Endonukleazy restrykcyjne
 molekularne nożyczki
Inżynieria genetyczna  nauka o technikach
badawczych pozwalających na ingerencję w materiał
genetyczny organizmów w celu wyizolowania i charakterystyki
określonych genów oraz zmiany ich właściwości dziedzicznych
Dzięki technikom inżynierii genetycznej możemy :
" izolować z komórki fragmenty materiału genetycznego (geny)
" powielać geny (klonowanie molekularne)
" wprowadzać zmiany do informacji genetycznej
" przenosić fragmenty DNA (geny) do komórek innego organizmu
Nie należy utożsamiać inżynierii genetycznej z biotechnologią
Biotechnologia to pojęcie szersze, obejmujące wszelkie manipulacje żywymi
organizmami (zwłaszcza mikroorganizmami) w celu osiągnięcia określonych
korzyści.
Inżynieria genetyczna istnieje od ok. 40 lat, biotechnologia od niepamiętnych
czasów
Współczesna biotechnologia opiera się w dużej mierze na
technikach inżynierii genetycznej. Dzięki nim możliwa jest:
" heterologiczna ekspresja genów kodujących określone białka
" zmiana (optymalizowanie) poziomu ekspresji konkretnego genu
" wprowadzanie celowych zmian sekwencji nukleotydowych powodujących
zmiany aminokwasów a co za tym idzie modyfikacje właściwości białka ,
często ulepszenie funkcjonowania
" transgeneza bakterii, roślin i zwierząt  organizmy genetycznie
zmodyfikowane (GMO)
" terapia genowej
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja
zrekombinowanej insuliny w bakteriach
Transformation
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie
narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw.
zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację
materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce).
Najważniejsze z nich to:
" enzymy restrykcyjne,
" ligazy,
" wektory
Klonowanie genu
ludzkiej insuliny i
produkcja
zrekombinowanej
insuliny w bakteriach
1. Wszelkie zabiegi na
materiale genetycznym
muszą rozpocząć się od
jego wyizolowania z
komórki.
2. Cząsteczki DNA są
następnie dzielone na
mniejsze fragmenty za
pomocą enzymów
restrykcyjnych
Enzymy restrykcyjne jako narzędzie w
inżynierii genetycznej i biologii molekularnej
Enzymy restrykcyjne (ER)
" pod względem biochemicznym to endonukleazy   przecinają szkielet
cukier-fosforan w DNA
" ER działają na określone sekwencje w DNA (miejsce rozpoznania): żeby
strawić DNA enzym restrykcyjny musi  zobaczyć określony ciąg liter
Enzym Pochodzenie Miejsce trawienia
5' -->3'
Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G
Nazewnictwo (Smith i
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Nathans)
Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Nazewnictwo enzymów
Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G
restrykcyjnych opiera się na
Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C
literowych skrótach, w
Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C
których pierwsza litera
Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T
pochodzi od rodzaju bakterii,
Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C
a druga i trzecia od gatunku.
Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C
Następna litera oznacza
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
szczep lub typ, a kolejne
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
enzymy z danego typu lub
Pst I Providencia stuartii C T G C A * G
szczepu otrzymują liczby
Sma I Serratia marcescens C C C * G G G
rzymskie.
SstI Streptomyces stanford G A G C T * C
Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C
Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A
Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G
" Podział enzymów restrykcyjnych na klasy I, II i III
" Główne różnice pomiędzy klasami enzymów ER
dotyczą:
" wzajemnej lokalizacji systemu restrykcji i metylacji DNA
" W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu
enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych
podjednostek, w II są rozdzielone
" lokalizacji miejsca trawienia względem miejsca rozpoznania DNA
" Enzymy poszczególnych klas różnią się także wymaganiami co do
kofaktorów
Endonukleazy restrykcyjne I klasy
" Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku
" Substratem jest dwuniciowy DNA (dsDNA) zawierający określoną
sekwencję  miejsce rozpoznania
Enzymy klasy I rozpoznają taką sekwencję
Przykłady enzymów I klasy:
CfrA1 GCANNNNNNNNGTGG
EcoAI GAGNNNNNNNGTCA
EcoBI TGANNNNNNNNTGCT
EcoKI AACNNNNNNGTGC
Ogólnie: 3 nt/6-8 N/4-5 nt - sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna
" przecinają obydwie nici w pewnej odległości (kilkadziesiąt-kilkaset pz) od
rozpoznanej sekwencji
Do swojej aktywności wymagają S-adenozylo-metioniny (SAM), Mg+2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne III klasy
" Substratem jest dsDNA
" Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku
" Rozpoznają asymetryczne miejsca 5-7 nukleotydowe:
EcoP I AGACC
EcoP 15I CAGCAG
Hinf III CGAAT
przecinają DNA w odległości 24-26 nt od miejsca rozpoznania
" Wymagają do działania jonów Mg+2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne II klasy
" Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy,
ich geny zwykle sąsiadują w genomie
" Substratem jest dwuniciowe DNA - dsDNA (nieliczne
enzymy mogą przecinać określone sekwencje w
jednoniciowym ssDNA).
" W większości przypadków enzymy typu II trawią obydwa
pasma DNA w obrębie miejsca rozpoznania - krótkiej
sekwencji (4 -12 nukleotydów)
Większość enzymów restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego DNA na
jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpoznania, choć nieliczne wymagają
metylacji
" do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jonów magenzu
Właściwości miejsca rozpoznania ER klasy II
" Większość miejsc rozpoznania jest ścisłym palindromem z symetrią
rotacyjną
" ma długość 4, 5, 6, 7, 8 nt
" Niekiedy palindrom może być przerwany przez serie 1-9 dowolnych nt
np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC
Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje częstość trawienia DNA
np.: (zakładając że G+C = 50%)
enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok. 65 kpz (służą np. do
konstrukcji bibliotek genomowych)
z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (46) (wygodne do
klonowania genów)
4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 256 bp (44)
(tworzenie tzw. odcisków palca DNA  fingerpinting)
Enzymy rzadkotnące:
" Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.:
SapI 5 - GCTCTTC -3
Sgf1 5 - GCGATCGC -3
" Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT
SmaI rozpoznaje 5  CCCGGG -3 , trawi co 78 kb;
NotI rozpoznaje 5  GCGGCCGC  3 , trawi co 10 MB.
Niektóre enzymy pochodzące
z różnych bakterii rozpoznają
identyczne sekwencje, są to
tzw. izoschizomery i
mogą przecinać te sekwencje
w dokładnie taki sam sposób
Neoizoschizomery  enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale
przecinające ją w inny sposób.
Przykłady:
SmaI 5 & CCCź%GGG& 3
XmaI 5 & Cź%CCGGG& 3
SacI 5 & GAGCTź%C& 3
SstI 5 & GAGCTź%C& 3
EcoICRI 5 & GAGź%CTC& 3
Ecl136 5 & GAGź%CTC& 3
Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy wolne
końce DNA
Lepkie końce mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale
mogą być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5 lub 3 ,
w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego.
Mogą też tworzyć tępe końce
Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5 - fosforanem lub
3  OH (wyjątek np. Nci I tworzy końce: 3 -fosforan i 5 -OH)
Jeśli lepkie końce są komplementarne, ligaza może je bardzo łatwo połączyć
niezależnie od pochodzenia DNA, tworząc formy rekombinacyjne
Możemy łączyć ze sobą również końce tępe ale jest to trochę trudniejsze
zrekombinowane DNA
Użycie ER in vitro
Czynniki wpływające na aktywność enzymów restrykcyjnych
Skład buforu:
" Enzymy mają różne preferencje jeśli chodzi o siłę jonową (stęż. soli) i kationy (Na lub K).
Zwykle pracują w pH 8.0. Bufory są zwykle dostarczane razem z enzymem przez
producenta. y
le dobrany bufor powoduje albo brak trawienia albo tzw. częściowe trawienie.
" można trawić równocześnie kilkoma enzymami dobierając pośrednie warunki reakcji
Bufor do przechowywania:
Tris-EDTA, EDTA jest inhibitorem działania enzymów restrykcyjnych, ale nie w stężeniach
poniżej 0,05 mM
Temperatura inkubacji;
Większość enzymów pracuje w 37 C. Enzymy izolowane z termofilnych bakterii tną DNA w
temp. 50  65 C, inne z bakterii psychrofilnych, ze względu na krótki okres półtrwania, w
temp. 25 C.
Jednostka aktywności
Ilość enzymu potrzebna to strawienia 1źg DNA faga l� w 60 min, w odpowiedniej temp., w
objętości 50 źl
Na wydajność trawienia duży wpływ ma czystość DNA:
kontaminacje solami (np. z innych buforów  ważne przy wielokrotnych trawieniach),
inhibitory, nukleazy mogą powodować trawienie częściowe lub jego kompletny brak
DNA
Rodzaj użytego DNA
" Oligonukleotydy i produkty PCR
" Plazmidowe i fagowe DNA
" Genomowe DNA (w roztworze)
" Genomowe DNA w postaci bloczków agarozowych (więcej enzymu, dłuższa
inkubacja)
Aktywność gwiaz
dzista (star activity, relaxation of specificity)
Enzym w niestandardowych warunkach tnie DNA w miejscach innych niż
miejsce rozpoznania, np.
BamHI (GGATCC) może trawić sekwencje: NGATCC, GPuATCC, GGNTCC
Niestandardowe warunki to:
ż� zbyt długa inkubacja
ż� bardzo wysokie stęż. enzymu
ż�wysokie pH lub niska siła jonowa,
ż� za wysokie stęż. glicerolu,
ż� obecność rozpuszczalników organicznych w reakcji (etanol, DMSO)
ż� zastąpienie jonów Mg innymi dwuwartościowymi kationami jak Mn lub Co
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych
1. Izolacja wybranych fragmentów DNA (np. genów)
2. Rekombinowanie DNA in vitro i klonowanie genów
3. Mapowanie fizyczne genomów
4. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np.
ustalanie pokrewieństwa