Tom 53, 2004 Numer 2 (263) Strony 193 200 MARTA PAPROCKA i MAGDALENA WOAOSZYCSKA Zakład Biologii Molekularnej Komórki Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Wrocławski Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław e-mail: atilong@interia.pl POTRANSKRYPCYJNE WYCISZANIE GENÓW U ROŚLIN WSTP Przedmiotem genomiki funkcjonalnej jest zwierząt jak i u roślin (KUSABA 2004). Specy- badanie funkcji produktów ekspresji genów. ficzność sekwencyjna interferencji RNA jest Jeszcze do niedawna ogromne nadzieje na roz- tak wielka, że wprowadzenie do komórki dwu- wój tej dziedziny wiązano z możliwością se- niciowegoRNAoodpowiedniej sekwencji po- kwencjonowania genomów organizmów ży- zwala na precyzyjne wyłączenie ekspresji wy- wych. Wydawało się, że poznanie pełnej infor- branego genu. Ze względu na obszerność tema- macji genetycznej pozwoli na zrozumienie mo- tu omówienie zależnego od homologii wyci- lekularnych podstaw funkcjonowania i rozwo- szenia genów ograniczymy jedynie do głów- ju organizmu. Obecnie wiemy, że odkrycie se- nych aspektów potranskrypcyjnego wycisza- kwencji nukleotydowych nawet wszystkich nia genów u roślin. genów jest jedynie wstępem do określenia Efektem RNAi jest degradacja mRNA odby- funkcji, jaką pełnią produkty ich ekspresji. wająca się w cytoplazmie. Jeżeli jednak dwuni- Jedną z metod wyjaśnienia roli pełnionej przez ciowy RNA jest homologiczny do sekwencji białko jest mutageneza insercyjna, jej wadą jest promotorowej genu, wyciszanie genów może jednak czasochłonność i konieczność analizy mieć miejsce również w jądrze komórkowym. ogromnej liczby mutantów (KRYSAN i Proces ten jest wówczas definiowany jako tran- współaut. 1999). Dobrą alternatywą dla tej me- skrypcyjne wyciszanie genów (ang. transcrip- tody jest zahamowanie ekspresji genu ko- tional gene silencing, TGS) (SIJEN i KOOTER dującego badane białko i analiza spowodowa- 2000). nych tym zmian w fenotypie (KISIEL i współaut. Zainteresowanie potranskrypcyjnym wyci- 2003). Ostatnio w genomice funkcjonalnej co- szaniem genów u roślin zostało zapoczątkowa- raz częściej stosuje się wyciszanie ekspresji ne zaskakującym wynikiem transformacji petu- genu na poziomie jego transkryptu. Proces ten nii. U roślin Petunia hybrida próbowano zwię- polega na degradacji mRNA badanego genu, in- kszyć syntezę antocyjanów wprowadzając do- dukowanej przez dwuniciowy RNA (dsRNA), datkową kopię genu syntazy chalkonowej homologiczny do sekwencji tego genu. Zjawi- (PACAK i BARCISZEWSKA-PACAK 2003). Oczeki- sko to, powszechne u wszystkich eukariontów, wano, że rośliny transgeniczne będą posiadały u zwierząt znane jest jako interferencja RNA intensywnie fioletowe kwiaty. Tymczasem (RNAi), u roślin jako potranskrypcyjne wyci- transformacja wywołała efekt całkowicie od- szanie genów (PTGS), natomiast w przypadku wrotny, kolor kwiatów nie tylko nie stał się grzybów jako quelling. Coraz częściej jednak w ciemniejszy, ale otrzymane rośliny posiadały celu ujednolicenia terminologii, termin RNAi najczęściej kwiaty białe (HANNON 2002). Zaob- stosuje się do określenia wyciszania zarówno u serwowane zjawisko nazwano kosupresją, czy- 194 MARTA PAPROCKA i MAGDALENA WOAOSZYCSKA li procesem eliminacji zarówno mRNA wpro- ku transformacji, ale proces ten jest przede wadzonego genu, jak i jego endogennego od- wszystkim naturalnym mechanizmem obrony powiednika (SIJEN i KOOTER 2000, DING 2000, roślin przed wirusami i wiroidami (FAGARD i CHICAS i MACIANO 2001, SZWEJKOWSKA- VAUCHERET 2000, LINDBO i współaut. 2001, KULICSKA i wpółaut. 2003). Okazało się, że mo- VIONNET 2001). Naturalną rolą wyciszania jest lekularną podstawą kosupresji jest proces także regulacja poziomu ekspresji transpozo- RNAi. nów (BRANTL 2002, VIONNET 2002, KIDNER i Wyciszanie potranskrypcyjne zostało co MARTIENSSEN 2003). prawda odkryte u roślin otrzymanych w wyni- CZYNNIKI ODPOWIEDZIALNE ZA INDUKCJ POTRANSKRYPCYJNEGO WYCISZANIA GENÓW Sygnałem do uruchomienia wyciszania po- lub na skutek powstania dsRNA (np. w wyniku transkrypcyjnego jest dla komórki roślinnej transkrypcji odwróconych powtórzeń) (SIJEN i pojawienie się długich dwuniciowych cząste- KOOTER 2000, SCHIEBEL i współaut. 1998). czek RNA (SIJEN i KOOTER 2000, MATZKE i Bez względu na to jakie zdarzenie indukuje współaut. 2001). Cząsteczki takie mogą poja- wyciszanie genów, zawsze bierze w nim udział wiać się w komórce w wyniku zakażenia wiru- nukleaza Dicer. Jeśli wyciszanie jest inicjowa- sami (SZWEJKOWSKA-KULICSKA i wpółaut. ne bezpośrednio przez dsRNA nukleaza Dicer 2003). powoduje fragmentację tych cząsteczek na W przypadku wyciszania będącego skut- krótkie 21-22 nukleotydowe fragmenty, które kiem transformacji (kosupresja), induktorem z kolei są całkowicie degradowane przez kom- może być nie tylko dsRNA (SCHIEBEL i pleks RISC. Jeśli natomiast induktorem jest współaut. 1998, SIJEN i KOOTER 2000) . Wmo- abRNA, zbyt wysoki poziom RNA lub RNA wi- delu ilościowym rolę induktora pełni RNA zbu- rusa, aktywację nukleazy poprzedza działanie dowany prawidłowo, ale powstający w nad- polimeraz RNA generujących powstanie miernych ilościach w wyniku nadekspresji cząsteczek dwuniciowych (DING 2000, SIJEN i transgenu (ang. treshold model) (SIJEN i KOOTER 2000, LINDBO i współaut. 2001). Inter- KOOTER 2000). Wmodelu jakościowymnato- ferencja RNA stanowi zatem skomplikowaną miast, uruchomienie mechanizmu następuje odpowiedz komórkową, obejmującą liczne i na skutek obecności abRNA (ang. aberrant), nie do końca jeszcze wyjaśnione procesy. powstającego po niewłaściwej obróbce RNA MECHANIZMY INDUKCJI WYCISZANIA RNA ETAP INICJACJI INDUKCJA PRZEZ dsRNA Dicer które posiadają dwie domeny o aktywności hy- drolitycznej, N-końcową domenę typu helika- W warunkach laboratoryjnych najefektyw- zy (zależną od ATP) oraz motywy wiążące RNA niejszym sposobem potranskrypcyjnego wyci- (MOSS 2001, SHARP 2001, HANNON 2002). Nu- szania genów jest transformowanie roślin wek- kleaza Dicer rozpoznaje dwuniciowe cząstecz- torem zawierającym dwa przeciwnie zoriento- ki RNA niezależnie od ich sekwencji (SHARP wane powtórzenia transgenu rozdzielone in- 2001). Aktywny kompleks generujący powsta- tronem (WANG i WATERHOUSE 2001, SMITH i nie siRNA jest dimerem posiadającym jedynie współaut. 2000). RNA, będący produktem eks- dwa funkcjonalne centra aktywne, ponieważ presji takiej sekwencji, przyjmuje strukturę w każdym z monomerów działa tylko jedno dwuniciową. Taki transkrypt jest rozpoznawa- centrum nukleolityczne, podczas gdy drugie, ny i hydrolizowany przez specyficzny kom- zlokalizowane centralnie, ulega inaktywacji pleks nukleolityczny. Produktem trawienia (HANNON 2002) (Ryc. 1). Obecność siRNA jest dsRNA są krótkie, dwuniciowe siRNA (ang. charakterystyczna dla wszystkich przypadków small interfering RNA). Głównym składnikiem interferencji RNA, bez względu na to, czy sta- wspomnianego kompleksu jest nukleaza Dicer nowi odpowiedz na zakażenie wirusem, czy odkryta po raz pierwszy u Drosophila melano- transformację (SHARP 2001). Wśród siRNA zi- gaster (MOSS 2001, ECKARD 2002). Jest to en- dentyfikowano dwie populacje: krótsze, 21-22 zym zaliczany do rodziny rybonukleaz typu III, nukleotydowe fragmenty, którym przypisuje Potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin 195 się kluczową rolę w degradacji mRNA oraz Polimeraza cRdRP rozpoznaje jako niepra- dłuższe siRNA, zawierające od 24 do 26 nukle- widłowe zarówno cząsteczki RNA krótsze lub otydów, których rola zostanie omówiona w dłuższe od normalnego transkryptu, jak rów- dalszej części artykułu (SZWEJKOWSKA- nież RNA zmodyfikowany chemicznie (np. po- KULICSKA i wpółaut. 2003, VIONNET 2002). To przez nieprawidłową poliadenylację) (COGONI Dicer P OH ATP HO P P OH HO P OH P siRNA HO P dsRNA Ryc. 1. Degradacja dsRNA przez kompleks enzymatyczny zawierający nukleazę Dicer. Kompleks przyłącza się do dsRNA w sposób sekwencyjnie niespecyficzny. Jasnoszarym kolorem zaznaczono funkcjonalne centra aktywne w podjednostkach dimeru nukleazy Dicer. Przy udziale ATP następuje pocięcie dsRNA do siRNA. Pionowe strzałki wskazują miejsca cięcia dsRNA przez kompleks enzymatyczny. właśnie odległość między funkcjonalnymi cen- i MACINO 2000, CHICAS i MACIANO 2001, trami aktywnymi decyduje o wielkości po- MATZKE i współaut. 2001). Substratem dla tego wstających dsRNA. Charakterystyczną cechą enzymu może być także prawidłowo zbudowa- obu populacji siRNA jest obecność dwóch nie- ny mRNA, ale powstający w nadmiernej ilości, sparowanych nukleotydów na 3 końcach obu jako efekt nadekspresji genu. nici. Taka struktura umożliwia połączenie siRNA z pozostałymi składnikami kompleksu enzymatycznego odpowiedzialnego za degra- INDUKCJA PRZEZ WIRUSOWE RNA vRdRP dację mRNA w dalszym, efektorowym etapie Wspomniano wcześniej, że dwuniciowy wyciszania. RNA pochodzenia wirusowego powoduje wy- ciszanie genów. Oprócz wirusów posia- dających genom w postaci dsRNA, wyciszanie INDUKCJA PRZEZ abRNA cRdRP indukują również patogeny z genomem jedno- Zdarza się, że podczas transkrypcji, w wyni- niciowym (ssRNA) i wiroidy, u których dwuni- ku nieprawidłowej obróbki, powstaje abRNA. ciowy RNA powstaje podczas replikacji. Synte- Eliminacja takiego transkryptu przez wycisze- za tego dwuniciowego produktu pośredniego nie wymaga jego konwersji do struktury dwu- jest katalizowana przez wirusową zależną od niciowej. Obecny w komórce abRNA zostaje RNA polimerazę RNA (ang. viral RNA-depen- rozpoznany przez specyficzną, komórkową, za- dent RNA polimerase, vRdRP), kodowaną w ge- leżną od RNA, polimerazę RNA (ang. cell nomie wirusa. Dwuniciowy RNA zostaje na- RNA-dependent RNA polymerase, cRdRP). Po- stępnie rozpoznany przez komórkową nuklea- limeraza ta katalizuje syntezę niewielkich (do zę typu Dicer i ulega hydrolizie do siRNA. Ana- 100 nukleotydów) fragmentów RNA komple- logicznie jak w poprzednich przypadkach na- mentarnych do abRNA (DING 2000, SIJEN i stępuje uruchomienie kaskady reakcji pro- KOOTER 2000, CHICAS i MACIANO 2001, wadzących do degradacji jednoniciowego wi- MATZKE i współaut. 2001, HANNON 2002). Te rusowego RNA i uwolnienia rośliny od patoge- krótkie cząsteczki RNA noszą nazwę cRNA nu. (ang. complementary) (SCHIEBEL i współaut. Objawy fenotypowe potranskrypcyjnego 1998, SIJEN i KOOTER 2000, CHICAS i MACIANO wyciszenia wirusa są dość specyficzne. 2001, MATZKE i współaut. 2001, WIŚNIEWSKA i Początkowo roślina wykazuje symptomy cho- FILIPECKI 2003). AbRNA, z dobudowanymi roby spowodowane intensywną replikacją ge- cRNA, ma strukturę dwuniciową i stanowi sub- nomu wirusa w zakażonych komórkach. Jed- strat dla nukleazy Dicer, która degraduje go do nak po 7 21 dniach od zakażenia następuje za- krótkich siRNA w sposób opisany wcześniej. trzymanie tej akumulacji i roślina odzyskuje 196 MARTA PAPROCKA i MAGDALENA WOAOSZYCSKA normalny fenotyp (BAULCOMBE 1999). Praw- ciszanie potranskrypcyjne wywołane takimi dopodobnie właśnie tyle czasu potrzeba go- wirusami, jak CaMV, TBRV, TRV, PVX (MA i spodarzowi na rozpoznanie i zniszczenie pa- MITRA 2002). togenu w procesie wyciszania. Jest to natur- alny i być może jeden z najstarszych typów oporności wirusowej. Udokumentowano wy- DEGRADACJA mRNA PRZEZ RISC EFEKTOROWY ETAP WYCISZANIA GENÓW Powstałe na skutek aktywności nukleazy BA Dicer krótkie siRNA biorą następnie udział w P OH reakcjach prowadzących ostatecznie do degra- HO P NU HE dacji homologicznego mRNA. siRNA asocjują siRNA z białkiem adaptorowym, helikazą i nukleazą (CHICAS i MACIANO 2001). Powstaje w ten spo- sób rybonukleinowy kompleks wyciszający (ang. RNA-induced silencing complex, RISC), który rozpoznaje i niszczy docelowe cząsteczki mRNA. RISC Obecne w kompleksie białko adaptorowe P OH bierze prawdopodobnie udział w transferze HO P siRNA z nukleazy Dicer (CHICAS i MACIANO ATP 2001). Rolą siRNA jest kierowanie asocjacją z właściwym substratem. Uważa się, że identyfi- kacja substratu następuje przez tworzenie par typu Watsona Cricka pomiędzy siRNA a frag- RISC* mentem mRNA, ponieważ wyciszanie genu POH wymaga identyczności sekwencji siRNA i doce- lowego mRNA. Taki mechanizm zakłada ko- nieczność rozplecenia dwuniciowych siRNA przez znajdującą się w kompleksie helikazę. Aktywny RISC może wówczas asocjować z do- celowym mRNA, przy czym przecięcie mRNA POH przez nukleazę zachodzi w rejonie komple- HO P mRNA mentarnym do siRNA w miejscu odpowia- dającym środkowi siRNA (HUTVAGNER i ZAMORE 2002, WIŚNIEWSKA i FILIPECKI 2003, DEGRADACJA CULLEN 2004). Po oddysocjowaniu RISC po- wstałe dwa fragmenty mRNA są degradowane przez egzonukleazy komórkowe (CULLEN Ryc. 2. Degradacja mRNA przez RISC; do kom- 2004, HUTVAGNER i ZAMORE 2002) (Ryc. 2). pleksu nukleazy (NU), helikazy (HE) i białka ada- Jak widać, w potranskrypcyjne wyciszenie ptorowego (BA) przyłączają się siRNA, tworząc genów zaangażowanych jest wiele rozmaitych RISC. enzymów, w zależności od tego, czy indukcja Po aktywacji przez ATP cząsteczki siRNA ulegają roz- procesu zachodzi transgenicznie, czy wiruso- pleceniu, komleks asocjuje z mRNA i katalizuje jego wo. W tabeli zostały zebrane opisane enzymy hydrolizę. szlaku RNAi (Tabela 1). AMPLIFIKACJA I TRANSMISJA POTRANSKRYPCYJNEGO WYCISZANIA GENÓW Jedną z najbardziej zaskakujących obserwa- dsRNA w komórce powodują niemal 100% wy- cji dokonanych podczas badań interferencji ciszenie. Dzieje się tak, ponieważ sygnał wyci- RNA jest fakt, że nawet bardzo niewielkie ilości szania indukowany przez dsRNA może ulegać Potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin 197 amplifikacji. W opisany uprzednio sposób po- siRNA w przenoszeniu sygnału, przy czym od- jawienie się dsRNA prowadzi do powstania powiednim kandydatem do pełnienia tej funk- cząsteczek siRNA. Cząsteczki te mogą być na- cji wydają się być dłuższe, 24-26 nukleotydowe stępnie wykorzystywane nie tylko bezpośred- siRNA. Cząsteczki te są na tyle długie, aby nio do wyciszania genów, ale również mogą wiązanie z mRNA było specyficzne i jednocze- służyć jako startery dla komórkowej RdRP, któ- śnie wystarczająco krótkie, żeby móc swobod- ra katalizuje syntezę nowych dsRNA. W ten nie przechodzić przez plazmodesmy. Jednak Tabela 1. Zestawienie enzymówuczastniczących w potranskrypcyjnym wyciszeniu genów u roślin. Enzym Składniki kompleksu Funkcja Dicer dimer RNazy III rozpoznanie i trawienie dsRNA do siRNA; cRdRP komórkowa zależna od RNA po- synteza cRNA na matrycy abRNA limeraza RNA vRdRP wirusowa zależna od RNA po- synteza dsRNA na matrycy ssRNA w cyklu replik- limeraza RNA acyjnym wirusa; RISC kompleks rybonukleoproteinowy hydroliza mRNA homologicznego do siRNA (nukleaza, helikaza RNA, białko adaptorowe, siRNA) sposób pula dsRNA w komórce ulega zwielo- argumentem przeciwko udziałowi siRNA w krotnieniu. transmisji wyciszenia jest fakt, że inaktywacja Gen ulega wyciszaniu nie tylko w komór- nukleazy Dicer, generującej powstanie siRNA, kach, do których wprowadzono dsRNA, ale nie ma wpływu na przekazanie sygnału do ko- również w komórkach z nimi sąsiadujących mórek sąsiednich (CHICAS i MACIANO 2001, oraz w znacznie oddalonych (MLOTSHWA i MLOTSHWA i współaut. 2002). Efektywnym współaut. 2002, SIJEN i KOOTER 2000). Dlatego czynnikiem dyfuzyjnym mogłyby być również też zasugerowano istnienie specyficznego sys- cząsteczki cRNA powstające przy udziale poli- temu przenoszenia sygnału (transmisji) po- merazy RdRP. Za prawdziwością tego modelu przez plasmodesmy oraz floem (LINDBO i przemawia fakt, że inaktywacja polimerazy ob- wspłaut. 2001, SZWEYKOWSKA-KULICSKA i jawia się zablokowaniem transmisji (CHICAS i współaut. 2003). Zjawisko przenoszenia wyci- MACIANO 2001, MATZKE i współaut. 2001). szania na dalekie dystanse określa się jakowy- Liczne eksperymenty dowodzą istnienia w ciszanie systemiczne (ang. systemic acquired roślinach mechanizmu transportu dłuższych silensing, SAS) (SIJEN i KOOTER 2000). Jak fragmentów RNA (MLOTSHWA i współaut. wspominaliśmy, wyciszanie jest procesem bar- 2002). Rośliny wytwarzają specjalne białka dzo specyficznym. Specyficzność jest zachowa- funkcjonujące jako nośniki RNA i odpowie- na podczas transmisji systemicznej, niezale- dzialne za przenoszenie genomu wirusów mię- żnie od typu komórek. Dlatego uważa się, że dzy komórkami, dlaczego więc w analogiczny czynnikiem dyfuzyjnym może być jedynie sposób nie mogłyby być przenoszone indukto- kwas nukleinowy (MLOTSHWA i współaut. ry wyciszania? W tym przypadku ruchomym 2002). Mimo że jego struktura pozostaje nie- czynnikiem wyciszającym mógłby być nawet znana, zaproponowano kilka rodzajów cząste- abRNA, znacznie większy od wspomnianych czek RNA, które potencjalnie mogą być odpo- siRNA oraz cRNA (MLOTSHWA i współaut. wiedzialne za transmisję (MLOTSHWA i 2002). współaut. 2002). Jeden z modeli zakłada udział WIRUSOWE SUPRESORY WYCISZENIA RNA Krokiem milowym w poznaniu mechani- genów u roślin było odkrycie w 1998 roku wi- zmu i funkcji potranskrypcyjnego wyciszania rusowych białek inaktywujących interferencję 198 MARTA PAPROCKA i MAGDALENA WOAOSZYCSKA RNA (LINDBO i współaut. 2001). Istnienie su- lokalizacji jądrowej. Dlatego prawdopodobnie presorów potwierdza rolę wyciszania genów inhibicja wyciszania za pomocą Cmv2b od- jako naturalnego mechanizmu obronnego. Su- bywa się w jądrze komórkowym (MLOTSHWA i presory stanowią również cenne narzędzie w współaut. 2002, LINDBO i współaut 2001). poznaniu całego procesu interferencji RNA Trzecim typem inhibitora RNAi jest białko (LINDBO i współaut 2001). p25b z wirusa ziemniaka PVX (ang. Potato vi- Wirusowe inhibitory wyciszania można po- rus X) (CHICAS i MACIANO 2001, WAN XIANG LI i dzielić na trzy grupy w zależności od etapu, na DING 2001). Supresor ten inhibuje komór- którym hamują interferencję RNA (CHICAS i kową RdRP i hamuje wyciszanie systemiczne, MACIANO 2001, LINDBO i współaut. 2001). ale nie wpływa na wyciszanie w komórce zain- Białko HC-Pro (ang. helper component protei- fekowanej przez wirusa (CHICAS i MACIANO nase) powoduje zablokowanie akumulacji siR- 2001). NA najprawdopodobniej inhibując nukleazę W przypadku zakażeń wirusami ko- Dicer. Jednocześnie HC-Pro nie wpływa na dującymi silne supresory, po początkowej czę- produkcję czynnika dyfuzyjnego (CHICAS i ściowej eliminacji wirusa przez wyciszenie, na- MACIANO 2001, MATZKE i współaut. 2001). W stępuje uruchomienie mechanizmu obronne- efekcie dochodzi do zatrzymania wyciszania w go patogenu przed reakcją wyciszającą i do- komórce zawierającej supresor, przy zachowa- chodzi do jego ponownej akumulacji w rośli- nej zdolności do transmisji sygnału. nie. Jest to walka sił obronnych gospodarza i in- Druga grupa inhibitorów, do której zalicza truza, w której ostatecznie zwycięża ten ostat- się białko Cmv2b z wirusa CMV (ang. Cucumb- ni. Inaczej jest w przypadku słabych supreso- er mosaic virus), blokuje z kolei transport sy- rów. Nie dochodzi wówczas do akumulacji du- gnału wyciszającego do nowych tkanek. W żej liczby wirusów, ponieważ mechanizm wy- komórkach, w których proces degradacji ciszenia, chociaż osłabiony przez supresor, nie mRNA został już zaindukowany wyciszanie nie jest jednak całkowicie zahamowany. Efektyw- jest jednak zakłócane (CHICAS i MACIANO 2001, ność wyciszania jest zbyt niska aby całkowicie LINDBO i współaut. 2001). Rezultatem jest je- wyeliminować obecność patogenu (BAULCOM- dynie zanik wyciszania systemicznego. Docel- BE 1999). W rezultacie utrzymuje się stan rów- owe miejsce działania białka Cmv2b nie zo- nowagi w walce systemów obronnych rośliny i stało ustalone, jednak analiza jego sekwencji wirusa. aminokwasowej wykazała obecność sygnału BIOLOGICZNA ROLA WYCISZANIA GENÓW U ROŚLIN Mutacje w genach, których produkty są za- nieniem kwitnienia oraz stanowi przyczynę angażowane w procesie RNAi, prowadzą do nieregularnych podziałów komórkowych w znaczących defektów rozwojowych, zwłaszcza merystemach (HUTVAGNER i ZAMORE 2002, w tkankach rozrodczych (HUTVAGNER i CARRINGTON i AMBROS 2003). Ponadto ekspe- ZAMORE 2002). Dlatego też postuluje się, że rymenty wykonywane w celu poznania funkcji oprócz wspomnianej obrony przeciwwiruso- wyciszania genów u roślin dowodzą, że RNAi wej, rolą enzymów uczestniczących w interfe- może być, obok TGS, mechanizmem odpowie- rencji RNA jest również regulacja translacji. dzialnym za wyciszanie transpozonów (TE) Wykazano bowiem, że pewien specyficzny typ (OKAMOTO i HIROCHIKA 2001). Po transkrypcji cząsteczek RNA generowanych przez nukleazę transpozonów mogą bowiem powstać abRNA z rodziny Dicer może blokować translację nie- lub dsRNA (gdy TE występuje w postaci od- których transkryptów, wpływając tym samym wróconych powtórzeń), które są następnie na rozwój osobniczy zarówno u roślin, jak i u fragmentowane na siRNA. Oprócz opisanej zwierząt (VIONNET 2002, BRANTL 2002, JONES przez nas roli w kierowaniu degradacją mRNA, 2002). Przykładowo, mutacja w genie ko- siRNA służą jednocześnie jako czynniki kie- dującym nukleazę Dicer u A. thaliana objawia rujące enzymy w procesie metylacji DNA trans- się zaburzeniem rozwoju embrionów, opóz- pozonów, która powoduje inaktywację TE. Potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin 199 PERSPEKTYWY Interferencja RNA, stosowana obecnie poprzednim rozdziale, interferencja RNA pełni przede wszystkim jako szybkie i skuteczne na- istotną funkcję regulacyjną, być może w rzędzie w analizie funkcji genów, jest również przyszłości wykorzystanie RNAi pozwoli na wykorzystywana do pozyskiwania roślin od- kontrolowanie rozwoju i innych procesów za- pornych na wirusy. Wprowadzenie do rośliny chodzących w roślinach. sekwencji kodujących białka płaszcza wirusa powoduje, że komórka broni się wyciszając Dziękujemy Pani prof. dr hab. Hannie Jań- obcy RNA i nabywa tym samym odporność na skiej za poświęcony nam czas i twórczą kry- dalsze zakażenie (WIŚNIEWSKA i FILIPECKI tykę. 2003, JONES i współaut. 1998). Jak opisano w POST-TRANSCRIPTIONAL GENE SILENCING IN PLANTS S u mma r y Post-transcriptional gene silencing, also known as tion or can be involved in the systemic silencing. The RNA interference (RNAi), is a natural phenomenon mechanism of the post-transcriptional gene silencing which has been found to occur in a number of species. is complicated and involves a set of enzymes including This process is induced by double stranded RNA viral or cellular RNA-dependent RNA polymerases (dsRNA) and results in degradation of homologous catalysing production of dsRNA which is then recog- mRNA. The silencing is triggered by viral or endoge- nized by the Dicer nuclease. nous aberrant nucleic acids. Regardless the inducing The main function of post-transcriptional gene si- factor the process involves dsRNA that is recognized lencing in plants is the antiviral defense. This role of in induction step by the Dicer nuclease and cleaved to RNAi is confirmed by the fact that some viruses en- small interfering RNA (siRNA). Depending of their code RNA silencing supressors. size the siRNA molecules may drive mRNA degrada- LITERATURA BAULCOMBE D. C., 1999. Fast forward genetics based on JONES A. L., JOHANSEN I. E., BEAN S. J., BACH I., MAULE A. J., virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant 1998. Specifisity of resistance to pea seedborne Biol. 2, 109 113. mosaic potyvirus in transgenic peas expressing BRANTL S., 2002. Antisense-RNA regulation and RNA the viral replicase (Nib) gene. J. Gen. Virol. 79, interference. Biochim. Biophys. Acta 1575, 15 25. 3129 3137. CARRINGTON J. C., AMBROS V., 2003. Role of microRNAs JONES L., 2002. Revealing micro-RNAs in plants. Trends in plant and animal development. Science 301, Plant Sci. 7, 473 457. 336 338. KIDNER C. A., MARTIENSSEN R. A., 2003. Macro effects of CHICAS A., MACIANO G., 2001. Characteristic of micro RNAs in plants. Trends Genet. 19, 13 16. post-transcriptional gene silencing. EMBO Rep. 2, KISIEL A., PODKOWICSKI J., FIGLEROWICZ M., 2003. RNAi 992 996. jako narzędzie w genomice funkcjonalnej. Bio- COGONI C., MACINO G., 2000. Post-transcriptional gene technologia 2, 104 119. silencing across kingdoms. Curr. Opin. Genet. KRYSAN P. J., YOUNG J. C., SUSSMAN M. R., 1999. T-DNA as Dev. 10, 638 643. an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell CULLEN B. R., 2004. Derivation and function of small 11, 2283 2290. interfering RNAs and microRNAs. Virus Res. 102, KUSABA M., 2004. RNA interference in crop plants. 3 9. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 139 143. DING S. W., 2000. RNA silencing. Curr. Opin. Biotech- LINDBO J. A., FITZMAURICE W. P., DELLA-CIOPPA G., 2001. nol. 11, 152 156. Virus-mediated reprogramming of gene ECKARD N. A., 2002. RNA goes mobile. Plant Cell, 14, expression in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 1433 1436. 181 185. FAGARD M., VAUCHERET H., 2000. (Trans) Gene silencing MA C., MITRA A., 2002. Intrinsic direct repeats genegate in plants: how many mechanisms? Annu. Rev. consistent post-transcriptional gene silencing in Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51, 167 194. tobacco. Plant J. 31, 37 49. HANNON G. J., 2002. RNA interference. Nature 418, MATZKE M. A., MATZKE A. J. M., PRUSS G. J., VANCE V. B., 244 251. 2001. RNA-based silencing strategies in plants. HUTVAGNER G., ZAMORE P. D., 2002. RNAi: nature Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 221 227. abhors a double-strand. Curr. Opin. Genet. Dev. MLOTSHWA S., VIONNET O., METTE M. F., MATZKE M., 12, 225 232 VAUCHERET H. DING S. W., PRUSS G., VANCE V. B., 200 MARTA PAPROCKA i MAGDALENA WOAOSZYCSKA 2002. RNA silencing and the mobile silencing si- cing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407 gnal. Plant Cell 14, 289 300. 319 320. MOSS E. G., 2001. RNA interference: It s small RNA SZWEYKOWSKA-KULICSKA Z., JARMAOWSKI A., FIGLEROWICZ world. Curr. Biol. 11, R772 R775. M., 2003. RNAi, PTGS i quelling trzy wariacje na OKAMOTO H., HIROCHIKA H., 2001. Silencing of transpo- jeden temat? Biotechnologia 2, 54 66. sable elements in plants. Trends Plant Sci. 6, VIONNET O., 2001. RNA silencing as plant immune sys- 527 534. tem against viruses. Trends Genet. 17, 449 459. PACAK A., BARCISZEWSKA-PACAK M., 2003. Zależne od VIONNET O., 2002. RNAsilencing: small RNAsasubiqu- RNA potranskypcyjne i transkrypcyjne wycisza- itous regulators of gene expression. Curr. Opin. nie genów u roślin. Biotechnologia 2, 67 83. Plant Biol. 5, 444 451. SCHIEBEL W., PELISSIER T., RIEDEL L., THALMEIR S., SCHIEBEL WAN XIANG LI, DING S. W., 2001. Viral suppresors of R., KEMPE D., LOTTSPEICH F., SANGER H. L., RNA silencing. Curr. Opin. Biotechnol. 12, WASSENEGGER M. 1998. Isolation of an RNA-direc- 150 154. ted rna polymerase-specific cDNA clone from to- WANG M. -B., WATERHOUSE P. M., 2001. Application of mato. The Plant Cell 10, 2087 2101. gene silencing in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 5, SHARP P. A., 2001. RNA interference 2001. Genes and 146 150. Development 15, 485 490. WIŚNIEWSKA A., FILIPECKI M., 2003. Wyciszanie genów SIJEN T., KOOTER M., 2000. Post-transcriptional gene- si- jako strategia badania ich funkcji w roślinach. lencing: RNAs on the attack or on the defense? Bio- Post. Biol. Kom. 30, 339 358. Essays 22, 520 531. SMITH N. A., SINGH S. P., WANG M. -B., STOUTJESDIJK P. A., GREEN A. G., WATERHOUSE P. M., 2000. Total silen-