31 |

S t r o n a

MEDYCYNA SĄDOWA, ĆWICZENIE 3, P. 2, 16.12.2013

dr n. med. Maciej Jędrzejczyk

Wprowadzenie do genetyki sądowej

1. Materiały biologiczne – testy wstępne

2. Prawidłowe zabezpieczenie śladów biologicznych / błędy

3. DNA w komórce – źródła, podział

4. Markery stosowane w genetyce sądowej – podział, charakterystyka

5. Sekwencje tandemowo powtórzone w genomie człowieka – charakterystyka, zastosowanie

6. Proces badawczy w laboratorium genetycznym

7. Reakcja PCR / multiplex PCR – charakterystyka, zastosowanie

8. Markery nierekombinacyjne – charakterystyka, zastosowanie

9. Homozygota / heterozygota

10. Marker płci

11. Szansa ojcostwa / prawdopodobieństwo ojcostwa

12. Potwierdzenie / wykluczenie ojcostwa

13. Częstość genotypu / prawdopodobieństwo zgodności profilu genetycznego

Genetyka sądowa - zastosowanie



Ustalenie pokrewieństwa

o ojcostwo / macierzyństwo

o brak rodziców – badanie krewnych



Identyfikacje osobnicza

o identyfikacja NN denatów / osób zaginionych / ofiar katastrof masowych



Kryminalistyka

o analiza zabezpieczonego materiału dowodowego w postaci śladów biologicznych

o szukanie profilu sprawcy / ofiary na dowodach

o identyfikacja sprawców przestępstw – śladów biologicznych – bazy profili DNA



Analizy historyczne

Materiały biologiczne



wymazy np. z pochwy



krew



wycinki mięśni



kości – długie; zęby



odzież (plamy nasienia), pościel, meble, papierosy (pety)



włosy (przydatne tylko z cebulkami)



paznokcie

Możliwa degradacja – tkanki zatopione, utrwalone w formalinie / parafinie

32 |

S t r o n a

Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów

Warunki:



materiały suche: temperatura pokojowa, dostęp powietrza



ciecze, tkanki miękkie: -20

o

C do -80

o

C (kości)

Metody



Krew na antykoagulant (-20

o

C) lub bibuła / płótno/ FTA (+20

o

C)



Wymazy (-20

o

C lub +20

o

C po wysuszeniu)



Wysuszenie / zapakowanie w papierową kopertę: temperatura pokojowa – niedopałki, znaczki,
odzież (pobranie fragmentów lub w całości), włosy z cebulkami, paznokcie wraz z materiałem
znajdującym się pod nimi

Powierzchnie wchłaniające:



wycięcie fragmentu (dywan)



zabezpieczenie w całości (odzież)

Powierzchnie niewchłaniające:



zabezpieczenie na jałową wymazówkę (dźwignia zmiany biegów)



zabezpieczenie fragmentu przedmiotu wraz z zaplamieniem (kawałek stłuczonej szyby)



zabezpieczenie w całości, jeśli gabaryty niezbyt duże

Materiały biologiczne: nieprawidłowe zabezpieczanie śladów



praca w niesterylnych warunkach – brak rękawiczek, masek; używanie niejałowej wody
destylowanej – kontaminacja przy zabezpieczaniu



zabezpieczanie krwi na heparynę (inhibicja PCR)



niedosuszenie wymazów / zabezpieczonych śladów / przechowywanie w szczelnie
zamkniętych foliowych workach – rozwój mikroorganizmów i późniejsze zgnicie



zabrudzenie materiałów glebą (kwasy humusowe), rdzą, detergentami, chemikaliami (kwasy /
zasady) – degradacja DNA / inhibicja PCR



pozostawienie w nasłonecznionym miejscu – degradacja (UV)

Materiały biologiczne – testy jakościowe

A. Ślina



test niespecyficzny – test płytkowy (agar + skrobia) – aktywność α-amylazy



testy specyficzny:

o test immunochromatograficzny – obecność α-amylazy

o test odciskowy Phadebas – aktywność α-amylazy

B. Krew



testy niespecyficzne (luminol – Dexter używa, H2O2)



test specyficzny – immunochromatograficzny (hemoglobina ludzka)

33 |

S t r o n a

C. Sperma



test niespecyficzny – UV / test bardziej specyficzny – Bluemaxx – ma wyższe widmo (też
ślina i mocz)



test specyficzny – immunochromatograficzny (obecność PSA)

DNA



kwas deoksyrybonukleinowy



podwójna helisa



3 miliardy par zasad (A – G – C – T)



A = T, G = C



ok. 30000 genów



ponad 99% identyczności w populacji



1% różnica wykorzystywanych w genetyce sądowej



rejony kodujące (ok. 5%) i niekodujące (ok. 95%)



transkrypt z DNA na RNA



trójkąt nt – informacja o AA budujących białka

DNA: jądrowy i mitochondrialny

Zróżnicowanie sekwencji tandemowych



Sekwencje minisatelitarne – VNTR



Jednostka powtórzeniowa: od 9 do 100 bp / cała sekwencja kilka tysięcy bp



Bardzo wysoki stopień polimorfizmu



Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR



Sekwencje mikrosatelitarne – STR (krótkie powtórzenia tandemowe)



Motyw repetytywny: 2 – 6 bp



Duży polimorfizmu



Główna metoda analizy – PCR

34 |

S t r o n a

Techniki i markery używane w genetyce sądowej:

1. Analiza sekwencji tandemowo powtórzonych



Sekwencje mikrosatelitarne – STR



Sekwencje minisatelitarne – VNTR (znaczenie historyczne)

2. Sekwencjonowanie DNA mitochondrialnego

3. Analiza polimorfizmów typu SNP

DNA typu minisatelitarnego: VNTR



VNTR (variable number of tandem repeats) – występujące w genomie sekwencje DNA o
zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń w locus



Jednostka powtórzeniowa: od 10 do 100 bp



Cała sekwencja – długość nawet do kilkudziesięciu tysięcy bp



Dziedziczenie i segregacja sech wg zasad Mendla



Bardzo wysoki polimorfizm



Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR



Przykład loci VNTR: D7S21, D12S11, D1S7

DNA typu mikrosatalitarnego: STR



STR – krótkie powtórzenia tandemowe



Jednostka: 2 – 6 bp



Ilość powtórzeń w rejonie może różnić się pomiędzy osobami



Duży polimorfizm; metoda analizy – PCR



Szeroko rozpowszechnione w ludzkim genomie gł. w rejonach niekodujących (brak informacji
m.in. o rasie, predyspozycjach do chorób, cechach fenotypowych np.: wzrost, kolor oczu /
włosów)

35 |

S t r o n a

Praca w laboratorium genetycznym – etapy:

1. Otrzymanie / pobranie materiału

2. Izolacja:

o

Metoda fenolowo – chloroformowa

o

Sherlock AX

3. Pomiar stężenia DNA

4. Amplifikacja DNA metodą PCR

5. Rozdział elektroforetyczny produktów PCR

o

analiza ręczna – barwienie żeli

o

analiza automatyczna – detekcja optyczna z wykorzystaniem promieni lasera
produktów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi (analizator genetyczny)

5. Genotypowanie

PCR – zasada reakcji

94

o

C

Denaturacja nici – pękanie wiązań wodorowych

59

o

C

Przyłączenie primerów do nici

5' TCATAAGT 3'

3' AGTATTCATT 5'

72

o

C

Wydłużenie przez polimerazę nici komplementarnej
do nici matrycy

Podwojenie ilości amplifikowanego fragmentu DNA w każdym cyklu:
1, 2, 4, 8, 16 ... [1 cykl = 2 cząsteczki (nowe fragmenty DNA)]

Multipex PCR



Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji PCR.



Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej – uniknięcie parowania się między sobą.



Primery wyznakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi – odseparowanie od siebie loci o
podobnym zakresie masy (bp).



Rozdział produktów PCR w zależności od wielkości.



Oszczędność czasu i materiałów (degradacja DNA).



Potrzeba niewielkiej ilości DNA (2,5 ul).



Duża siła dyskryminacji zestawu np. 15 loci.



Amelogenina – marker płci (- 6 par zasad na X).

36 |

S t r o n a

Markery Y-STR



dziedziczenie w linii męskiej



ustalenie pochodzenia geograficznego (brak materiału referencyjnego)

SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms



cytozyna na tyminę



najczęstsza zmiana zachodząca w sekwencji DNA



występuje w genomie średnio co 100 – 300 bp



różnica polega na ramieniu pojedynczego nukleotydu w sekwencji DNA pomiędzy osobnikami

mtDNA



przydatność przy analizie zdegradowanego jądrowego DNA



dziedziczenie w linii odmatczynej



dwuniciowa, kolista zamknięta cząsteczka



dziedziczenie wyłącznie od matki



występowanie w mitochondriach

Zasady wyłączania ojcostwa

I / LUB



muszą być 4 niezgodności, aby wykluczyć ojcostwo mężczyzny wobec dziecka

Wartość dowodowa analizy

Szansa ojcostwa – PI

Ocenia, ile razy bardziej prawdopodobne jest ojcostwo badanego pozwanego w porównaniu do
ojcostwa

losowo

wybranego

mężczyzny

dla

konkretnego

wyniku

ekspertyzy

–

PRAWDOPODOBIEŃSTWO OJCOSTWA

P = PI / PI + 1

Np. locus D12 S11:

ojciec 11 – 11
matka 15 – 15
dziecko 11 –15

u dziecka pojawia się nowa cecha

nieobecna u pozwanego o ojcostwo

mężczyzny ani u matki

dziecko nie dziedziczy cechy po

pozwanym o ojcostwo mężczyźnie

PI = 1 / częstość (15)

37 |

S t r o n a

Wartość dowodowa analizy

Łączna szansa ojcostwa – PI c



Zasada iloczynu - „PRODUCT RULE”

PI c = PI 1 lokus x PI 2 lokus x PI 3 lokus x …...

(mnożymy prawdopodobieństwo różnych loci)

Opiniowanie w analizie ojcostwa

EKSPERTYZA DNA

Wartość dowodowa analizy

Wartość dowodowa analizy

prawo Hardy'ego i Weinberga

wyłączenie minimum 4 niezgodności

potwierdzenie z

prawdopodobieństwem

> 99,9999% (PI > 1 000 000)

PI / PI + 1 = P

Analiza porównawcza uzyskanego

profilu DNA

niezgodność

zgodność

analiza statystyczna – CZĘSTOŚCI

POPULACYJNE

OPINIA

P r a w d o p o d o b i e ń s t w o

przypadkowej zgodności

STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI



odpowiednio liczna



kojarzenie losowe



brak doboru naturalnego



brak selekcji, mutacji i migracji

STAN DYNAMICZNEJ RÓWNOWAGI

Częstość występowania różnych
genotypów w populacji jest stała
i zależna jedynie od częstości
występowania alleli w populacji

38 |

S t r o n a

Wartość dowodowa analizy

Jeżeli allel „a” w lokus A ma częstość a, a allel „b” w lokus B ma częstość b

HWE w populacji

Wartość dowodowa analizy

ILOCZYN CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW = CZĘSTOŚĆ PROFILU

1 / CZĘSTOŚĆ PROFILU = 1 PROFIL NA ….. OSÓB

PRAWDOPODOBIEŃSTWO PRZYPADKOWEJ ZGODNOŚCI

PE – SIŁA WYŁĄCZENIA tzw. przydatność do badań ojcostwa

Jest to odsetek niesłusznie pozwanych o ojcostwo mężczyzn, którzy zostaną wykluczeni w toku analizy.

PD – SIŁA DYSKRYMINACJI tzw. szansa zróżnicowania osób

Jest to prawdopodobieństwo, że dwie losowo wybrane osoby z populacji nie będą miały takiego
samego zestawu cech.

AA = a

2

CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW

BB = b

2

AB = 2ab