
•układ limfatyczny
•wnikanie do makrofagów

Inwazyjność Shigella
Wywołuje stany zapalne jelit o różnorodnych objawach klinicznych, od wodnistych
stolców do ostrych, krwawych biegunek zwanych dyzenterią lub czerwonką. Jest to
szczególnie groźne dla małych dzieci i noworodków. W krajach rozwijających się jest
endemiczna.
Gatunki chorobotwórcze:
-S. sonei
-S. dysenterie
-S. flexneri
-S. boydii

Mechanizmy patogenezy czerwonki:
• pokonanie śluzówki jelit i adhezja do komórek nabłonkowych okrężnicy
• indukowana endocytoza komórek nabłonkowych na skutek intensywnej
przebudowy cytoszkieletu aktynowego. Proces ten uwarunkowany jest przez białka
kodowane przez geny zlokalizowane na dużym plazmidzie wirulencji. Geny
zorganizowane są w dwa operatory:

I – koordynuje białka III systemu sekrecyjnego, niezbędne do aparatu
sekrecyjnego
II – koduje białka związane z inwazją (Ipa) oraz białka związane z
przemieszczaniem międzykomorkowym (Ics)

Sygnałem powodującym uwolnienie białek Ipa do środowiska jest adhezja bakterii do
komórek nabłonkowych, w wyniku czego następuje indukcja polimeryzacji aktyny
i wniknięcie bakterii.
Ucieczka z wakuoli warunkowana jest aktywnością lityczną Ipa.

• namnażanie i rozprzestrzenianie w cytoplazmie w procesie zależnym od aktyny
• inwazja sąsiednich komórek nabłonkowych
•podczas infekcji następuje apoptoza makrofagów i rozwój stanu zapalnego

Enteropatogenne szczepy E. coli
Większość z nich nie jest patogenna. Niektóre jednak nabyły cechy na drodze
horyzontalnego transferu genów, które warunkują rozwój różnych chorób.

Patotypy E.coli wywołują:
-zapalenie dróg moczowych (szczepy uropatogenne)
-zapalenie opon mózgowych
-biegunki
-posocznicę

Wśród enteropatogenów występują szczepy:
• enterotoksyczne – wytwarzające toksyny ETEC
• enteroagregacyjne – wytwarzają skupiska komórek i toksyny EAEC
• enteroinwazyjne – wytwarzają toksyny EIEC, wywołujące silne biegunki
• zdolne do dyfuzyjnej adhezji DAEC
• enteropatogenne EPEC
• enterokrwotoczne EHEC, wywołujące ciężkie uszkodzenia nerek u dzieci

WYKŁAD 4, 20.03.2014r

Mechanizmy patogenności sześciu patotypów szczepów E. coli:
EPEC – adhezja do komórek jelita cienkiego, tworzenie mikrokolonii (fimbrie
tworzące wiązkę) i piedestału.
EHEC- adhezja do nabłonka okrężnicy i aktywność toksyny stx
EPEC i EHEC – powodują zanik mikrokosmków rąbka szczoteczkowa tego
ETEC – adhezja do enterocytów jelita cienkiego i wytwarzanie toksyn LT (labilne) i ST
(stabilne)
EAEC – kolonizują nabłonek jelita cienkiego i grubego, czyli tworzą biofilny
EIEC – jak w przypadku Shigella spp.
DEAC – adhezja do komórek nabłonkowych jelita cienkiego oraz indukcja sygnału
warunkującego wytwarzanie długich wypustek oplatających bakterie

Czynniki wirulencji szczepów E. coli kodowane są przez geny zlokalizowane w:
• hemolizynowych wyspach patogenności (szczepy uropatogenne)
• wyspach patogenności LEE (erytrocyty)
• plazmidach warunkujących wytwarzanie toksyn

Toksyny bakteryjne:
ENDOTOKSYNY
Odnosi się do LPSu ściany komórkowej bakterii G-.
LPS składa się z:
- lipidu A odpowiedzialnego za właściwości immunomodulujące i toksyczne
- części rdzeniowej zbudowanej z wielocukrów
- łańcucha o-swoistego zbudowanego z podjednostek cukrowcowych, warunkujących
swoistość antygenową i bezpośrednie oddziałuje na środowisko zewnętrzne

LPS wykazuje dużą różnorodność pod względem właściwości fizykochemicznych,
masy cząsteczkowej oraz struktury chemicznej.

Właściwości LPSu:
-immunogenne (indukcja wytwarzania przeciwciał)
-immunomodulacyjne (nieswoiście aktywuje limfocyty B, T i makrofagi)
-cytotoksyczne (wywołuje gorączkę, czyli ma właściwości pirogenne, objawy
grypopodobne, spadek ciśnienia)
-indukuje stany zapalne (zwiększenie poziomu cytokin i chemokin prozapalnych)

LPS wiąże się do receptorów rozpoznających wzorce molekularne patogenów,
w wyniku czego następuje aktywacja wytwarzania przeciwciał i rozwój stanu
zapalnego. W wyniku oddziaływania LPS z glikoproteinami macierzy
zewnątrzkomórkowej gospodarza następuje zaburzenie integralności komórek
nabłonkowych. Nadmierna ilość wolnego LPS w organizmie gospodarza powstałego
na skutek działania antybiotyków może doprowadzać do wstrząsu septycznego.

Wstrząs septyczny jest wywołany przez bakteryjne zakażenia krwi (posocznice).
Następują zmiany w układzie krwionośnym, uszkodzenie narządów wewnętrznych,
w tym nerek i jelit, ostra niewydolność wątroby. Niekiedy wstrząs septyczny jest
konsekwencją namnażania się bakterii patogennych we krwi i narządach.
Charakteryzuje się on wysoką śmiertelnością.

EGZOTOKSYNY
-oddziałujące na błonę komórkową gospodarza
-aktywne w komórkach gospodarza

Podział egzotoksyn:
• w zależności od swoistości komórkowej – hepatotoksyny, neurotoksyny,
leukotoksyny
• w zależności od gatunku bakterii lub nazwy choroby – toksyny tężca, cholery,
krztuśca czy czerwonki
• w zależności od mechanizmu oddziaływania na komórki gospodarza:

→ wpływają na powierzchnię komórki i uszkadzają błonę cytoplazmatyczną
→ oddziałują z receptorami komórek i wywołują wielopoziomową
odpowiedź
→ wprowadzane bezpośrednio do komórek gospodarza, wpływają na
strukturę komórki i jej metabolizm

Egzotoksyny oddziałujące na błonę komórkową gospodarza.
Wiele toksyn bakterii chorobotwórczych wydziela do środka toksyny cytolityczne. Są
to białka zwane również toksynami zależnymi od cholesterolu. Mają one zdolność do
wbudowywania się w błonę komórkową i poprzez to do tworzenia porów. Składają się
z pojedynczego łańcucha białkowego.

Pałeczki Listeria moncytogenes są jedynym wewnątrzkomórkowym patogenem
wytwarzającym cholesterolozależne toksyny (listeriozynę i fosfolipazy),
umożliwiające ucieczkę bakterii z fagolizosomu do cytoplazmy i rozprzestrzenienie się
po organizmie gospodarza.

Superantygeny
Stanowią grupę białkowych toksyn wytwarzanych przede wszystkim przez
gronkowce i paciorkowce. Są to cząsteczki, które oddziałują z limfocytami T,
powodując nadmierną aktywację tych komórek, co wiąże się z rozwojem stanu
zapalnego, który odgrywa ważną rolę w rozwoju choroby i często doprowadza do
wstrząsu septycznego.

Staphylococcus aureus – gronkowcowa toksyna wstrząsu toksycznego, enterotoksyny
A-H, toksyny epidermo lityczne

Streptococcus pyogenes – streptolizyna (hemolizyna o właściwościach
cytotoksycznych i kardiotoksycznych).

Yersinia pseudotuberculosis
Superantygeny mogą być przyczyną wielu objawów – gronkowcowego
i paciorkowcowego wstrząsu toksycznego, zakażeń przewodu pokarmowego, ciężkich
uszkodzeń skóry.

Toksyny powodujące tworzenie porów w komórce gospodarza
Zwane są one lizynami lub czynnikami litycznymi. Do oznaczenia aktywności tych
toksyn wykorzystuje się często erytrocyty, dlatego wiele z nich określa się jako
hemolizyny. Erytrocyty natomiast nie są fizjologicznym celem działania toksyn, które
przede wszystkim wykazują aktywność w stosunku di komórek nabłonkowych.

Duże pory:
• streptolizyna – S. pyogenes
• pneumolizyna – S. pneumoniae
• cereolizyna – B. cereus
• tetanolizyna – C. tetani
• botulinolizyna – C. botulinum
• perifringolizyna – C. perifringens
• listeriolizyna – L. monocytogenes

Po związaniu toksyn z błoną następuje ich polimeryzacja i tworzą się duże pory o
średnicy 35nm, przez które mogą przechodzić makrocząsteczki. Związki te są
wykorzystywane przez bakterie.

Małe pory:
-przenikają przez nie związki niskocząsteczkowe, głównie jony
-zmiana przepuszczalności błony
-wnikanie Ca

2+

do komórki

-aktywacja endonukleaz
-wnikanie cytokin prozapalnych
-indukcja apoptozy
-liza erytrocytów, leukocytów, płytek krwi lub innych komórek

Wiązanie docholesterolu, oligomeryzacja, włączenie się do błony i tworzenie porów.

• alfatoksyny i leukotoksyny – S. aureus
• deltatoksyny i deltahemolizyny (białka o strukturze α-helis, które wiążą się
niespecyficznie do różnych błon) – S. aureus
• hemolizyny – należą do grupy RTX toksyn, które zawierają konserwatywne i
powtarzające się fragmenty zawierające glicynę i asparaginę. Są wytwarzane w
nieaktywnej formie pro toksyny, która aktywowana jest w wyniku przyłączenia
kwasów tłuszczowych. Kodowane są przez 4 geny – hly A, B, C, D. Powodują one lizę
erytrocytów, leukocytów, monocytów, limfocytów T, komórek endotelicznych oraz
nabłonka nerek – Enterobacteriaceae

Toksyny zewnątrzkomórkowe, które działają w komórce gospodarza.
→ toksyny AB złożone z dwóch podjednostek

A – podjednostka enzymatyczna

B – swoistość działania, rozpoznawanie receptorów

→ toksyny proste w postaci pojedynczego łańcucha białkowego, podjednostki
połączone mostkami disiarczkowymi
→ toksyny złożone z jednej podjednostki A i pięciu B, np. cholery, czerwonki
krztuśca

Mechanizmy:
• wiązanie do receptora błonowego
• internalizacja kompleksu na drodze endocytozy i utworzenie pęcherzyka
• uwalnianie z pęcherzyka niektórych toksyn do cytoplazmy lub modyfikowanie
w aparacie Golgiego i ER
• zmiany w konformacji i rozpad toksyny na dwie podjednostki
• uwalnianie A do cytoplazmy i jej aktywność

Działanie toksyny:
ADP – rybozylująca
• przeniesienie ADP-rybozy z NAD na białko docelowe
• białka G regulują poziom komórkowego cyklicznego cAMP, (np. toksyna krztuśca,
cholery), związanie cAMP i zaburzenie gospodarki jonowej

• białka EF2 – czynnik elongacyjny translacji, np. toksyna błonicza;
zahamowanie syntezy białek
• aktyna – toksyna z podjednostkami A i B, wytwarzana przez laseczki
Clostridium , hamowanie zmian cytoszkieletu

Neurotoksyny – wytwarzane przez laseczki Clostridium i Bacillus.
C. tetani – neurotoksyna tężcowa (tetanospasmina)
C. botulinum – botulina
B. anthracis – neurotoksyna LF

Tetanospazmina łączy się z synapsami, blokuje neurotransmitery hamujące
(GABA i glicyna), powodując paraliż kurczowy.

Toksyna botulinowa – po spożyciu laseczki jest najsilniejszą naturalną
toksynę. Hamuje uwalnianie acetylocholiny w synapsach i prowadzi do
paraliżu wiotkiego.

Neurotoksyna LF wykazuje aktywność metaloproteaz zależnych od cynku.
Substratem są białka biorące udział w wydzielaniu neurotransmiterów. Może
być stosowana w medycynie i kosmetologii.

Toksyny dostarczane bezpośrednio do komórek gospodarza:
→ nie są uwalniane do podłoży, na których hoduje się bakterie
→ wprowadzane do komórek w wyniku bezpośredniego kontaktu z komórką
→ toksyny wprowadzane przez białkowy system sekrecyjny – struktury igło
podobne tworzące iniektorom lub III system sekrecyjny u bakterii G-
(Salmonella, Shigella, Yersinia)
→ aktywność toksyn:

-udział w fosforylacji białek

-reorganizacja cytoszkieletu aktynowego (Salmonella i Shigella)
-wpływ na metabolizm fosfatydyloinozytolu (nadmiar Ca

2+

-

biegunka; Shigella, Yersinia)

WYKŁAD 5, 27.03.2014r

Unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie.
Bakterie chorobotwórcze wykorzystują wiele mechanizmów w celu
przetrwania w organizmie gospodarza.
→ natychmiastowe, szybkie namnażanie bakterii i wytwarzanie toksyn, które
powodują silną biegunkę (Vibrio cholerae)
→ wnikanie do komórki gospodarza i ograniczanie metabolizmu bakterii do
najniższego poziomu, aby nie zostać rozpoznanym przez układ
immunologiczny (Mycobacterium tuberculosis)
→ zahamowanie ruchu rzęsek w drogach oddechowych (B. pertusis)
→ przystosowanie bakterii do skrajnie niskiego pH w żołądku poprzez
wytwarzanie ureazy (Helicobacter pylori)
→ wytwarzanie biofilmu tworzącego strukturę nieprzepuszczalną dla
składowych układu odpornościowego
→ indukcja apoptozy komórek żernych lub innych komórek gospodarza
→ zahamowanie odpowiedzi immunologicznej – wiele cząsteczek bakterii
wiąże się z receptorami na komórce gospodarza, co prowadzi do
zwiększonego wytwarzania cytokin hamujących odp. Immunologiczną
(Mycobacterium tuberculosis)

Apoptoza
- proces programowanej śmierci komórek
- ściśle regulowany genetycznie i biochemicznie
- warunkuje utrzymanie homeostazy organizmu
- nie wywołuje stanu zapalnego
- indukowana na skutek aktywacji Kaspar (proteaz serynowych)

Wyróżnia się szlaki apoptozy:
• zewnętrzny – receptorowy
• wewnętrzny – mitochondrialny; zwiększenie przepuszczalności błony
mitochondrialnej, uwalnianie cytochromu C i aktywacja kaspaz

Etapy apoptozy:
I. FAZA INICJACJI
• przyłączenie liganda do receptora i aktywacja Kaspar
• aktywacja kaspaz indukuje aktywację aktyny, przez co powstają pęcherzyki
apoptotyczne, następuje przemieszczenie fosfatydyloseryny na zewnątrz
komórki
• fosfatydyloseryna jest rozpoznawana przez komórki żerne i niszczona
na drodze fagocytozy
II: FAZA WYKONAWCZA
• aktywacja kaspaz wykonawczych działających na DNA jądrowe
• degradacja DNA jądrowego
• fragmentacja jądra
III. FAZA ZNISZCZENIA
• degradacja komórki
• wytwarzanie ciałek apoptotycznych

Morfologia komórek apoptotycznych
→ kurczenie się komórki
→ kondensacja chromatyny jądrowej i cytoplazmy
→ formowanie pęcherzyków apoptotycznych
→ eksponowanie na powierzchni komórki fosfatydyloseryny PS

→ internukleosomalne cięcie DNA na fragmenty o długości ok. 180 pz
→ fragmentacja jądra komórkowego(cięcie laminin)

Indukcja apoptozy komórki gospodarza nowym mechanizmem
chorobotwórczości bakterii:
W ostatnich latach zauważono udział apoptozy w modulowaniu przebiegu
chorób infekcyjnych. Niektóre patogeny, w zależności od etapu infekcji,
aktywują lub hamują apoptozę różnych komórek gospodarza.
• pałeczki Shigella i Salmonella powodują apoptozę makrofagów
• pałeczki Listeria powodują apoptozę hepatocytów, komórek
dendrytycznych i limfocytów
• pałeczki Helicobacter prowadzą do apoptozy komórek nabłonkowych
żołądka i jelit

Wnikanie enteropatogenów do komórek jelita
- przenikanie przez komórki dendrytyczne
- przenikanie przez enterocyty
- przenikanie przez komórki M

Wykrywanie komórek apoptotycznych
• barwienie oranżem akrydyny – interkaluje DNA oraz wiąże się do końców
3`OH, powstałych po jego cięciu (czerwona fluorescencja komórek
apoptotycznych)
• barwienie różnicowe oranżem akrydyny i bromkiem etydyny – oranż
dyfunduje przez błonę komórek żywych (zielona fluorescencja), a bromek
etydyny dyfunduje przez ścianę komórek apoptotycznych (kolor czerwony)
•barwienie komórek apoptotycznych…
• analiza fragmentacji DNA i powstałych oligonukleotydowych fragmentów
• wykrywanie obniżenia potencjału błony mitochondrialnej
z wykorzystaniem barwników kationowych, np. rodaminy

WYKŁAD 5, 27.03.2014r

Czynniki wirulencji bakterii. Mechanizmy pozyskiwania żelaza.

Żelazo występuje w związkach na stopniach utlenienia.
Żelazo hemowe przenosi O

2

, elektrony oraz wchodzi w skład cytochromów

i hydroperoksydaz.
To żelazo, które występuje w związkach typu FeS, jest związane z reakcją
red-oks.
Jest ono ko faktorem metabolizmu wtórnego oraz uczestniczy w procesie
produkcji antybiotyków.

Dostępność w środowisku naturalnym:
• w skorupie ziemskiej występuje obfitość w żelazo, jednak gdy odczyn gleby
jest bliski 7, ulega ono szybkiej oksydacji i tworzy kompleksy
• żelazo jest obecne zarówno w tkankach, jak i w płynach ustrojowych
w wysokim stężeniu, ale ze względu na obecność białek wiążących i
przenoszących żelazo
• tak więc zarówno w środowisku naturalnym jak i w organizmie kręgowców
występuje sytuacja braku żelaza dostępnego dla mikroorganizmów

Żelazo może wpływać na proces zakażenia w dwojaki sposób:
- kształtuje warunki wzrostu i podziałów bakterii
- reguluje ekspresję różnych czynników wirulencji, np. hemolizyn

Stężenie Fe jest jednym z czynników wpływających na proces zakażenia
- popadaniu zwierzętom żelaza łącznie z zawiesiną bakteryjną, zwiększa się
poziom wirulencji
-zwiększenie ryzyka wystąpienia posocznicy
-podanie terapeutycznie żelazowego preparatu znalazło odzwierciedlenie
w wyższej zakaźności mikroorganizmami, np. wzrastała bakteriemia
powodowana przez E. coli u dzieci otrzymujących Fe-dextran, aby zapobiec
ubytkowi żelaza

- umiarkowany brak żelaza zwiększa odporność na zakażenia
- żelazo wydaje się być jedynym z krytycznych czynników warunkujących
wystąpienie zakażenia

Mechanizm pozyskiwania żelaza przez mikroorganizmy:
• system niskiego powinowactwa jest uruchamiany gdy w otoczeniu jest
zapewniona względna obfitość żelaza
• system wysokiego powinowactwa działa w warunkach stresu
powodowanego niedoborem żelaza w otoczeniu i polega na aktywnym
transporcie jonów tego pierwiastka

Bakteryjne strategie zdobywania Fe

3+

w organizmie kręgowców:

• wytwarzanie zewnątrzkomórkowych reduktaz żelaza odbierających żelazo
z Fe-transferyny i Fe-aktoferyny
• pozyskiwanie żelaza z Fe-transferyny i Fe-aktoferyny poprzez specyficzny
receptor powierzchniowy, np. Neisseria, Haemophillus, Listeria i Bordatella
• wytwarzanie hemolizyn i pobieranie żelaza hemowego
• wytwarzanie sideroforów, systemu ich rozpoznawania i transportu do
odbierania Fe z Fe-transferyny i Fe-aktoferyny
• mikroorganizmy by zdobyć żelazo mogą stosować każdą z metod lub ich
kombinacje

Siderofory:
- związki niskocząsteczkowe (500-1000 D), wiążą Fe

3+

z wysoką

specyficznością
- wykryte u bakterii i grzybów jako efekt hodowli w deficycie żelaza
- związane ściśle z metabolizmem żelaza w mikroorganizmach
- znane 100 naturalnych sideroforów należących do związków katecholowych
lub fenolowych lub hydroksamonów

Rodzaje:
• katecholowe – enterobaktyna (pałki jelitowe)
• hydroksamowe – aerobaktyna

WYKŁAD 6, 03.04.2014r

Biofilm – dobrze zorganizowana społeczność bakteryjna przylegająca i żyjąca
na powierzchni naturalnej lub syntetycznej, otoczona śluzem.
Komórki bakteryjne wchodzące w skład biofilmu są bardziej odporne na
działanie antybiotyków i mniej efektywnie eliminowane przez komórki
obronne gospodarza.

Struktura biofilmu
• biofilmy są strukturami trwałymi, zwykle wielowarstwowymi skupiskami
mikrokolonii komórek bakteryjnych, otoczonymi macierzą
zewnątrzkomórkową EPS
• komórki mikroorganizmów wchodzących w skład biofimów charakteryzują
się specjalizacją do pełnienia różnych funkcji i wykazują cechy odmienne niż
komórki żyjące w postaci wolnej
• jest strukturą dynamiczną

Gdzie występują biofilmy?
Większość bakterii bytujących w środowisku naturalnym w postaci biofilmu
(99%).
Bakterie wykazują tendencję do adsorpcji na granicy faz biofilmu: ciecz-gaz,
ciecz-ciecz, ciało stałe-ciecz.
Biofilmy występują na powierzchni wilgotnych skał, na brzegach zbiorników
wodnych, na kamieniach.

Biofilm w środowisku naturalnym
→ chroni mikroorganizmy przed niekorzystnym wpływem czynników
zewnętrznych oraz stwarza możliwości łatwiejszej dostępności substancji
odżywczych
→ są bardziej oporne na działanie temperatury oraz środków
przeciwbakteryjnych
→ może funkcjonować w warunkach, gdzie przetrwanie pojedynczo byłoby
trudne lub niemożliwe

Występowanie:
• sieć wodociągowa
• przemysł spożywczy
• browarnictwo
• instalacje wodno-kanalizacyjne
______________________________________

• na implantach stomatologicznych i naczyniowych
• protezach ortopedycznych
• soczewkach kontaktowych
• cewnikach naczyniowych
• sztucznych zastawkach serca

Biofilmy nie są tylko czymś patologicznym:
- przewód pokarmowy
- drogi moczowo-płciowe
- płytka nazębna
- nosogardziel

Infekcje związane z występowaniem biofilmów:
- biofilm odpowiada za zakażenie często tworzone przez wiele gatunków
drobnoustrojów
- przyczyniają się do uszkadzania tkanek i powstawania zmian zapalnych
w miejscu zakażenia, łatwo stają się źródłem rozsiewu bakterii do krwi
i narządów

Biofilm wielogatunkowy – wykazuje najczęściej większą wirulencję i jest
bardziej oporny na leczenie niż biofilm jednogatunkowy, co znacznie utrudnia
diagnostykę i leczenie zakażeń z jego udziałem. W środowisku zewnętrznym
występują tylko biofilmy wielogatunkowe.

Zakażenia związane z formowaniem się biofimu na błonach śluzowych
i tkankach:
próchnica → G+ paciorkowce
zapalenia okołozębowe → G- beztlenowce, np. Fuscobacterium, Bacterioides,
zapalenie ucha i zatok → Haemophilus influence, S. pneumoniae
zapalenie płuc w przebiegu mukowiscydozy → P. aeruginosa
zapalenie wsierdzia → paciorkowce i gronkowce
przewlekłe infekcje ran → gronkowce, paciorkowce i Fuscobacterium

Rany są sprzyjającym środowiskiem do powstawania biofilmów, gdyż
ograniczana jest penetracja leków i występuje świetny dostęp do substancji
odżywczych.

Na powierzchniach syntetycznych związane z:
• wszczepianiem zastawki serca (zapalenie szpiku i kości)
• implantami ortopedycznymi
• implantami naczyniowymi
• rozrusznikami serca
• implantami zębowymi
• sprzętem do intubacji
• cewnikami naczyniowymi i urologicznymi

Organizmy tworzą biofilmy na biomateriałach
S. aureus → endoprotezy biodrowe
gronkowce koagulazo ujemne → cewniki naczyniowe i urologiczne, zastawki
Candida albicans → protezy głosu, cewniki nacz., wkładki wewnątrzmaciczne
Enterococcus → cewniki naczyniowe i zastawki
P. aeruginosa → endoprotezy biodra i cewniki

Chorobotwórczość gronkowców koagulazo ujemnych
• naturalna flora człowieka
• mogą być przyczyną niebezpiecznych, przewlekłych, nawracających
i trudnych do wyleczenia infekcji

forma planktonowa → forma osiadła (biofilm) → uwolnienie pojedynczych k.

choroby: zapalenie szpiku kostnego, oka, serca, kości, stawów, sepsa,
bakteriemia oraz zakażenia ran

Etapy tworzenia biofimu:
I: ADHEZJA
• do tkanek lub biomateriałów, na których są białka ustroju gospodarza,
występujące w osoczu i tkance łącznej. Kolonizację umożliwia większa
chropowatość materiału. 1,5nm – zachodzą reakcje chemiczne i tworzą się
związki kowalencyjne
• adhezja specyficzna – bakterie mają adhezyjny mające zdolność
rozpoznawania i wiązania białek ustroju. Mają one zdolność wiązania
fibrynogenu, lamininy, witrolektyny, fibropektyny, kolagenu, sialoproteiny
kości i trombospondyny.

II: DOJRZEWANIE
• kolonizacja ustroju, zwiększenie gęstości komórek w organizmie, agregacja
oraz tworzenie mikrokolonii
• tworzenie śluzu aż do całkowitego otoczenia mikrokolonii
• u gronkowców za kumulację agregatów komórkowych odpowiada
poliadhezyna
• u większości gronkowców egzopolisacharyd PIA jest głównym
komponentem śluzu
• macierz zewnątrzkomórkowa:

- największa produkcja EPS obserwowana jest w późniejszej fazie

wzrostu logarytmicznego i we wczesnej fazie wzrostu stacjonarnego

-ilość wytwarzana…

III: RÓŻNICOWANIE
• różnicowanie komórek w obrębie biofilmu, w wyniku czego powstaje
heterogenna i zróżnicowana populacja drobnoustrojów
• zróżnicowanie występuje, gdyż bakterie mają różny dostęp do substancji
odżywczych i tlenu
• sieć kanałów wodnych zapewnia dostęp do substancji odżywczych, jonów
i enzymów oraz odpływ produktów metabolizmu

System ten zapewnia doprowadzenie tych substancji jedynie
w powierzchniowej warstwie biofilmu, więc komórki te są metabolicznie
aktywne.

Komórki z części nieaktywnej metabolicznie są w stanie uśpienia – anabiozy.
Mogą one zmieniać swój metabolizm na fermentacje, zahamowanie syntezy
enzymów i toksyn.

Bakterie w biofilnie odznaczają się odmienną ekspresją genów
- różne cechy fenotypowe
- różne tempo wzrostu
- różne stany fizjologiczne

Bakterie mogą komunikować się za pomocą wytwarzania autoinduktorów,
które swobodnie dyfundują w biofilnie i zmieniają ekspresję genów
związanych z patogennością i regulacją procesów biofilmów. Dzięki temu
biofilm może funkcjonować jak organizm wielokomórkowy.

IV: DYSPERSJA AGREGATÓW OD BIOFILMU
• może zachodzić po wpływem urazu lub gdy warunki bytowania nie są
korzystne
• bakterie rozprzestrzeniają się
• zakażenia biofimowe są chroniczne

WYKŁAD 7, 03.04.2014r

Quorum sensing – zjawisko chemicznego komunikowania się bakterii,
oparte na wytwarzaniu i wydzielaniu molekuł sygnałowych
(autoinduktorów) odbieranych przez receptory innych bakterii. Komunikacja
może zachodzić między tymi samymi gatunkami lub kilkoma gatunkami.

Autoinduktory są sygnalizatorami zagęszczenia komórek.

Osiągnięcie quorum sensing jest sygnałem do uruchomienia procesów
istotnych dla całej populacji bakteryjnej.

Autpinduktory po osiągnięciu odpowiedniego stężenia regulują ekspresję
genów, czego efektem jest jednoczesne produkowanie czynników wirulencji.

Sygnał chemiczny jest wytwarzany i wysyłany na zewnątrz i odbierany przez
komórki własne i sąsiednie danej populacji.

Wewnątrz komórek odbiorcy sygnał jest przekazywany za pomocą układu
regulatorów.

W odpowiedzi na sygnał chemiczny następuje indukcja ekspresji określonych
genów.

Co jest regulowane?
- sporulacja
- wirulencja
- wytwarzanie toksyn
- replikacja DNA
- przekazywanie plazmidów
- różnicowanie komórek
- biosynteza metabolitów wtórnych

QS koordynuje procesy fizjologiczne i metaboliczne w obrębie biofilmu.

Cząsteczki autoinduktorów swobodnie dyfundują w biofilnie z jednej do
drugiej komórki, ale dopływ po osiągnięciu ich odpowiedniego zagęszczenia
w otaczającym środowisku możliwe jest odbieranie sygnału.

Podczas gdy QS jest wyłączane, następuje adhezja.

Budowa chemiczna cząsteczek sygnałowych, mechanizm działania oraz geny
kontrolujące zjawisko komunikowania się różnią się między gatunkami. Jeden
gatunek może wytwarzać wiele takich autoinduktorów.

Bakterie G+:
• komunikują się za pomocą cząsteczek białkowych APIs, wykorzystując
dwuelementowy system detekcji i odpowiada na obecność autoinduktorów
• proces przekazywania sygnału opiera się na kaskadzie reakcji fosforylacji
i de fosforylacji
• cząsteczki sygnałowe nie są w stanie same dyfundować przez błonę
komórkową, są wydzielane z udziałem białka zależnego od ATP

- w chwili osiągnięcia odpowiedniego zasięgu autoinduktory
peptydowe przyłączają się do kinazy białkowej
- po rozpoznaniu autoinduktora kinaza ulega fosforylacji
- zamieniony fragment cząsteczki kinazy łączy się z białkiem
regulacyjnym, co powoduje
- w odpowiedzi regulator białkowy może wiązać promotor DNA

Bakterie G-:
• komunikują się za pomocą AHL (chemiczne, niskocząsteczkowe acylowane
laktozy homoseryny; acylowany pierścień w pozycji α łańcuchem
tłuszczowym)
• autoinduktory złożone z podstawników o krótszych łańcuchach swobodnie
dyfundują przez błonę i ścianę

• autoinduktory zawierające dłuższe podstawniki transportowane są przez
pompy protonowe
• do produkcji AHLu bakterie wykorzystują S-adenozylometioninę oraz grupę
acylową pochodzącą z przemian…

Funkcję detektorów pełnią białkowe regulatory transkrypcyjne LuxR
zbudowane z 250 aminokwsaów.

Za oddziaływanie z DNA bakteryjnym odpowiedzialny jest N-końcowy
fragment białka LuxR,a za rozpoznawanie i wiązanie AHL N-końcowy
fragment LuxR.

Autoinduktory niespecyficzne gatunkowo:
• komunikacja różnych gatunków
• są nimi cząsteczki Al-2 występujące u bakterii G- i G+
• np. Bacillus, Clostridium, Escherichia, Listeria, Neisseria, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus
• wirulencja, produkcja toksyn i antybiotyków, luminescencja, tworzenie
biofilmów

WYKŁAD 8, 17.04.2014r

Oporność bakterii w biofimie na antybiotyki.
Bakterie w biofilnie wykazują 100-1000x wyższą oporność na antybiotyki
w porównaniu z formami planktonowymi.

Istotną funkcję w tym zjawisku wykazuje śluz otaczający biofilm:
- stanowi filtr molekularny (antybiotyki wykazują wtedy ograniczoną
zdolność do przenikania)
- składniki śluzu mogą wiązać niektóre antybiotyki

Obniżona wrażliwość na działanie antybiotyków może wynikać z faktu
występowania w biofilmie bakterii wolno rosnących o zmienionej ekspresji
genów, porównaniu do form planktonowych.

W biofilmie występują subpopulacje komórek typu persisters (uparte), które
tolerują działanie lekarstw i są zdolne do odbudowywania biofilmu po
zastosowaniu antybiotykoterapii.

W bifilmie występuje duże nagromadzenie enzymów inaktywujących
działanie antybiotyków,

Duże zagęszczenie komórek bakteryjnych w biofilmie powoduje, że
szczególnie łatwy jest transfer genów, w tym genów kodujących oporność na
antybiotyki.

Wzrasta efektywność działania pomp błonowych usuwających antybiotyki
z cytoplazmy.

Szczególnie niebezpieczne są zakażenia z udziałem szczepów gronkowców
metacyklinoopornych MRS.

Gen MecA warunkujący oporność na metackylinę i antybiotyki β-laktamowe,
jest częścią elementu genetycznego kasety SCC Mec.

Antybiotyki o wysokiej aktywności wobec biofilmu gronkowcowego:
• gentamycyna
• daptomycyna
• rifampicyna
• tigecyklina

RIFAMPICYNA – posiada zdolność do penetracji biofilmów i dezintegracji
śluzu, nie powinna być stosowana podczas monoterapii, gdyż szybko
dochodzi do powstania oporności na ten antybiotyk. Blokowanie
polimeryzacji RNA, zahamowanie syntezy mRNA, łączy się z podjednostką
β i uniemożliwia tworzenie wiązania fosfodiestrowego. Przy zapaleniu
wsierdzia łączymy go z wankomycyną i gentamycyną.

TIGECYKLINA – posiada wysoką aktywność bakteriobójczą, przenika przez
śluz do struktury głębszej biofilmu. Komórki bakteryjne z głębszych warstw
biofilmu są szczególnie narażone na subinhibicyjne (takie, które nie zabija,
ale oddziałowuje ) stężenie antybiotyków.
- stymulacja wielu genów, np. kodujących białka i enzymy
- wpływ na powierzchnię komórek i jej hydrofobowość oraz indukcję
wytwarzania adhezyn

Nowe strategie eradykacji biofilmu:
→ ultradźwięki do rozrywania biofilmów
→ niszczenie śluzu
→ zapobieganie adhezji do biomateriałów
→ ingerowanie w system komunikacji międzykomórkowej

Zapobieganie adhezji do biomateriałów
- modyfikacje powierzchni poprzez powlekanie lub impregnowanie
substancjami bakteriobójczymi, np. srebro, które wiąże się z błoną
komórkową bakterii i ma zdolność do wiązania z kwasami nukleinowymi i
prowadzi do śmierci.
- nowa technologia biomateriałowi, czyli pokrywanie powierzchni
wszczepów cząsteczkami srebra w postaci nanokryształów, co powoduje jej
istnienie na powierzchni przez dłuższy czas.

Blokowanie ekspresji genów kodujących białka poprzez przeciwciała wiążące
z macierzy komórkowej.

Ingerencja w komunikację międzykomórkową:
→ inaktywacja enzymatyczna
→ wiązanie cząsteczek autoinduktorów z przeciwciałami
→ zastosowanie analogów cząsteczek autoinduktorów
→ hamowanie ekspresji genów kodujących autoinduktory

Niszczenie śluzu poprzez:
→ użycie enzymów litycznych w celu rozluźnienia struktury biofilmu, np.
dyspersyna B
→ użycie chelatorów w celu zmniejszenia ilości żelaza, magnezu i wapnia
→ zastosowanie rekombinowanych bakteriofagów kodujących enzymy
rozkładające śluz biofilmu

Alternatywy antybiotykoterapii do eradykacji biofilmów:
a)enzymy lityczne – punktem docelowym jest ściana komórkowa lub enzymy
lityczne
b)surfaktanty – naturalne, wytwarzane przez drobnoustroje, są wielko-
i niskocząsteczkowe, np. surf aktyna Bacillus subtilis
c)peptydy bójcze komórek eukariotycznych, np. lizozym występujący
w moczu, mleku czy łzach. Powodują one wzrost przepuszczalności ściany
komórkowej.
Defensyny – odpowiadają za pierwszą linię obrony przeciwko wnikającym
patogenom oraz podniesienie skuteczności odpowiedzi humoralnej.
Nie są skuteczne, ponieważ zmieniają ładunek i nie występuje przyciąganie
między ścianą komórkową bakterii a defensyną.
d)olejki eteryczne – mają zdolność do oddziaływania z błoną komórkową, np.
tempertyny

Biofilmy tworzone przez Condidia albicans (drożdżaki):
• grzyby mają zdolność do tworzenia biofilmów, mają słabszą podatność na
antybiotyki, chemioterapeutyki przeciwgrzybiczne oraz odpowiedź
immunologiczną

• grzyby są ważnym czynnikiem etiologicznym chorobotwórczości i zakażeń
człowieka, np. zakażenia grzybiczno - powierzchniowe i błon śluzowych oraz
grzybice głębokie narządów zewnętrznych i fungemie (grzybice krwi) u osób
z obniżoną odpornością
• oporność może być naturalna (uwarunkowana genetycznie) lub wtórna
(jako mutacja punktowa)
• istotnym czynnikiem wpływającym na leczenie grzybicy jest zmienność
fenotypowa (blastospory, strzępki i pseudostrzępki)
• poszczególne gatunki mają różną morfologię biofilmu
• tworzenie biofilmu zależy od:

- rodzaju powierzchni

- pH

- stężenia substancji odżywczych

- stężenia tlenu

•charakterystyczną cechą tego grzyba jest polimorfizm, czyli występowanie
jako strzępki, pseudostrzępki i blastospory, różna aktywność enzymatyczna
oraz oporność na fagocytozę
•blastospory są odpowiedzialne za rozsiew, strzępki są czynnikami
inwazyjnymi, a pseudostrzępki są aktywne enzymatycznie i powodują
destrukcję tkanek

Tworzenie strzępek:
- zależy od czynników środowiska
- sygnał od kinazy białkowej Mkc1p
- dalsza proliferacja komórek zależy od gęstości hodowli i ma związek z QS

Wraz ze wzrostem gęstości komórek rośnie stężenie farnezolu, powstają
blastospory, dojrzały szczep przechodzi w fazę dyspersji (uwalnianie
blastospor, wymaga osłabienia właściwości adhezyjnych.

Istotną rolę pełni glukan β1-3.

WYKŁAD 9, 17.04.2014r

Siderofory (dokończenie wykładu dr.Mokrackiej)
- mieszane, np. pseudobaktyna i piowerdyna wytwarzane przez Pseudomonas
aeruginosa
- nie klasyfikujące się

Aerobaktyna – czynnik zjadliwości i wirulencji, jest chelatorem, który
odbiera żelazo od białek wiążących i przenoszących Fe

Enterobaktyna – nie uczestniczy w procesie chorobotwórczym

Regulacja syntezy siderofrów:
• wymaga specyficznych receptorów błonowych
• regulowana przez stężenie żelaza
• u E.coli regulowana przez produkty genu FUR hamujące transkrypcję
różnych loci, łącząc się z jonem Fe

2+

Siderofory ważne dla wirulencji:
• angiobaktyna wytwarzana przez Vibrio anguillanum
• yersiniobaktyna wytwarzana przez Yersinia
• chryzobaktyna wytwarzana przez Ervinia chrysanthemi

Wpływ na kręgowce:
• hydroksamowe mają immunosupresyjny wpływ na limfocyty T
• katecholowe wzmagają wzrost bakterii i hamują system obronny

Bakteryjne systemy sekrecji G-
→ transport jedno lub dwuetapowy
→ sześć systemów sekrecji
→ systemy mogą współpracować
→ w zależności od typu sekrecji przenoszone są białka natywne lub
niepofałdowane

→ białka niektórych systemów wykazują podobieństwo do białek
strukturalnych, np. pilusów czy fimbrii
→ numeracja systemów jest kolejnością w jakiej były one odkryte
→ jednoetapowe: I,III,IV
→ dwuetapowe: II i V

DWUETAPOWE - szlak sekrecji ogólnej GSP umożliwia :
- transport cząsteczek do środowiska zewnętrznego
- lokowanie białek w błonie wewnętrznej
- uwalnianie do przestrzeni Periplazmatycznej
- wbudowywanie do błony zewnętrznej

Procesy te są niezależne genetycznie i fukcjonalnie
Eksport polipeptydów z cytoplazmy do przestrzeni periplazmatycznej przy
udziale translokazy SEC (szlak SEC-zależny), musi występować domena
białkowa.

Białka te mają sekwencje liderowe odcinane przez błonę wewnętrzną. Mogą
one ulegać modyfikacjom przygotowującym do dalszego transportu.

Etapy translokacji;
→ polipeptyd łączy się z białkiem opiekuńczym w cytoplazmie
→ translokacja przy udziale kompleksowych białek cytoplazmatycznych.
Bakteryjny SEE-A wiąże się z IEE-B i przenosi białko do multimetrycznego
kompleksu (minimum 6 białek translokaz)
→ przyłączenie ATP do SEC-A inicjuje przyłączenie peptydu sygnałowego do
kanału utworzonego z białek kompleksowych
→ translokacja z wykorzystaniem siły protonomotorycznej
→ polipeptyd zostaje zakotwiczony

II. SYSTEM SEKRECYJNY
•główny mechanizm kończący szlak GSP,
•uniwersalny i wielofunkcyjny,
•charakteryzuje się występowaniem specyficzności gatunkowej
•uwalnianie do środowiska zewnętrznego ostatecznie uformowanych
substratów
•aparat sekrecyjny:

-białko GspE leży po cytoplazmatycznej stronie błony wewnętrznej

i ma funkcje ATP-azy

- integralne białka błony cytoplazmatycznej Pul C,M,N,L,P jako białka

strukturalne

- białka G, H, I, J są homologiczne do białek budujących pilusy typu IV.

Mogą one polimeryzować i tworzyć coś na kształt pilusów

- białko PullD tworzy w błonie zewnętrznej kanał translokacyjny

• rola w patogenezie:

a)enzymy:

- proteolityczne, np. Vibrio cholerae HAP lub elastaza u Pseudomonas

- fosfolipolityczne

- amylolityczne wydzielane przez patogeny roślinne, np. Ervinia

b)egzotoksyny:

-wytwarzane przez Vibrio cholerae

,

toksyna Shiga, Shiga like E.coli

-egzotoksyna A produkowana przez Pseudomonas aeruginosa

- termostabilna LT

c)elementy warstwy S

*najbardziej patogenne są: Haemophilus, Helicobacter, Neisseria

I, III SYSTEM SEKRECYJNY
• wydzielane substraty nie przedostają się do przestrzeni periplazmatycznej,
transportowane są jednoetapowo przez dwie błony i uwalniane do
środowiska zewnętrznego lub do cytozolu
• I system – prototypem jest system sekrecji α-hemolizyny przez
uropatogenne szczepy E.coli
• aparat sekrecyjny:

-translokaza ABC, HlyB, białko w błonie wewnętrznej

z cytoplazmatyczną domeną zawierającą motyw wiążący nukleotydu

walker A i B

- białko HlyD zakotwiczone w zewnętrznej błonie cytoplazmatycznej

oddziałuje z elementem kompleksu sekrecyjnego błony zewnętrznej

tworząc most łączący z błonami

-acetylotransferaza potrzebna jest do modyfikacji potranslacyjnego

HlyA

- białko TolC syntetyzowane w cytoplazmie ma sekwencję sygnałową

N-terminalną. Tworzy α-helikalny tunel w przestrzeni

periplazmatycznej, przez który substraty dostają się na zewnątrz

• rola w patogenezie:

- toksyny RTX tworzące pory (hemolizyny, leukotoksyny)

- toksyny RTX nie tworzące porów (lipazy)

-białka zaangażowane w proces pozyskiwania żelaza

• III system – transport białek przez osłony bakterii, przez błony gospodarza
do jego wnętrza.
• prototypem jest system Yop u chorobotwórczych Yersinia
• geny często zlokalizowane są w obrębie wysp patogenności
• aktywność ekspresji uwarunkowana jest temperaturą 37

o

• białka wychodzące mają unikatowe N-terminalne sekwencje sygnałowe,
które nie ulegają procesowaniu
• wymagane są białka opiekuńcze
• białka transportowane:

-efektorowe – wprowadzane do cytozolu gospodarza

- transfokatorowe – umożliwiają transport

• aparat sekrecyjny:

- 29 białek zlokalizowanych w błonie cytoplazmatycznej

wykazujących podobieństwo do białek aparatu cząstkowego

- białka YscC M.enterocolitica mają właściwości sekretyny, tworzą

multimetryczne pierścieniowe kompleksy o cechach poryny

w błonie zewnętrznej

- hydrofobowe Yob B i D są białkami transbłonowymi tworzącymi

igłę i wbudowującymi się w komórkę gospodarza. Jest to tzw.

strzykawka molekularna (Po odebraniu sygnału na powierzchni

komórki budowany jest rodzaj igły łączącej bakterię z gospodarzem.

Przez kanał ten przechodzą białka aparatu i białka efektorowe oraz

są one wstrzykiwane do cytozolu. Obserwację tego umożliwia

mikroskop elektronowy.)

• rola w patogenezie:

- szczególnie Yersinia

- białka dezorganizujące cytoszkielet, chroniące przed fagocytozą

- często występuje apoptoza komórek gospodarza

-Pseudomonas powoduje uszkodzenie tkanki nabłonkowej

- E.coli – wyspa patogenności LEE koduje intiminę

- Shigella, Salmonella, Aeromonas

-bezpośredni udział w procesie zakażenia

Wirulencja jako wynik obecności specyficznych genów.
Wirulencja może być wynikiem braku genu kodującego supresor, zmianami
sekwencji genów oraz wynikiem różnic w regulacji tego samego zestawu
genów.

Nośniki genów:
1.Zintegrowane fagi (toksyny są częścią faga)
• produkcja egzotoksyn, np. toksyna błonicza kodowana przez Fox
urogenicznego bakteriofaga
• toksyna Shiga (Shigella)
• neurotoksyna Clostridiu botulinum

• cytotoksyna P.aeruginosa
• egzotoksyna A S.aureus
• egzotoksyna A i C S.pyogenes

2.Kolonizacja/adhezja
• E.coli
•V. cholerae
• Salmonella enterica

3.Plazmidy:
• Shigella (ma region wejścia)
• PYV Yersinia pestis
• koniugacyjny Enterococcus fecalis ma gen kodujący cytolizynę

4.Wyspy patogenności – struktury opisane u E.coli . Duże fragmenty
genomów o stałych cechach.
- zawierają geny kodujące czynniki wirulencji, np. toksyny, adhezyjny,
systemy sekrecji białek czy pozyskiwanie żelaza
-nie ma ich u niechorobotwórczych
- obszerny fragment chromosomu (10-200kpz)
-odmienny procent molowy GC niż reszta DNA
- są często oflankowane przez sekwencje powtórzone proste
- występują w pobliżu tRNA lub sekwencji inercyjnych
- zawierają geny warunkujące mobilność kryptyczną lub funkcjonalną
- niestabilne