CHARAKTERYSTYKA SKROBI WYIZOLOWANEJ

Z ZIEMNIAKÓW I OCENA EFEKTYWNOŚCI

HYDROLIZY KWASOWEJ I ENZYMATYCZNEJ

KLEIKU SKROBIOWEGO

CHEMIA ŻYWNOŚCI

II ROK WNoŻiŻ

STUDIA NIESTACJONARNE

Autorzy opracowania:

dr D.Piasecka-Kwiatkowska

dr B. Stasińska

2

Skrobia jest roślinną substancją zapasową, odkładającą się szczególnie obficie w

nasionach (ziarniaki zbóż, groch, fasola, bób) i bulwach (ziemniaki) w postaci ziaren

skrobiowych o wielkości od 2 do 150 µm. Praktycznie wszystkie produkty mączne i kasze są

źródłem skrobi. Stanowi ona ponad połowę węglowodanów spożywanych przez człowieka.

Pod względem chemicznym skrobia składa się z reszt α-D-glukopiranozy powiązanych

ze sobą wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Tylko w punktach rozgałęzień występują wiązania

α-1,6-glikozydowe. Jest cukrem nieredukującym, zbudowanym z dwóch różnych strukturalnie

składników: amylozy i amylopektyny.

A

MYLOZA

stanowi na ogół 14-27% suchej masy skrobi, ma strukturę liniową, składa

się

z

licznych

(250-1000)

reszt

D-glukopiranozy,

połączonych

wiązaniami

α-1,4-glikozydowymi (ryc.1). Podstawową jednostką strukturalną jest maltoza, a pomiędzy

jednostkami maltozowymi występuje także wiązanie α-1,4-glikozydowe. Cząsteczka amylozy

nie jest rozgałęziona, lecz tworzy łańcuch skręcony śrubowo, przy czym na jeden skręt spirali

przypada 6 reszt glukozy. Strukturę przestrzenną amylozy stabilizują wiązania wodorowe

formujące się między wolnymi grupami OH. Kształt cząsteczki amylozy ma wpływ na jej

reaktywność zarówno chemiczną, jak i biochemiczną. Amyloza daje z jodem intensywne

niebieskie zabarwienie. Istota tego zjawiska polega na zagęszczaniu cząsteczek jodu w

wolnych przestrzeniach ograniczonych przez cząsteczki glukozy. Taki związek wykazuje

zmienione właściwości fizyczne (silną absorpcję światła).

Ryc.1. Fragment wzoru amylozy

A

MYLOPEKTYNA

jest rozgałęzioną formą skrobi. Do łańcucha głównego

zbudowanego z reszt glukozowych powiązanych wiązaniem α-1,4-glikozydowym są

przyłączone wiązaniem α-1,6-glikozydowym łańcuchy boczne, które mogą się również

rozgałęziać. W cząsteczce amylopektyny na jedno wiązanie α-1,6-glikozydowe przypada

około trzydzieści wiązań α-1,4-glikozydowych. Ze względu na liczne rozgałęzienia

amylopektyna przedstawia sferyczny, nieuporządkowany kłębek, w którym jedynie

zewnętrzne łańcuchy mogą wykazywać strukturę spiralną. Dlatego amylopektyna daje z

jodem zabarwienie fioletowe.

O

O

OH

OH

CH

2

OH

1

4

O

O

OH

OH

CH

2

OH

1

4

3

Ryc.2. Fragment wzoru amylopektyny

Obydwa składniki skrobi tworzą strukturę nadcząsteczkową, w której występują drobne

krystaliczne micele oraz struktury amorficzne powiązane mostkami wodorowymi.

Właściwości skrobi stanowią wypadkową właściwości obu jej składników i ich wzajemnego

stosunku ilościowego. Oprócz rdzenia węglowodanowego skrobia zawiera niewielkie ilości

białka (do 0,5%), lipidów (ok.0,9%) oraz fosforu (0,05-0,25%) i wiele innych składników

mineralnych. Zakłada się ponadto, że strukturalnym składnikiem skrobi jest woda. Jest ona

związana za pomocą wiązań wodorowych z grupami OH reszt glukozy.

Skrobia jest nierozpuszczalna w wodzie oraz w większości rozpuszczalników

organicznych. W zimnej wodzie ziarna skrobiowe pęcznieją i w określonej dla każdego

rodzaju skrobi temperaturze kleikują, tzn. tracą strukturę ziarnistą. Zachodzi wtedy

nieodwracalna dezintegracja makrocząsteczek i powstaje lepki kleik. Skrobia skleikowana

ulega retrogradacji. Zjawisko to polega na wytworzeniu pomiędzy sąsiednimi cząsteczkami

amylozy mostków wodorowych i powstaniu struktury krystalicznej. Skrobia taka jest odporna

na działanie enzymów i dlatego retrogradacja może być w pewnych przypadkach zjawiskiem

niekorzystnym. Retrogradacja skrobi jest również przyczyną czerstwienia pieczywa oraz

zmian struktury skrobiowych artykułów żywnościowych. Zjawisku temu sprzyja duża

zawartość amylozy w skrobi oraz obniżona do ok.0

o

C temperatura.

Ogrzewanie skrobi do temperatury 180-200

o

C prowadzi do depolimeryzacji

(dekstrynizacji) cząsteczki skrobiowej oraz do wytworzenia się w dekstrynach rozgałęzień

(np. powstają wiązania β-1,6-glikozydowe). Powstaje wówczas furfural i wiele substancji

lotnych, m.in. kwas octowy i mrówkowy, aldehyd octowy i inne.

W zależności od tego, czy skrobia znajduje się w postaci natywnej, tzn. w postaci

ziaren, czy też w formie rozpuszczonej (kleik skrobiowy), a więc częściowo fizycznie

zdezintegrowanej, różne są jej właściwości chemiczne. Skrobia natywna jest mniej reaktywna,

np. nie działają na nią (lub działają bardzo słabo) enzymy amylolityczne powodujące

hydrolizę skrobi.

O

O

O

O

CH

2

1

4

O

O

O

O

CH

2

O

1

4

O

O

O

O

CH

2

O

1

4

2

3

5

6

4

H

YDROLIZA SKROBI

H

YDROLIZA KWASOWA

Skrobia pod wpływem kwasów ulega stopniowej hydrolizie przez stadium dekstryn do

maltozy i małej ilości glukozy. Pośrednimi produktami są: amylodekstryny, erytrodekstryny,

achro- i maltodekstryny oraz maltoza. W miarę hydrolizy wzrastają stopniowo właściwości

redukujące.

Ryc. 3. Schemat hydrolizy kwasowej skrobi

H

YDROLIZA ENZYMATYCZNA

Hydroliza enzymatyczna skrobi przebiega przy udziale enzymów amylolitycznych. Jest

procesem, który znalazł szerokie zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu spożywczego,

np. piekarskim, gorzelniczym, browarniczym. Amylazy należą do klasy hydrolaz, a więc

enzymów rozkładających wiązania glikozydowe przy równoczesnym włączeniu cząsteczki

wody. Enzymy amylolityczne występują w przyrodzie dość często, zarówno u roślin i

zwierząt, jak i w komórkach drobnoustrojów. Do najważniejszych enzymów należą: α- i β-

amylaza oraz α-glukozydaza.

α

α

α

α-amylaza, tzw. amylaza dekstrynująca, jest endoglikozydazą. Hydrolizuje wewnętrzne

wiązania α-1,4-glikozydowe, dając maltozę, maltotriozę (maltodekstrynę) i α-dekstrynę

(achrodekstrynę). W początkowej fazie hydrolizy α-amylaza powoduje szybki rozkład wiązań

α-1,4-glikozydowych długiego łańcucha amylozy do drobnocząsteczkowych dekstryn

(zawierających 6-7 reszt glukozy), które stopniowo podlegają dalszej degradacji do tri- i

disachrydów (maltoza) oraz w nieznacznym stopniu do glukozy. Enzym ten atakuje wiązania

glikozydowe amylozy znajdujące się w środku łańcucha, rozkładając go na coraz mniejsze

fragmenty. W wyniku działania α-amylazy na amylopektynę powstają różne rozgałęzione

5

łańcuchy, zawierające kilka reszt glukozy. Na skutek działania α-amylazy spada lepkość

kleiku skrobiowego.

Ryc.4. Schemat działania α

α

α

α-amylaz.

β

β

β

β-amylaza, tzw. amylaza cukrująca, jest egzoglikozydazą. Hydrolizuje skrobię do

maltozy poprzez kolejne odłączanie dwóch reszt glukozy od nieredukujących końców

łańcucha

glikozydowego,

tworząc

maltozę.

Enzym

ten

nie

rozkłada

wiązań

α-1,6-glikozydowych, dlatego amylozę rozkłada całkowicie (ryc.5a), a amylopektynę tylko w

ok. 65%, pozostawiając „rdzeń” amylopektynowy, tzw. dekstrynę graniczną, zawierającą

wszystkie rozgałęzienia (ryc.5b). Enzym ten rozkłada więc tylko boczne łańcuchy

amylopektyny do maltozy, pozostawiając środkową część cząsteczki w postaci dużej

dekstryny granicznej. Dalsza hydroliza tej dekstryny jest możliwa tylko dzięki łącznemu

działaniu obu amylaz: α-amylaza rozcinając od środka nierozłożoną część amylopektyny na

rozgałęzione fragmenty, powoduje jednocześnie uwolnienie się nowych odcinków łańcuchów

prostych, które mogą być wówczas rozłożone przez β-amylazę do maltozy. Dwucukier

maltoza jest następnie rozszczepiany przez α-glukozydazę do glukozy. Na skutek działania

β-amylazy wzrasta redukcyjność kleiku skrobiowego.

Ryc.5.

Schemat działania β-amylaz: a) na amylozę b) na amylopektynę

dekstryna graniczna

a)

b)

6

R

EAKCJE SKROBI Z JODEM

Obecność skrobi w próbie można stwierdzić na podstawie próby jodowej. W obecności

skrobi występuje charakterystyczne granatowe zabarwienie. Amyloza daje z jodem

zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest

zdolna do tworzenia kompleksu z jodem. Musi istnieć konfiguracja heliksu, aby cząsteczki

jodu mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na sześć reszt

glukozylowych, czyli na jeden skręt heliksu. Ogrzewanie kleiku skrobiowego powoduje

rozkręcanie się heliksu, co jest przyczyną zanikania niebieskiego zabarwienia z jodem.

Obserwując zmiany zabarwienia w trakcie wykonywania próby jodowej, można określić

stopień zhydrolizowania skrobi. W obecności amylodekstryn zabarwienie przechodzi w

fioletowe, erytrodekstryn w czerwone, achrodekstryn w pomarańczowe, natomiast

maltodekstryny, maltoza oraz glukoza nie dają z jodem barwy.

Na tworzenie barwnych kompleksów z jodem istotny wpływ ma pH środowiska. Skrobia

nie tworzy z jodem zabarwienia w środowisku zasadowym, gdyż jod przereaguje z zasadą

według równania:

I

2

+ 2NaOH NaIO + H

2

O + NaI

W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym:

NaIO + NaI + 2HCl 2NaCl + I

2

+ H

2

O

7

C

EL ĆWICZENIA

1. Izolacja skrobi z ziemniaków.

2. Badanie właściwości skrobi.

3. Porównanie efektywności hydrolizy kwasowej i enzymatycznej kleiku

skrobiowego.

WYKONANIE ĆWICZENIA

1. I

ZOLACJA SKROBI Z ZIEMNIAKÓW

Obrane i umyte ziemniaki (ok. 3 sztuki) utrzeć na miazgę i dodać równą objętość wody,

zmieszać i przesączyć przez kilka warstw gazy. Przesącz rozcieńczyć 2-3 krotnie wodą i

zdekantować. Zlać ciecz znad osadu, skrobię zawiesić w etanolu i powtórnie zdekantować.

Następnie skrobię wysuszyć na powietrzu.

2.

B

ADANIE ROZPUSZCZALNOŚCI SKROBI

Do około 1g skrobi dodać kilka cm

3

wody, dobrze wymieszać i przesączyć przez bibułę.

Do przesączu wprowadzić kroplę roztworu I w KI. Zinterpretować.

3.

P

RZYGOTOWANIE KLEIKU SKROBIOWEGO

W zlewce zagotować około 75 cm

3

wody. W drugiej zlewce sporządzić jednolitą

zawiesinę 1g skrobi w 15 cm

3

zimnej wody, którą wlać do wrzącej wody ciągle mieszając.

Zlewkę po zawiesinie przepłukać 10 cm

3

wody i dodać do wrzącego roztworu. Gotować do

całkowitego rozpuszczenia. Otrzymany opalizujący roztwór skrobi będzie wykorzystywany do

dalszych doświadczeń.

4.

W

YSALANIE SKROBI

Do 3 cm

3

kleiku skrobiowego dodać 5 cm

3

nasyconego roztworu (NH

4

)

2

SO

4

. Po 5 min

przesączyć i do przesączu dodać kroplę I w KI. Brak zabarwienia świadczy o całkowitym

wytrąceniu skrobi z roztworu. Zinterpretować.

8

5.

W

PŁYW WARUNKÓW ŚRODOWISKA NA PRZEBIEG REAKCJI SKROBI Z JODEM

• T

EMPERATURA

Do 2 cm

3

kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu I w KI. Powstaje niebieskie

zabarwienie. Probówkę ogrzać. Niebieskie zabarwienie znika. Po ochłodzeniu pod bieżącą

wodą zabarwienie powraca. Zinterpretować.

• pH

ŚRODOWISKA REAKCJI

Do 2 cm

3

kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1 M roztworu NaOH i kroplę roztworu I

w KI. Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym barwa pojawia się.

Zinterpretować.

6. B

ADANIE EFEKTYWNOŚCI HYDROLIZY KLEIKU SKROBIOWEGO

Przed rozpoczęciem hydrolizy w statywie umieścić dwa szeregi probówek, w każdym po

5 sztuk. Jeden szereg posłuży do wykonania próby jodowej, a drugi do wykonania reakcji

Benedicta. Do wszystkich probówek pierwszego szeregu dodać po 1 cm

3

0,002% roztworu I

w KI. Do pierwszej probówki w każdym szeregu dodać 1 cm

3

kleiku skrobiowego. Po

rozpoczęciu hydrolizy, co 3 minuty przenosić po 1 cm

3

hydrolizatu do kolejnych probówek

pierwszego i drugiego szeregu. W pierwszym szeregu obserwować zanik barwy. W drugim

szeregu probówek hydrolizat doprowadzić natychmiast roztworem NaOH do pH ok.8, dodać

3 cm

3

odczynnika Benedicta i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Obserwować

powstający pomarańczowy osad Cu

2

O.

Wyniki zestawić w tabeli i zinterpretować.

H

YDROLIZA KLEIKU SKROBIOWEGO

•

KWASOWA

Do 13 cm

3

roztworu kleiku skrobiowego dodać 2 cm

3

stęż. H

2

SO

4

. Po zmieszaniu pobrać

próbkę do badania efektywności hydrolizy, a następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Co

3 minuty pobierać do analizy hydrolizat (patrz badanie efektywności hydrolizy).

•

ENZYMATYCZNA

Do 13 cm

3

roztworu kleiku skrobiowego dodać 2 cm

3

roztworu enzymu. Bezpośrednio po

zmieszaniu pobrać próbkę do badania efektywności hydrolizy, a następnie inkubować w łaźni

wodnej o temperaturze 37

o

C. Co 3 minuty pobierać do analizy hydrolizat (patrz badanie

efektywności hydrolizy).