WYDZIAA
CHEMICZNY POLITECHNIKI ÅšL
SKIEJ
W GLIWICACH
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ
I BIOTECHNOLOGII
ĆWICZENIE 7
ENZYMATYCZNA REDUKCJA
AROMATYCZNYCH ZWI
ZKÓW NITROWYCH
Opracowała: mgr inż. Agnieszka Paz
dzierniok  Holewa
Prowadzący: mgr inż. Agnieszka Paz
dzierniok  Holewa
Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych
I. CEL ĆWICZENIA:
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie katalizowanej enzymatycznie redukcji
1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroanizolu, odpowiednio, do 2-nitroaniliny i 2-metoksy-5-
nitroaniliny przy użyciu drożdży piekarskich.
I. WPROWADZENIE:
Bezpośrednia redukcja aromatycznych związków nitrowych stanowi ważną reakcję
otrzymywania amin aromatycznych, będących cennymi reagentami stosowanymi w syntezie
organicznej. RedukcjÄ™ tÄ… przeprowadza siÄ™ metodÄ… katalitycznego uwodornienia lub za
pomocą wielu odczynników, np.: metali (Zn, Sn, Fe lub nieraz inny metal) w obecności
kwasu, siarczków ( NaHS lub (NH4)2S), hydrazyny wobec katalizatora.
SelektywnÄ… redukcjÄ™ 1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroanizolu odpowiednio, do 2-
nitroaniliny i 2-metoksy-5-nitroaniliny można przeprowadzić zarówno metodą katalitycznego
uwodornienia, jak również w przypadku 1,2-dinitrobenzenu używając siarczku amonu
(Schemat 1, Schemat 2).
NO2
NH2
NO2
NO2
Metoda Wydajność
[%]
I: (NH4)2S/EtOH -
II: Ni Raney a, kwas octowy, 2-propanol, reflux 74
III: Ni, kwas maleinowy, kwas octowy, reflux 81
IV: Pd-C, cykloheksen, etanol, reflux -
Schemat 1
OCH3
OCH3
NO2
NH2
NO2
NO2
Metoda Wydajność
[%]
I: Pd-C, Et3N, kwas mrówkowy, reflux, 5 min 24
II: N2H2, Ni Raney a, MeOH, 40-50 oC 8
Schemat 2
2
Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych
Alternatywą w stosunku do opisanych powyżej chemicznych metod redukcji jest
redukcja aromatycznych związków nitrowych z użyciem biokatalizatora. Reakcja ta
charakteryzuje się wysoką regio- i chemoselektywnością.
Przemianę nitrobenzenu do aniliny z udziałem drożdży piekarskich zaobserwowali po
raz pierwszy Neuberg i Welde już w 1914 r. Wśród wielu mikroorganizmów drożdże
piekarskie (Saccharomyces cerevisiae, ang. bakers yeast) stanowiÄ… cenny biokatalizator.
Swoją popularność zawdzięczają nieograniczonej dostępności (światowa produkcja ok. 600
ton/rok), niskiej cenie oraz łatwości hodowli (nie jest konieczne doświadczenie
mikrobiologiczne, sterylne warunki ani specjalistyczne wyposażenie). Reakcje za pomocą
drożdży wykonuje się w warunkach fermentacyjnych w środowisku wodnym lub w
rozpuszczalnikach organicznych. W warunkach wodnych żywe komórki syntezują i
regenerują enzymy i kofaktory, niezbędne do prowadzenia metabolizmu, co umożliwia
zredukowanie ilości drożdży, ale często komplikuje izolację produktu lub nie daje się
zastosować do nierozpuszczalnych w wodzie substratów. W środowisku organicznym
wykorzystuje się wyłącznie zawarte w komórkach enzymy i kofaktory bez możliwości ich
regeneracji, co narzuca konieczność zwiększenia ich ilości.
Badania wykazały, że przebieg redukcji monopodstawionych nitrobenzenów silnie
zależy od charakteru podstawnika. Jeśli związek zawiera grupę elektronodonorową (np.: NH2,
OH, SH, OCH3, CH3, Br) to wydajność reakcji redukcji jest niska lub w ogóle ona nie
zachodzi. Jeżeli podstawnik ma charakter elektronoakceptorowy (np.: NO2, CN, CF3, COOEt)
redukcja nitrobenzenów zachodzi łatwo z dobrymi wydajnościami. Przykładem tego jest
katalizowana drożdżami redukcja 1,2-dinitrobenzenu, w rezultacie której powstaje 2-
nitoranilina z wysoką wydajnością, porównywalną z wydajnościami otrzymywanymi w
redukcji metodami chemicznymi (Schemat 3).
NO2
NO2
NO2
NH2
drozdze
woda, 30oC
50-70%
Schemat 3
ProwadzÄ…c w analogicznych warunkach selektywnÄ… redukcjÄ™ 2,4-dinitroanizolu
otrzymać można 2-metoksy-5-nitroaniliną z wydajnością wyższą niż otrzymana metodami
chemicznymi (Schemat 4).
OCH3
OCH3
NO2
NH2
drozdze
woda, 30oC
NO2 59%
NO2
Schemat 4
3
Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych
III. CZ
ŚĆ EKSPERYMENTALNA:
ZAGROŻENIA : Nitrobenzen i anilina oraz ich pochodne są substancjami działającymi
toksycznie na organizm ludzki przez drogi oddechowe oraz skórę.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: W czasie pracy należy zachować ostrożność!!! Stosuj
ubranie ochronne (fartuch), rękawice ochronne oraz okulary.
Ćwiczenie A. Redukcja 1,2-dinitrobenzenu do 2-nitroaniliny przy użyciu
drożdży piekarskich (Schemat 3)
Odczynniki:
1,2-dinitrobenzen (2,98 mmola, 0,5 g)
drożdże piekarskie (Saccharomyces cerevisiae), (50 g)
woda destylowana (200 cm3)
alkohol etylowy (5  8 cm3)
Celite ® lub Hyflo supercel
octan etylu
eter naftowy
2 molowy wodny roztwór wodorotlenku sodu
chlorek sodu
wata
Wykonanie:
1) W kolbie Erlenmayera o pojemności 500 cm3 umieść 200 cm3 wody destylowanej
oraz 50 g suchych drożdży. Następnie delikatnie zatkaj szyję kolby korkiem z waty i
umieść kolbę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 300C (200 obr./min.) na 2  3
godziny.
2) Odważ 0,5 g 1,2-dinitrobenzenu i umieść w probówce, następnie rozpuść w
minimalnej ilości alkoholu etylowego, a otrzymany roztwór wlej w sam środek
mieszaniny wyjętej z wytrząsarki.
3) Ponownie kolbę umieść w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 300C (200 obr./min.)
na 24 godziny.
Kontrola postępu reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
W celu kontroli postępu reakcji pobierz próbkę mieszaniny reakcyjnej (ok. 25  30
cm3) i zmieszaj ją z celitem (2  3 g). Otrzymaną mieszaninę przesącz przez złoże mokrego
celitu i oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (25 cm3). Uzyskane roztwory połącz.
Odczyn przesÄ…czu doprowadz
do pH = 7 przy użyciu 2 molowego roztworu NaOH, a
następnie fazę wodną nasyć stałym NaCl. Całość dokładnie wymieszaj, po czym fazę
organiczną oddziel i zatęż do objętości ok. 4  5 cm3. Skład przygotowanej próbki sprawdz

metodą TLC [układ rozwijający: eter naftowy/octan etylu, 1:1 (v/v); 1,2-dinitrobenzen Rf =
0,4 (w świetle lampy UV), 2-nitroanilina Rf = 0,55 (jasnożółta plamka widoczna w świetle
dziennym)].
4
Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych
4) Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaj celit (25  30 g) i pozostaw na
30 minut od czasu do czasu mieszając. Następnie zawiesinę przesącz na lejku
Büchnera przez zÅ‚oże mokrego celitu, a pozostaÅ‚e na lejku drożdże przemyj wodÄ…
destylowanÄ… (100 cm3). Odczyn przesÄ…czu doprowadz
do pH = 7 za pomocÄ… 2
molowego wodnego roztworu NaOH, a następnie nasyć go stałym NaCl.
5) Oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (2 ×100 cm3), a otrzymany przesÄ…cz użyj
do ekstrakcji roztworu wodnego nasyconego NaCl z pkt. 4.
6) MetodÄ… TLC sprawdz
czy w ekstahowanej fazie wodnej znajduje się jeszcze pożądany
produkt. Jeżeli faza wodna zawiera 2-nitroanilinę to należy powtórzyć ekstrakcję
jeszcze jednÄ… porcjÄ… octanu etylu (100 cm3).
7) Ekstrakty organiczne połącz i wysusz bezwodnym siarczanem (VI) magnezu.
Następnie środek suszący odsącz i odparuj rozpuszczalnik na wyparce rotacyjnej.
Surowy produkt oczyść metodą chromatografii kolumnowej [eluent: eter
naftowy/octan etylu 10:1 następnie 4:1 (v/v)]. Wydajność uzyskanej 2-nitroaniliny o
temp. topnienia 72-74 oC (pomarańczowe igły) wynosi 54% (0,22 g).
Ćwiczenie B. Redukcja 2,4-dinitroanizolu do 2-metoksy-5-nitroaniliny przy
użyciu drożdży piekarniczych (Schemat 4)
Odczynniki:
2,4-dinitroanizol (2,53 mmola, 0,5 g)
drożdże piekarskie (Saccharomyces cerevisiae), (70 g)
woda destylowana (200 cm3)
alkohol etylowy (5 cm3)
Celite ®
octan etylu
2 molowy wodny roztwór wodorotlenku sodu
chlorek sodu
wata
Wykonanie:
1) W kolbie Erlenmayera o pojemności 500 cm3 umieść 200 cm3 wody destylowanej
oraz 50 g suchych drożdży. Następnie delikatnie zatkaj szyję kolby korkiem z waty i
umieść kolbę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 300C (200 obr./min.) na 2
godziny.
2) Odważ 0,5 g 2,4-dinitroanizolu i umieść w probówce, następnie rozpuść w minimalnej
ilości alkoholu etylowego, a otrzymany roztwór wlej w sam środek mieszaniny
wyjętej z wytrząsarki.
3) Ponownie kolbę umieść w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 300C (200 obr./min.)
na 60 godzin.
Kontrola postępu reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
W celu kontroli postępu reakcji pobierz próbkę mieszaniny reakcyjnej (ok. 25  30
cm3) i zmieszaj ją z celitem (2  3 g). Otrzymaną mieszaninę przesącz przez złoże mokrego
celitu i oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (25 cm3). Połącz ze sobą uzyskane
roztwory. W razie konieczności odczyn przesączu doprowadz
do pH = 7 przy użyciu 2
5
Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych
molowego roztworu NaOH i nasyć fazę wodna NaCl. Całość dokładnie wymieszaj, po czym
fazę organiczną oddziel i zatęż do objętości ok. 4  5 cm3. Skład przygotowanej próbki
sprawdz
metodą TLC [układ rozwijający: eter naftowy/octan etylu, 2:1 (v/v); 2-metoksy-5-
nitroanilina Rf = 0,42 (w świetle lampy UV i jasno żółta plamka widoczna w świetle
dziennym), 2,4-dinitrobenzen Rf = 0,35 (w świetle lampy UV), 4-metoksy-5-nitroanilina Rf =
0,21 (w świetle lampy UV i jasno żółta plamka widoczna w świetle dziennym)].
4) Do mieszaniny dodaj kolejną porcję drożdży (10 g) i inkubację mieszaniny prowadz
w
temperaturze 300C w wytrzÄ…sarce orbitalnej (200 obr./min.) przez kolejne 24 godziny.
5) Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaj celit (10 g) i pozostaw na 30
minut od czasu do czasu mieszajÄ…c. NastÄ™pnie zawiesinÄ™ przesÄ…cz na lejku Büchnera
przez 10 cm złoże mokrego celitu z dwoma sączkami. W razie konieczności odczyn
przesÄ…czu doprowadz
do pH = 7 za pomocÄ… 2 molowego wodnego roztworu NaOH, a
następnie nasycić go NaCl.
6) Oddzielone drożdże przemyj porcjami octanu etylu (całość ok. 300 cm3), a otrzymany
przesącz użyj do ekstrakcji roztworu wodnego nasyconego NaCl z pkt. 5.
7) Fazę wodną poddaj ponownie ekstrakcji świeżą porcją octanu etylu (200 cm3).
8) Ekstrakty organiczne połącz i wysusz bezwodnym siarczanem (VI) magnezu. Środek
suszÄ…cy odsÄ…cz i rozpuszczalnik odparuj na wyparce rotacyjnej. Surowy produkt
oczyszczaj metodÄ… chromatografii kolumnowej [eluent: eter naftowy/octan etylu 4:1
(v/v)]. Wydajność uzyskanej 2-metoksy-5-nitroaniliny (pomarańczowe igły) wynosi
39% (0,12 g) o temperaturze topnienia 114.5  1150C.
IV. PRZYGOTOWANIE DO ZAJ
Ć:
1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki
laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej.
2. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: katalizator, enzym, kataliza enzymatyczna,
utlenienie, redukcja, selektywność, regioselektywność.
3. Zastanów się czy wiesz:
a) jakie są chemiczne metody redukcji aromatycznych związków nitrowych,
b) na czym polega specyficzność katalizy enzymatycznej.
4. Porównaj reakcję redukcji wybranego przez siebie aromatycznego związku nitrowego
przeprowadzoną metodą chemiczną z reakcją z użyciem biokatalizatora - opisaną w
instrukcji. Jakie wady i zalety dostrzegasz w obu metodach redukcji? (Przepis na reakcjÄ™
redukcji aromatycznych zw. nitrowych metodą chemiczną znajdziesz w podręcznikach do
preparatyki organicznej).
IV. WARUNKI ZALICZENIA :
1. Poprawne napisanie kartkówki.
2. Staranne wykonanie części eksperymentalnej.
3. Napisanie i oddanie sprawozdania do 2 tygodni (forma sprawozdania zostanie podana
przez prowadzącego w czasie trwania zajęć).
V. LITERATURA :
[1] J. March,  Chemia organiczna. Reakcje, mechanizmy, budowa. WNT, W-wa 1975
[2] Roberts S.M.(ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated enzymes in
Organic Synthesis, 1992, Wiley, London.
6
Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych
[3] J. Gawroński, K. Gawrońska, K. Kacprzak, M. Kwit,  Współczesna synteza organiczna.
Wybór eksperymentów. PWN, W-wa 2004
[4] P. Karlson  Zarys biochemii PWN, W-wa 1987
[5] S. Servi, Synthesis, 1-25 (1990)
7