Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 1 -

Ćwiczenie 2

Temat: Wpływ czynników fizyko-chemicznych na drobnoustroje

Temperatura jako czynnik wzrostowy

Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników warunkujących wzrost i procesy
życiowe drobnoustrojów. Działanie na mikroorganizmy może mieć charakter bezpośredni:
wpływając na szybkość wzrostu, aktywność enzymów, skład chemiczny komórek,
wymagania

pokarmowe,

lub

pośredni

regulując

rozpuszczalność

związków

wewnątrzkomórkowych, transport jonów, dyfuzję substancji chemicznych i zmianę
właściwości osmotycznych błon komórkowych.
Każdy gatunek mikroorganizmów charakteryzuje się trzema kardynalnymi temperaturami
rozwoju: minimalną, optymalną i

maksymalną. W temperaturze optymalnej

mikroorganizmy rozwijają się najszybciej, natomiast powyżej temperatury maksymalnej
i poniżej temperatury minimalnej wzrost mikroorganizmów jest niemożliwy.
Drobnoustroje ze względu na wymagania temperaturowe można podzielić na 4 grupy:
termofile, mezofile, psychrofile, psychrotrofy (Rys. 1).

Rysunek 1 – Zakres temperaturowy wzrostu drobnoustrojów.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 2 -

1. Drobnoustroje termofilne (termofile - ciepłolubne) – to mikroorganizmy

charakteryzujące się wysoką optymalną temperaturą wzrostu w granicach 45-50ºC,
a niekiedy nawet wyższej od 60ºC. Większość termofili to bakterie gram-dodatnie
przetrwalnikujące np. Geobacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans –
przetrwalniki tych bakterii wyróżniają się wysoką ciepłoodpornością i wyznaczają
parametry sterylizacji konserw produkowanych do krajów z ciepłej i gorącej strefy
klimatycznej. Do drobnoustrojów termofilnych należą również niektóre gatunki
bakterii fermentacji mlekowej, np. Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
stosowany w przemysłowej produkcji kwasu mlekowego oraz Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus wchodzące w skład
zakwasów

jogurtowych,

a

także

bakterie

stosowane

w

produkcji

wysokodogrzewanych serów dojrzewających.

2. Drobnoustroje mezofile (mezofile – obojętnolubne) – to drobnoustroje rozwijające

się w temperaturach umiarkowanych. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się
zazwyczaj w zakresie od 20 do 45ºC. Wśród mezofili wyróżniamy organizmy
saprofityczne i większość gatunków chorobotwórczych dla człowieka np.
Salmonella sp., Staphylococcus aureus.

3. Drobnoustroje psychrofilne (psychrofile – zimnolubne) – to mikroorganizmy

rosnące już w temperaturach od 0ºC, o temperaturze optymalnej nie wyższej niż 15ºC
i maksymalnej - 20ºC. Wzrost mikroorganizmów psychrofilnych w niskich
temperaturach jest uwarunkowany aktywnością enzymów katalizujących reakcje
metaboliczne w tych temperaturach. Psychrofile znalazły dobre warunki do rozwoju
w regionach podbiegunowych, szczytach gór, jeziorach, morzach i oceanach strefy
umiarkowanej. Do tej grupy mikroorganizmów zaliczamy gatunki bakterii należące
do rodzajów: Alcaligenes, Bacillus, Psudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter.

4. Drobnoustroje psychrotrofowe (psychrotrofy) to mikroorganizmy, które bez

względu na swoje temperatury kardynalne posiadają zdolność rozwoju
w temperaturze ≤7ºC. Do psychrotrofów zaliczamy wszystkie psychrofile i część
mezofili.

W przemyśle spożywczym mikroorganizmy o niskich temperaturach wzrostu stanowią

istotny problem w przechowalnictwie żywności. Psychrofile spotykane są najczęściej
w produktach żywnościowych pochodzenia morskiego, natomiast psychrotrofy – w nabiale,
wędlinach, warzywach i owocach. Szczególne niebezpieczeństwo zatruć pokarmowych
stwarzają patogenne psychrotrofy: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus
cereus.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 3 -

Temperatura jako czynnik zabójczy

W temperaturze przekraczającej maksymalną temperaturę wzrostu drobnoustrojów

następuje ich termiczna inaktywacja. Pod wpływem ogrzewania zachodzi mechanizm
śmierci cieplnej drobnoustrojów. Prowadzi on do powstania letalnych, nieodwracalnych
zmian w komórce. Zniszczeniu ulega głównie struktura przestrzenna białek komórkowych
oraz kwasów nukleinowych (DNA, RNA). Wzrost temperatury prowadzi również do
obniżenia aktywności, dezaktywacji enzymów podtrzymujących metabolizm komórki,
a następnie zahamowania przemian wewnątrzkomórkowych. Wysoka temperatura uszkadza
funkcjonowanie błony cytoplazmatycznej, która staje się przepuszczalna dla białek, kwasów
nukleinowych i innych substancji wewnątrzkomórkowych. Ze względu na specyficzną
oporność mikroorganizmów na działanie wysokiej temperatury wyróżnia się mikroorganizmy
ciepłooporne i ciepłowrażliwe. Najbardziej ciepłooporną grupą mikroorganizmów są formy
przetrwalne (spory) laseczek z rodzaju Bacillus i Clostridium. Mniejszą ciepłoopornością
w porównaniu z przetrwalnikami wykazują komórki wegetatywne (rys. 2).

Ciepłooporne

Bakterie przetrwalnikujące
Formy przetrwalne (spory)

Ciepłowrażliwe

Bakterie nie-

przetrwalnikujące

Komórki wegetatywne

Mikroorganizmy

Rysunek 2 – Podział mikroorganizmów na bakterie ciepłooporne i ciepłowrażliwe.

Pasteryzacja może być jest stosowana w mikrobiologii do badania zdolności
przetrwalnikowania

(pasteryzacja 80ºC przez 10 min) oraz ciepłooporności

mikroorganizmów (pasteryzacja 63,5ºC przez 30 min). Działanie temperatury 80ºC przez 10
min ma charakter letalny w stosunku do komórek wegetatywnych, oporne są tylko
przetrwalniki bakterii z rodzajów Bacillus i Clostridium. Działanie temperatury 63,5ºC przez
30 min przetrzymują tzw. bakterie ciepłooporne np. komórki wegetatywne Enterococcus,
Corynebacterium, Micrococcus oraz przetrwalniki Bacillus i Clostridium.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 4 -

Stężenie jonów wodorowych (pH) środowiska

Drobnoustroje posiadają zdolność wzrostu i spełniania swoich funkcji życiowych tylko
w określonym zakresie wartości pH środowiska. Przedział pH, w którym mogą się rozwijać,
wyznaczają wartości minimalne i maksymalne, natomiast wartość pH, przy której szybkość
wzrostu jest najwyższa, nazywamy optymalną.

Drobnoustroje acydofilne (acydofile, kwasolubne) - charakteryzujące się zdolnością
wzrostu w środowisku przy niskiej wartości pH (pH < 4.0), Ich optymalny wzrost obserwuje
się w zakresie pH od 2.0 do 5.0. Do typowej mikroflory acydofilnej zaliczamy m.in. bakterie
fermentacji mlekowej (do pH =3.5), bakterie octowe, a także termoacydofilne bakterie
należące do rodzaju Alicyclobacillus (ich wzrost odnotowano w pasteryzowanych sokach
owocowych). Wśród acydofili występują liczne gatunki drożdży i grzybów strzępkowych,
np. gatunki należące do rodzajów: Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium.
Drobnoustroje neutrofile (neutrofile, obojętnolubne) – odznaczające się optymalnym
wzrostem w środowisku o pH bliskim obojętnemu (pH 6.0-7.5). Większość bakterii należy
do tej grupy drobnoustrojów.

Drobnoustroje alkalifilne (alkalifile, zasadolubne) – mikroorganizmy, których wzrost
występuje w środowiskach alkalicznych o pH > 9.0, o optymalnej dla wzrostu wartości pH
od 8.0 do 11.0. Do alkalifili zaliczamy m.in. Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery),
Streptococcus pneumoniae (paciorkowiec zapalenia płuc), bakterie nitryfikacyjne z rodzajów
Nitrosomonas i Nitrobacter oraz Enterococcus faecalis, wybrane gatunki Bacillus sp.


Aktywność wody w środowisku (a

w

)

Wzrost mikroorganizmów jest możliwy tylko w obecności wody. Do określenia
zapotrzebowania na wodę drobnoustrojów przyjęto termin aktywność wody w środowisku
(a

w

). Czysta chemicznie woda ma aktywność wody równą 1, ze wzrostem stężenia związków

rozpuszczalnych a

w

maleje poniżej tej wartości. Aktywność wody, przy której szybkość

wzrostu mikroorganizmów jest najwyższa nazywany optymalną. Spadek a

w

poniżej wartości

optymalnej powoduje spowolnienie wzrostu i wydłużenie fazy adaptacyjnej. A

w

, poniżej

której zostaje zahamowany wzrost drobnoustrojów, nazywamy minimalną.
Dla większości bakterii optymalna wartość a

w

mieści się w zakresie 0.96-0.99. Najniższą a

w

,

przy której stwierdzono wzrost bakterii to 0.75. Są to organizmy halofilne, które wykazują
wyraźne zapotrzebowanie na NaCl np. Vibio, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus.
Grzyby w porównaniu z bakteriami mogą rozwijać się przy niższych wartościach a

w

, grzyby

strzępkowe między 0.91-0.80, drożdże do a

w

=0.88. Stwierdzono jednak wzrost kserofilnych

grzybów strzępkowych przy a

w

=0.65 (Rys. 3).

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 5 -

Rysunek 3 – Aktywność wody (a

w

) a wzrost różnych grup drobnoustrojów.

Promieniowanie UV

W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie
na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długości fali 250-260 nm,
a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowane przez kwasy nukleinowe (DNA,
RNA). Promieniowanie UV jest wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów
występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń o
niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów i chłodni, laboratoriów). Najbardziej efektywnie
działa promieniowanie o długości fali 260 nm, które jest pochłaniane przez zasady purynowe
i pirymidynowe oraz promieniowanie o długości fali 280 nm - pochłaniane przez
aminokwasy aromatyczne (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina). Następuje również
unieczynnienie enzymów, surowic i toksyn.

Czynniki chemiczne
Środki dezynfekcyjne - Patrz chemiczne metody wyjaławiania (patrz:

ćwiczenie 1 –

przewodnik dla studentów studiów stacjonarnych

).

Obowiązuje również treść przewodnika do ćwiczenia 4 i 5 dla studentów studiów
stacjonarnych.

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 6 -

1. Posiewy celem wyizolowania z materiału Escherichia coli, Enterococcus faecalis,

Saccharomyces cerevisiae

Materiał stanowią 3 kultury A, B i C – każde stanowisko bada jedną kulturę.

Posiewy wykonać do następujących podłóż:

Kultura A

bulion z glukozą – posiew ezą,

agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,

YGC-agar – posiew metodą izolacyjną,

inkubacja w temp. 25ºC przez 96 godzin.

Kultura B

pożywka z żółcią, zielenią brylantową, laktozą i rurką Dürhama – posiew ezą,

agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,

podłoże VRBL-agar – posiew metodą izolacyjną,

inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin.

Kultura C

pożywka wg Burzyńskiej z azydkiem sodu, glukozą, fioletem krystalicznym
i purpurą bromokrezolową – posiew ezą,

agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,

podłoże Slanetza i Bartleya – posiew metodą izolacyjną,

inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin.

2. Badanie stosunku do tlenu szczepów

Materiał stanowią 3 szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium

butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.

posiew metodą kłutą hodowli do słupka bulion agar bez glukozy

3. Badanie właściwości gazotwórczych szczepów

Materiał stanowią 3 szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium

butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.

posiew 1 cm

3

hodowli do upłynnionego słupka bulion agar z glukozą

4. Badanie oddziaływania wybranych środków chemicznych na wzrost drobnoustrojów

Zaobserwować oddziaływanie hamujące/stymulujące lub brak oddziaływania wybranych

środków chemicznych na szczepy: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 7 -

i Candida lipolytica w posiewach metodą powierzchniową z zastosowaniem metody

dyfuzyjno-krążkowej. Wyniki zestawić w tabeli 1.

Tabela 1

Szczep

środek

dezynfekcyjny

nadtlenek

wodoru

kwas

mlekowy

kwas

octowy

alkohol

etylowy

Escherichia coli

Enterococcus
faecalis

Bacillus subtilis

Candida lipolytica

5. Badanie wrażliwości szczepów na antybiotyki

Zaobserwować stopień wrażliwości szczepów badanych na wybrane antybiotyki (metoda

dyfuzyjno-krążkowa). Wyniki zestawić w tabeli 2.

Tabela 2

Szczep

Średnice stref zahamowania wzrostu [mm]

dla poszczególnych antybiotyków

penicylina

Escherichia coli

Enterococcus
faecalis

Bacillus subtilis

Candida lipolytica

6. Badanie oddziaływania pH środowiska i temperatury na wzrost drobnoustrojów

Wykonać posiewy badanych szczepów oczkiem ezy do bulionu z glukozą (każde stanowisko

bada jeden szczep):

o pH 7,0 – próba kontrolna; inkubacja w temp. optymalnej
o pH 4,5 i 9,6 – badanie oddziaływania pH środowiska na wzrost szczepów; inkubacja

w temp. optymalnej

o pH 7,0 – następnie spasteryzować w temp. 63,5ºC przez 30 min + 5 min na ogrzanie;

inkubacja w temp. optymalnej

o pH 7,0 – następnie spasteryzować w temp. 80ºC przez 10 min + 5 min na ogrzanie;

inkubacja w temp. optymalnej

o pH 7,0; inkubacja w temp. 7 ºC

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 8 -

Warunki inkubacji badanych na ćwiczeniach szczepów:

Pseudomonas fluorescens - 30ºC przez 48 godzin,
Escherichia coli - 37ºC przez 48 godzin,
Clostridium butyricum - 37ºC przez 48 godzin,
Enterococcus faecalis - 37ºC przez 48 godzin,
Bacillus subtilis - 30ºC przez 48 godzin,
Candida lipolytica - 25ºC przez 96 godzin.

7. Poprawa kolokwium 1

Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Zjazd 2

Copyright

©2011 - Mikš-Krajnik M.

- 9 -

Odczyty na ćwiczeniu 3

1. Odczytać wyniki posiewów, zestawić je w tabelach i zinterpretować

Tabela 1

Kultura

bulion

z

glukozą

pożywka

z żółcią,

laktozą

i zielenią

brylantową

pożywka

wg

Burzyńskiej

agar

odżywczy

YGC-

agar

VRBL-

agar

podłoże

Slanetz’a

A

B

C

Tabela 2

Szczep

Właściwości gazotwórcze

Stosunek do tlenu

Pseudomonas fluorescens

Escherichia coli

Clostridium butyricum

Tabela 3

Szczep

Wzrost po pasteryzacji

wzrost

w temp.

7ºC

Wzrost w pH

63,5ºC/30min. 80ºC/10min.

7,0

4,5

9,6

Escherichia coli

Enterococcus faecalis

Bacillus subtilis

Candida lipolytica