Techniki mikroskopowe.
1.
Budowa mikroskopu.
2.
Podstawowe pojęcia w mikroskopii
3.
Mikroskop
jasnego pola
ciemnego pola
kontrastowo-fazowy
fluorescencyjny
4.
Preparat przyżyciowy
5.
Preparat utrwalony
1. Budowa mikroskopu jasnego pola
elementy mechaniczne: statyw, rewolwer, tubus, stolik przedmiotowy, przysłona żarówki, głowica binokularowa, śruby ogniskowania (mikrometryczna i makrometryczna), pokrętła kondensora (posuw pionowy i przesuwy XY)
elementy optyczne: układ oświetleniowy, przysłona aperturowa, , okular, obiektyw, kondensor 2. Podstawowe pojęcia w mikroskopii
a) powiększenie mikroskopu – stosunek wielkości obrazu pozornego A’’, widocznego w mikroskopie do obrazu rzeczywistego A. Wartość powiększenia to wypadkowa (iloczyn) powiększenia okularu i obiektywu oraz długości tubusa.
b) zdolność rozdzielcza – minimalna odległość pomiędzy dwoma punktami, przy której widać je jeszcze jako oddzielne. Wartość ta jest charakterystyczna dla danego układu optycznego. Im mniejsza wartość zdolności rozdzielczej tym dokładniejszy obraz.
Uproszczony wzór na zdolność rozdzielczą:
d = λ/NA
d = zdolność rozdzielcza
λ = długość fali świetlnej
NA = apertura numeryczna (liczbowa) obiektywu
c) apertura numeryczna – zdolność układu optycznego do przyjmowania strumieni światła NA = n × sin.u
sin.u = sinus połowy kąta aperturowego
n – współczynnik załamania światła w środowisku pomiędzy preparatem, a obiektywem d) kąt aperturowy – kąt zawarty pomiędzy skrajnymi promieniami światła biegnącymi od obiektu do soczewki obiektywu. Teoretycznie maksymalna wartość może mieć 180°, w praktyce tylko 143°36’.
Wtedy wartość apertury numerycznej wynosi maksymalnie 0,95.
3. Możliwości polepszenia rozdzielczości
Im mniejsza wartość zdolności rozdzielczej tym lepiej (dwa punkty rozróżniane już przy niewielkich odległościach). Tak więc na podstawie poniższego wzoru, w celu polepszenia zdolności rozdzielczej układu optycznego należy obniżyć licznik i powiększyć mianownik:
d = λ↓/NA↑
W praktyce można to osiągnąć poprzez:
a) zmniejszenie długości fali świetlnej – zmiana filtru zółtozielonego na niebieski (rozdzielczość z 0,2
µm poprawia się na 0,17µm przy ustalonej aperturze o wartości NA =1,3) lub zastosowanie światła UV i obiektywu kwarcowego (rozdzielczość 0,1 µm)
b) zwiększenie współczynnika załamania światła poprzez zastosowanie immersji (rodzaje immersji –
woda, glicerol, olejek cedrowy). Substancje immersyjne mają wyższy współczynnik załamania światła od powietrza.
................
Kąt aperturowy zależy od parametrów technicznych zastosowanego układu optycznego (tutaj mikroskopu) i nie ma możliwości jego polepszenia.
4. Mikroskop ciemnego pola
Budową przypomina zwyczajny mikroskop jasnego pola. Ma jednak zamontowany specjalny element: kondensor ciemnego pola z przysłoną.
Do przesłony kondensora docierają promienie równoległe, biegnące od źródła światła. Budowa przesłony pozwala na docieranie do preparatu tylko tym promieniom, które zostały odchylone. Jeżeli taki odchylony promień trafi na obiekt biologiczny ulega załamaniu i wpada do obiektywu. Jeżeli promień nie natrafi na obiekt biologiczny to nie zostanie skierowany do obiektywu. W ten sposób widoczne dla obserwatora mogą być tylko biologiczne obiekty w postaci jasnych elementów na ciemnym tle.
Rys.
W trakcie korzystania z mikroskopu ciemnego pola niezbędne jest zastosowanie odpowiedniej immersji.
Substancję immersyjną umieszczamy nie tak jak w przypadku klasycznych mikroskopów jasnego pola pomiędzy preparatem, a obiektywem ale pomiędzy kondensorem, a preparatem.
Zdolność rozdzielcza mikroskopu ciemnego pola jest podobna do rozdzielczości mikroskopu jasnego pola.
Zastosowanie mikroskopu ciemnego pola: obserwacja żywych organizmów (m.in. bakterii)
5. Mikroskop kontrastowo – fazowy
a) Specjalne elementy budowy:
pierścień fazowy w kondensorze (służy do kierowania promieni świetlnych pod odpowiednim kątem na preparat)
Obiektyw z płytką fazową napyloną węglem
b) Obiekty amplitudowe – obiekty, które zmieniają amplitudę przechodzącej przez nie fali świetlnej czyli jej natężenie. Zmiana ta jest widoczna dla oka ludzkiego.
Obiekty fazowe to takie, które nie powodują zmiany amplitudy fali przez nie przechodzącej, a jedynie zmieniają jej fazę . Oko ludzkie nie jest w stanie zarejestrować różnicy.
c) Promień, który napotkał obiekt biologiczny zostaje poddany przesunięciu fazowemu o ¼ dł. fali. W
wyniku tej zmiany długości fali następuje zmiana kąta załamania i promień wpada do obiektywu w miejsce nienapylone na płytce fazowej. Promienie nie przechodzące przez obiekty biologiczne kierują się do obiektywu w miejsce napylone płytki fazowej i dzięki niej również zostaje przesunięta ich faza o ¼ dł fali. Ponadto przejście przez napylone miejsce w płytce fazowej powoduje zagięcie fali świetlnej i może ona napotkać promień światła, który biegł od obiektu biologicznego. Jeżeli zetkną się takie dwie fale o tej samej fazie następuje ich interferencja (wzmocnienie) i zmienia sie amplituda fali co skutkuje tym, że oko ludzkie ma możliwość zarejestrowania tej zmiany.
Rys.
6. Mikroskop fluorescencyjny
a) Źródłem światła jest lampa rtęciowa. Światło UV nie tworzy obrazu, a jedynie dostarcza energii i wzbudza fluorescencję.
Filtry wzbudzające – formują wiązkę promieni UV
Filtry zaporowe (odcinające) – chronią ludzkie oko przed wpływem światła UV
b) fluorescencja naturalna: chlorofil, witamina A
fluorescencja wtórna: oranż akrydyny
c) wykorzystanie mikroskopu fluorescencyjnego w mikrobiologii
ocena żywotności hodowli
ocena fazy wzrostu hodowli (lag, log, stationary, death)
d) oranż akrydyny – barwnik wiążący się głównie z kw. nukleinowymi. Żywa komórka nie wybarwia się oranżem akrydyny.
7. Przygotowanie preparatu przyżyciowego i utrwalonego
W każdym przypadku czynności wykonujemy w warunkach jałowych (w pobliżu palnika lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza)
Preparaty przyżyciowe:
a) odtłuszczamy szkiełko w płomieniu palnika
b) nanosimy na szkiełko kroplę z hodowli płynnej lub kroplę NaCl 0,89% i 1 kolonię z hodowli stałej
c) przykrywamy szkiełkiem nakrywkowym
Preparaty utrwalone
a) odtłuszczamy szkiełko w płomieniu palnika
b) nanosimy na szkiełko kroplę z hodowli płynnej lub kroplę NaCl 0,89% i 1 kolonię z hodowli stałej
c) czekamy aż szkiełko wyschnie (ok 10 min.)
d) utrwalamy materiał biologiczny, przeciągając szkiełko 5 razy w płomieniu palnika 8. Metody barwienia
a) barwienie proste (jeden barwnik)
b) barwienie złożone
metoda Gram’a
barwienie endospor metodą Shaeffera-Fultona
barwienie prątków metodą Ziehl-Nielsena
barwienie endospor i toksyn krystalicznych Bth wg Smirnoff’a
................
Barwienie pozytywne – wybarwiona jest komórka
proste – jeden barwnik np. błękit metylenowy
złożone – 2 lub więcej barwników
Barwienie negatywne – wybarwione tło
9. Metoda Gram’a
a) fiolet krystaliczny (f.gencjan) 1-2 min
b) spłukujemy wodą i zalewamy płynem Lugola na 1 min
c) odbarwiamy alkoholem 30 s
d) spłukujemy wodą
e) fuksyna karbolowa 30s
f) spłukujemy wodą
g) suszymy na bibułce
W ścianie komórkowej tworzy się kompleks fioletu krystalicznego i płynu Lugola (podstawienie małego jonu chloru w fiolecie krystalicznym przez dużo większy jon jodu powoduje wytrącanie się kompleksu). Pod wpływem alkoholu łańcuchy peptydoglikanu ulegają odwodnieniu i denaturacji przez co zacieśniają się zatrzymując kompleks. Po spłukaniu kompleks zawarty pomiędzy licznymi łańcuchami peptydoglikanu nie zostaje wymyty. Jeżeli jednak komórka bakteryjna ma niewiele warstw peptydoglikanu (1-3) jak w przypadku bakterii G(-) to barwny kompleks łatwo ulega wymyciu ze ściany komórkowej. Drugi barwnik służy do dobarwienia tych gramujemnych bakterii. G(+) są więc w tej metodzie wybarwione na fioletowo, a G(-) na różowo.
Endospory – formy przetrwalnikowe bakterii. Gatunki sporulujące:
Bacillus cereus (laseczka woskowa), B. subtilis (laseczka sienna), B. anthracis (laseczka wąglika) B. thuringiensis („laseczka z Turyngii”), Clostridium tetani (laseczka tężcowa), C. botulinum (laseczka jadu kiełbasianego), C. perfingens (laseczka zgorzeli gazowej), C. difficile.