Opracowa

ł: dr S. Wierzba

Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej

Uniwersytetu Opolskiego

METODY PRZECHOWYWANIA

I UTRWALANIA BIOPRODUKTÓW

METODY ZAMRA

ŻANIA CZ.1

METODY ZAMRA

ŻANIA

Odporno

ść drobnoustrojów na niskie temperatury jest znacznie większa niż na wysokie

temperatury.

Redukcja OLB nast

ępuje głównie w wyniku przemian fazowych wody:

• po

żywka przechłodzona (-3

0

C) – prze

żywalność ok.. 97%,

• po

żywka zamrożona (-3

0

C) – prze

żywalność ok.. 2%

• bakterie G- bardziej wra

żliwe na niskie temperatury niż G+

• wi

ększa przeżywalność dla drobnoustrojów w fazie stacjonarnej niż logarytmicznej

• drobnoustroje patogenne i nie patogenne nie wykazuj

ą różnic pod względem

prze

żywalności

• Clostridium boutilinum nie rozwija si

ę poniżej -3,3

0

C

• Staphylococcus aureus, Sallmonella sp. – poni

żej -6,7

0

C

• dolne granice zdolno

ści rozmnażania:

• bakterie -5

¸-8

0

C

• dro

żdże -10

¸-12

0

C

• ple

śnie -12

¸-15

0

C

METODY ZAMRA

ŻANIA

Temperatury subminimalne

– ni

ższe od minimalnej temperatury wzrostu (rozmnażanie i

wi

ększość procesów metabolicznych ulega zahamowaniu), mogą być przyczyną: śmierci,

przej

ścia w stan anabiozy, zaburzeń metabolizmu:

•

subminimalne dodatnie:

„zimny szok” - krzepni

ęcie lipidów wchodzących w skład

biomembran – zaburzenia transportu:

•

szczególnie wra

żliwe G- w log fazie wzrostu

– szybkie obni

żenie temperatury do 0-5

0

C

śmierć większości komórek

•

sk

ład pożywki

:

- bogatszy sk

ład – większa wrażliwość

- ochronne dzia

łanie Mg

2+

i Ca

2+

, oraz ATP, kwasów nukleinowych, bia

łek,

aminokwasów (przenikaj

ących na zewnątrz wskutek utraty szczelności błon

biologicznych)

‏

•

temperatura

– wi

ększa oporność bakterii hodowanych w niższych temperaturach (20

0

C)

•

subminimalne ujemne

: spadek liczebno

ści jest wynikiem:

• mechanicznego uszkodzenia - kryszta

ły lodu

• szoku osmotycznego – wzrost st

ężenia soli wywołany dehydratacją komórek

METODY ZAMRA

ŻANIA

Pod wzgl

ędem wrażliwości na

temperatury subminimalne ujemne

drobnoustroje dzielimy na:

• prze

żywające mrożenie i rozmrażanie (przetrwalniki bakterii, zarodniki grzybów),

• niewra

żliwe na zamrażanie, ale wymierające w czasie przechowywania,

• wra

żliwe na zamrażanie i wymierające w czasie przechowywania,

• nie prze

żywające procesu mrożenia niezależnie od warunków (glony, pierwotniaki)

METODY ZAMRA

ŻANIA

Schemat post

ępowania przy zamrażaniu

drobnoustrojów zaabsorbowanych na
pere

łkach szklanych, propylenowych –

wykorzystywany przy cz

ęstym pobieraniu

materia

łu

METODY ZAMRA

ŻANIA

Zamra

żanie kultur drożdży i grzybów

nitkowatych – w szklanych lub
propylenowych „s

łomkach”:

a. b. wzrost kultur na pod

łożu stałym

lub p

łynnym

c. sporz

ądzenie zawiesiny w

obecno

ści czynników ochronnych

d. nape

łnienie sterylnych „słomek”

propylenowych lub szklanych kapilar

e. wzrost grzybni na pod

łożu

agarowym z 5% glicerolem

f. g. h. nape

łnienie kapilar grzybnią

i. k. zamro

żenie w ciekłym azocie

METODY ZAMRA

ŻANIA

Utrwalanie drobnoustrojów w
warunkach beztlenowych –
konieczno

ść stosowania sterylnego,

gazu oboj

ętnego (N

2

, CO

2

)

METODY ZAMRA

ŻANIA

Wa

żnym czynnikiem w utrwalaniu drobnoustrojów jest

kontrola tempa zamra

żania

(du

ża

ilo

ść małych kryształków lodu) – znanych jest wiele metod kontrolowanego, stopniowego

zamra

żania:

• zamra

żarki – 1-2

0

C/minut

ę, do temperatury kilka stopni powyżej punktu przemiany

faz (-20/-30

0

C)

• ciek

ły azot – bardzo szybkie mrożenie, aż do przekroczenia temperatury przemiany

faz

• ewentualne ponowne wolne och

ładzanie 1

0

C/minut

ę, aż do właściwej temperatury

przechowywania

W przypadku d

ługotrwałego przechowywania (wartościowych tkanek) stosuje się

zamra

żanie w ciekłym azocie (-196

0

C), oraz

witryfikacj

ę

:

• jednostopniowe, g

łębokie zamrażanie w zawiesinie krioochronnej o bardzo dużym

ci

śnieniu osmotycznym (8 mol/dm

3

), gwa

łtowne zamrażanie - 1000

0

C/minut

ę:

• dehydratacja

• brak kryszta

łów – powstaje jednolita tafla lodu

METODY ZAMRA

ŻANIA

Zamra

żanie biopreparatów – powszechnie stosowana metoda utrwalania np. kultur

starterowych bakterii fermentacji mlekowej, dro

żdży piekarskich, zarodków zwierzęcych.

Zamra

żanie biomas mikroorganizmów:

• zamra

żarki mechaniczne od -10

0

C do -80

0

C

• ciek

łe gazy (azot -196

0

C)

Prze

żywalność mikroorganizmów uzależniona jest od:

•

rodzaju mikroorganizmów

np. Lactobacillus acidophilus

• wolne tempo (stres przedzamra

żalniczy) – mała przeżywalność

• gwa

łtowne zamrożenie z 37

0

C do -80

0

C – ma

ła przezywalność (ok.. 40%)

• wolne, stopniowe obni

żanie temperatury (adaptacja do niższych temperatur –

wst

ępna inkubacja 6h – 22

0

C, itd..) – wysoka prze

żywalność (ok.. 75%)

• oddzia

ływanie na skład lipidów ścian komórkowych, adaptacja zwiększa udział

nienasyconych kwasów t

łuszczowych, znacznie poprawia termotolerancyjność

komórek

•

warunki hodowli

• pH (Lactococcus sp.)

• pH < 5,5 znaczne obni

żenie krioodporności

• pH ok.. 6,0 mniejsza podatno

ść komórek na pogorszenie żywotności

• podwy

ższone ciśnienie osmotyczne (dehydratacja, bisynteza trehalozy)

METODY ZAMRA

ŻANIA

•

sk

ład pożywki

– udzia

ł krioprotektantów

• zewn

ątrzkomórkowych: manitol, sorbitol, dekstran, metoloceluloza, żelatyna,

• wnikaj

ących do wnętrza komórki: DMSO, alkohole polihydroksylowe

•

wiek kultury

– najodporniejsze komórki w stacjonarnej fazie wzrostu

Reakcja dro

żdży na stres temperaturowy – synteza protektorów – czynników ochronnych

komórek:

• „bia

łka szoku cieplnego” – przeciwdziałają agregacji białek o zmienionej termicznie

strukturze:

• NSR1 – warunkuj

ących syntezę mRNA w niskich temperaturach

• TIP1, TIP1/2 – reguluj

ących funkcje ściany komórkowej

• CSF1 – umo

żliwiające aktywność fermentacji w niskich temperaturach

• glikogen

• trehaloza (disacharyd) – najwa

żniejszy metabolit stresowy drożdży (szok temperaturowy,

osmotyczny), oddzia

ływuje na ściany komórkowe drożdży

METODY ZAMRA

ŻANIA

Rozmra

żanie bioproduktów

– proces zmiany stanu zawartej w nich wody i przywrócenie

produktom ich w

łasności naturalnych (poprzez doprowadzenie ciepła z zewnątrz):

• proces przebiega na zasadzie odwróconej krzywej zamra

żania,

• znacznie wolniej (ciep

ło jest doprowadzane z zewnątrz przez rozmrożoną powierzchnie o

ni

ższej przewodności cieplnej, wyższym cieple właściwym, większej gęstości)

• 3-4 krotnie zmniejszony wspó

łczynnik dyfuzyjności cieplnej (mniejsza prędkość i czas

wyrównania temperatur)

• niebezpiecze

ństwo powierzchniowego przegrzania produktu – zbyt intensywne ogrzewanie

METODY ZAMRA

ŻANIA

Przemys

łowe metody rozmrażania produktów

:

•

ogrzewanie powierzchniowe

– doprowadzenie ciep

ła do powierzchni produktu:

• w powietrzu o temperaturze 0-4

0

C (wolne)

• para wodna – powietrze w temperaturze 25-40

0

C (szybkie)

• woda lub solanka w temperaturze 4-20

0

C przez zanurzenie

• w lodzie (bardzo wolne)
• na gor

ącej metalowej powierzchni (bardzo szybkie) - kontaktowe

•

ogrzewanie wewn

ętrzne

ca

łej objętości produktu w polu elektrycznym wysokiej

cz

ęstotliwości: dielektryczne, mikrofalowe, oporowe

Ogrzewanie w powietrzu:

• 1 etap – ogrzewanie do temperatury krioskopowej na powierzchni produktu

• 2 etap – w

łaściwe rozmrażanie przemiana fazowa lodu w całej objętości produktu

Urz

ądzenia tunelowe (obieg ciepłego, wilgotnego powietrza)

METODY ZAMRA

ŻANIA

Rozmra

żanie przez ogrzewanie wewnętrzne

– produkty o jednolitej strukturze i regularnych

kszta

łtach:

•

mikrofalowe

• fale elektromagnetyczne o cz

ęstotliwości 915 i 2450 MHz, fale są absorbowane przez

substancje dielektryczne powoduj

ąc efekt grzejny

• efekt grzejny zale

ży od właściwości dielektrycznych produktów (tłuszcz, tkanka

mi

ęśniowa)

• zaletami s

ą duża równomierność nagrzewania, znaczne skrócenie czasu

rozmra

żania, możliwość kontroli przebiegu procesu i jego automatyzacji

•

dielektryczne, oporowe

– pole elektryczne jest wytwarzane przez elektrody otaczaj

ące

produkt, cz

ęstotliwość fal 27-100 MHz

• du

ża szybkość, lepsza jakość produktu w porównaniu do innych metod rozmrażania,

mo

żliwość rozmrażania wewnątrz opakowań

Rozmra

żanie drobnoustrojów:

•

łaźnia wodna 20-35

0

C

• powietrze 20

0

C i

łaźnia wodna

• wa

żne usunięcie, rozcieńczenie krioprotektantów

METODY ZAMRA

ŻANIA

Czynniki ch

łodnicze

Woda

–

środowisko chłodzące stosowane w metodach wstępnego wychładzania produktów:

• zimna woda wodoci

ągowa

• woda lodowa temperatura ok.. 0

0

C (zraszanie woda wodoci

ągową lodu)

Solanki

– wodne roztwory chlorków sodu, wapnia, magnezu:

• zakres stosowania jest ograniczony w

łaściwościami fizycznymi (punkt eutektyczny)

• NaCl

MgCl

2

CaCl

2

• zamra

żanie przez zanurzenie (ograniczenie – przenikanie soli do produktu)

METODY ZAMRA

ŻANIA

Amoniak (R717)

-33,3

0

C – du

że instalacje przemysłowe

• du

ża wydajność chłodnicza, ciepło parowania

• ma

ła rozpuszczalność w oleju (pompy olejowe)

• toksyczno

ść – dopuszczalne stężenie 0,01%

Freony

– halogenowe zwi

ązki węglowodorów nasyconych, mają różny potencjał zagrożenia

ekologicznego (stopniowo wycofywane z u

życia), duża sprawność, rozpuszczają olej:

• CFC – w pe

łni halogenowe związki węgla (chlorofluorokarbony), wszystkie atomy

wodoru zast

ąpione chlorem i fluorem np.. R12 (CF

2

Cl

2

) wydajno

ść ok.. 35% mniejsza

ni

ż amoniak, duże zagrożenie ekologiczne, wycofany z użycia,

• HCFC – wodorochlorofluorokarbony, nie wszystkie atomy wodoru zast

ąpione chlorem

i fluorem np.. R22 (CHF

2

Cl) wydajno

ść zbliżona do amoniaku, powszechnie stosowany

zamiennik R12,
• HFC – wodorofluorokarbony, cz

ęść atomów wodoru zastąpiona fluorem np. R134a

(CH

2

FCF

3

), nieco mniejsza wydajno

ść w porównaniu do R22, przewidziany jako

g

łówny zamiennik R12,

• FC – w

ęglowodory w pełni halogenowe, wszystkie atomy wodoru zastąpione fluorem

Ciek

ły azot (LIN):

-195,8

0

C, z uwagi na bardzo nisk

ą sprawność procesu (ok.. 10-krotnie

mniejsza ni

ż w przypadku amoniaku) stosuje się na małą skalę do celów specjalnych, lub w

kombinacji z tradycyjnymi metodami

Ciek

ły dwutlenek węgla (LIC)

pod ci

śnieniem 2MPa, temperatura -20/-30

0

C,

• wspó

łczynnik wnikania ciepła ok.. 2-krotnie mniejszy niż w LN

2

• d

łuższy czas zamrażania

• korzystny pod wzgl

ędem ekonomicznym