Wykład 7

1

Mikrobiologia przemysłowa

Metody przechowywania mikroorganizmów o znaczeniu

przemysłowym.

1

Przechowywanie mikroorganizmów o
znaczeniu przemysłowym



Mikroorganizmy stanowiące główne ogniwo procesów

biotechnologicznych powinny:



Zapewniać wysoką wydajność produktu



Powtarzalność prowadzonych procesów

2

Wykład 7

2



Należy odpowiednio zabezpieczyć uzyskane szczepy

mikroorganizmów z uwzględnieniem:



Czystości mikrobiologicznej



Maksymalnej żywotności komórek



Stabilności cech fizjologicznych i genetycznych

Przechowywanie mikroorganizmów o
znaczeniu przemysłowym

3

Cechy dobrej metody przechowalniczej



Zapewnia maksymalną przeżywalność komórek



Minimalizuje ilość uszkodzonych komórek



Przeciwdziała spontanicznym mutacjom i selekcji komórek

mniej przydatnych w procesie technologicznym



Ogranicza

przypadkowe

zanieczyszczenia

innymi

mikroorganizmami

4

Wykład 7

3

W przemyśle wykorzystuje się bardzo wiele różnych

mikroorganizmów, przez co trudno jest opracować jedną

uniwersalną metodę przechowalniczą, która byłaby odpowiednia

dla wszystkich drobnoustrojów.

Cechy dobrej metody przechowalniczej

5

Najczęściej stosowane metody to:



okresowe przesiewanie / pasażowanie



suszenie



liofilizacja



zamrażanie

Przechowywanie mikroorganizmów o
znaczeniu przemysłowym

6

Wykład 7

4

Okresowe przesiewanie / pasażowanie



Szczepy w warunkach laboratoryjnych są
przesiewane co pewien czas na świeże
podłoża



Mikroorganizmy

przechowywane

w

temperaturze pokojowej bądź 4°C

Skosy dodatkowo mogą być zalane jałową parafiną - w przypadku mikroorganizmów
beztlenowych lub fakultatywnie beztlenowych (np. drożdże) – w celu ograniczenia
metabolizmu przechowywanych mikroorganizmów oraz zmniejszenia ryzyka
zanieczyszczenia hodowli.

7



Zalety



Łatwy dostęp do mikroorganizmów aktywnych metabolicznie



Metoda stosowana do wszystkich

mikroorganizmów hodowalnych



Wady



Mikroorganizmy niestabilne fizjologicznie i genetycznie (możliwość wystąpienia
mutacji spontanicznych)



Ryzyko zanieczyszczenia kultury



Konieczność częstego przesiewania (raz na miesiąc)

Okresowe przesiewanie / pasażowanie

8

Wykład 7

5

Anabioza



Stan

odwracalnego

zahamowania

procesów

życiowych

mikroorganizmu



Zahamowanie metabolizmu komórki



Podwyższona oporność na niekorzystne czynniki zewnętrzne



Zdolność odtwarzania procesów życiowych w odpowiednich
warunkach

9



Najprościej przechowuje się mikroorganizmy, które wykazują
naturalną zdolność do tworzenia form przetrwalnikowych



Bakterie przetrwalnikujące np. Bacillus



Promieniowce



Grzyby strzępkowe

Suszenie

10

Wykład 7

6

Suszenie



Suszenie na podłożu wzrostowym



Przechowywane w postaci



kultur wysuszonych na skosach



przetrwalników zebranych z podłoży i wymieszanych z
odpowiednim nośnikiem

np. jałowy piasek, ziemia, żel

silikonowy, węgiel aktywny



Można również suszyć preparaty w próżni po
uprzednim zawieszeniu w czynniku ochronnym np.
5% chude mleko

11

Suszenie



Po przygotowaniu preparatu przechowuje się je

szczelnie zamknięte w temperaturze pokojowej

bądź w 4°C.



Daje to żywotność nawet do kilku lat.

12

Wykład 7

7

Suszenie



Zalety



Długotrwałe przechowywanie



Wykorzystanie naturalnych preferencji
mikroorganizmów



Metoda nie uszkadzająca komórek



Duży odsetek przeżywalności



Stabilność genetyczna przechowywanych
mikroorganizmów



Wady



Nie można wykorzystać przy mikroorganizmach
nieprzetrwalnikujących

13

Liofilizacja



Proces dwuetapowy:



Zamrożenie zawiesiny komórek w -70°C



Wysuszenie w próżni (sublimacja) – preparat powinien zawierać
mniej niż 1% wody



W celu zwiększenia przeżywalności komórek:



Biomasa z wczesnej fazy stacjonarnej



Zawiesina komórek o dużej gęstości



Czynniki (media) ochronne



Przechowywanie preparatów w 4°C

14

Wykład 7

8

Liofilizacja



Zalety:



Długoletnie przechowywanie wszystkich typów mikroorganizmów



Czystość przechowywanych kultur



Mikroorganizmy zachowują cechy morfologiczne, biochemiczne i
immunologiczne



Stabilność genetyczna mikroorganizmów



Wady:



Wysoka śmiertelność komórek w trakcie przygotowywania preparatu
(przeżywalność 30-40%)



Konieczność przeprowadzenia wielokrotnego pasażu w celu
reaktywacji komórek

15

Zamrażanie



Mikroorganizmy przechowywane w temperaturze:



-20°C, -70°C lub -196°C (ciekły azot)



Przygotowanie:



Odpowiednia faza wzrostu



Oddzielenie od pożywki



Zawieszenie komórek w medium ochronnym

16

Wykład 7

9

Zamrażanie



Zalety:



Długi okres przechowywania



Stosunkowo duża przeżywalność komórek



Możliwość zastosowania do wszystkich mikroorganizmów



Czystość przechowywanych kultur



Mikroorganizmy zachowują cechy morfologiczne, biochemiczne i

immunologiczne



Stabilność genetyczna mikroorganizmów



Wady:



Konieczność stosowania medium ochronnego



Możliwość uszkodzenia części komórek

17

Ochrona komórek podczas zamrażania



Struktura komórek może ulec uszkodzeniu w wyniku:



Wzrostu stężenia elektrolitu



Wymrożenia wody



Formowania się kryształków lodu

18

Wykład 7

10



Warunki zamrażania:



Szybkie obniżenie temperatury



Stosowanie odpowiednich mediów ochronnych



Warunki rozmrażania:



Szybkie przeniesienie próbek do temperatury max.
40°C



Przeniesienie biomasy do odpowiedniej pożywki.

Ochrona komórek podczas zamrażania

19

Medium ochronne – związek zabezpieczający komórki przed uszkodzeniem podczas
zamrażania, przy czym nie wpływa na ich cechy antygenowe i właściwości
technologiczne preparatu, np.:



substancje naturalne zawierające



białka (

bulion, mleko, pepton, żelatyna, serwatka, surowica

),



sacharydy (

glukoza, sacharoza, laktoza, dekstran

),



aminokwasy (

Asp, Glu

),



roztwory glicerolu lub DMSO (

5-20%

)



związki poliwinylowe, polietylenowe

Media ochronne stosowane przy zamrażaniu komórek

20

Wykład 7

11



Celem kolekcji jest zapewnienie referencyjnych szczepów

mikroorganizmów dla celów:



badawczych,



porównawczych



przemysłowych.

Kolekcje szczepów

21

ZADANIA KOLEKCJI

Poszukiwanie nowych

szczepów o

przydatnych cechach

Klasyfikacja,

identyfikacja i

charakterystyka

drobnoustrojów

Kultury starterowe dla

przemysłu

22

Wykład 7

12

Kolekcje szczepów

Przemysłowe



zawierają szczepy mikroorganizmów o zdefiniowanych cechach



Zapewniają dostępność odpowiednich kultur starterowych
niezbędnych w procesach technologicznych

Naukowe



zawierają szczepy mikroorganizmów dobrze zbadane oraz wstępnie
scharakteryzowane

23

Kolekcje przemysłowe



Służą do przygotowywania i dostarczania czystych kultur
(szczepionek, starterów) do zakładów produkcyjnych

Cechy dobrej szczepionki:



Umożliwia wytworzenie pożądanych cech produktu



Nadaje produktom standardowe cechy określone normami



Zapewnia wysoką trwałość i jakość produktu

24

Wykład 7

13

Produkcja szczepionek



Namnożenie mikroorganizmów w optymalnych warunkach hodowlanych



Uzyskanie dużej liczby komórek w stanie pełnej aktywności metabolicznej



Standaryzacja składu gatunkowego



Zabezpieczenie żywotności komórek i ich właściwości metabolicznych przez ich

utrwalenie

Najczęściej przygotowuje się szczepionki liofilizowane lub zamrożone.

25

Uaktywnianie i namnażanie szczepów

przemysłowych



Zależy od metody przechowywania



Odpowiednie podejście zapewnia aktywację możliwie największej ilości

przechowywanych mikroorganizmów



Podłoże na które wysiewa się dany mikroorganizm powinno być zoptymalizowane

do potrzeb konkretnego mikroorganizmu



Inkubacja mikroorganizmów w optymalnych dla nich warunkach fizyko-chemicznych

26

Wykład 7

14



Pasażowanie



Regularne przesiewanie mikroorganizmów na jałowe podłoże o optymalnym

składzie i inkubacja w optymalnych warunkach

Uaktywnianie i namnażanie szczepów

przemysłowych

27



Preparaty wysuszone



Jeżeli są przechowywane na skosach – zmywa się zawiesinę przetrwalników z podłoża i

zawiesza w jałowym medium hodowlanym o optymalnym składzie i inkubacja w

optymalnych warunkach



Jeżeli wysuszone mikroorganizmy są zmieszane z materiałem sypkim lub

przechowywane na krążkach lub skrawkach bibuły, umieszcza się je wprost w podłożu o

właściwym składzie i temperaturze, a następnie inkubuje się w określonych warunkach

Uaktywnianie i namnażanie szczepów

przemysłowych

28

Wykład 7

15



Ożywianie mikroorganizmów z liofilizatów



Zawieszenie liofilizatu w małej objętości pożywki hodowlanej np. wprowadzenie 0,5 ml do

ampułki



Przeniesienie zawiesiny do jałowego medium hodowlanego o optymalnym składzie i

inkubacja w optymalnych warunkach

Uaktywnianie i namnażanie szczepów

przemysłowych

29

Uaktywnianie i namnażanie szczepów

przemysłowych



Rozmrażanie:



zminimalizowanie uszkodzeń powstałych w wyniku rekrystalizacji kryształków lodu w

komórkach – szybkie przekroczenie przedziału temp. od -45°C do -5°C



Po wyjęciu pojemników tj. ampułki, kapilary, probówki odkazić 70% etanolem w celu

uniknięcia kontaminacji



Umieścić zamrożoną zawiesinę komórek w łaźni wodnej o temp. 30 – 40 °C



Zawiesinę komórek przenieść do jałowego medium hodowlanego i inkubować w

odpowiednich warunkach

30

Wykład 7

16



W warunkach przemysłowych materiałem posiewowym wprowadzanym do bioreaktora

produkcyjnego jest zwykle hodowla komórek wegetatywnych stosowana w objętości

2-10% objętości pożywki hodowlanej.



Komórki w końcowej fazie logarytmicznego wzrostu lub z początkowej fazy

stacjonarnej



W przypadku promieniowców i grzybów korzystne jest mechaniczna fragmentacja

grzybni



W niektórych przypadkach materiałem posiewowym są spory (fermentacja cytrynianowa)

Uaktywnianie i namnażanie szczepów

przemysłowych

31