Katedra Mikrobiologii
Uniwersytet Gdański
Instrukcja do ćwiczeń z immunologii
dla studentów II roku Biologii studiów
stacjonarnych
Anna-Karina Kaczorowska
Instrukcje do ć wiczeń z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
ĆWICZENIE 1
(V tydzień semestru letniego)
Reakcje serologiczne w diagnostyce bakterii z rodzajów
Staphylococcus i Streptococcus
Jedną z podstawowych umiejętności każdego mikrobiologa jest zdolność do szybkiej identyfikacji bakterii wyizolowanych z ich naturalnego środowiska. Diagnostyka mikrobiologiczna w pierwszym rzędzie zakłada wyodrębnienie drobnoustroju w postaci czystej kultury. Potrzebna jest do tego umiejętność wykonywania prawidłowego posiewu izolacyjnego. Obserwacje morfologii pojedynczych kolonii, techniki barwienia bakterii, testy biochemiczne, oporność na antybiotyki oraz reakcje serologiczne pozwalają na szybką identyfikację wyizolowanego mikroorganizmu.
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-2-
Instrukcje do ć wiczeń z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
Na dzisiejszych zajęciach przedstawione zostaną zasady identyfikacji bakterii z rodzajów Staphylococcus i Streptococcus, w oparciu o pewne cechy biochemiczne oraz obecność charakterystycznych antygenów.
Każda para studentów otrzyma płytkę z hodowlą bakteryjną. Jedynie prowadzący będzie wiedział, czy jest to hodowla gronkowców czy paciorkowców. Zadanie polega na zidentyfikowaniu bakterii. Schemat przebiegu poszczególnych etapów procesu identyfikacji bakterii podano na rys. 1.
Pierwszym krokiem będzie przeprowadzenie barwienia metodą Grama i określenie na podstawie testu na katalazę, czy Wasze bakterie wytwarzają ten enzym. Dalsza identyfikacja bakterii będzie polegała przeprowadzeniu odpowiedniego testu aglutynacji lateksowej i określeniu właściwości antygenowych bakterii.
Doś wiadczenia wykonujemy w parach.
Doświadczenie 1.1
Barwienie metodą Grama bakterii z podłoża stałego
1)
Nanieś bakterie na odtłuszczone szkiełko podstawowe
W przypadku wykonywania preparatu z bakterii wyrosłych na podłożach stałych należy materiał pobrać jałową ezą (czyli opaloną w płomieniu palnika), a następnie zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej naniesionej na szkiełko podstawowe. W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej wystarczy nanieść na szkiełko kroplę hodowli lub pobrać odrobinę bakterii jałową ezą i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka). Zabiegi te mają na celu przygotowanie bakterii w postaci niezbyt gęstej zawiesiny.
2)
Po wysuszeniu, utrwal preparat przez przeciągniecie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika.
Należy uważać, by nie trwało to zbyt długo.
3)
Na utrwalone bakterie nakropl fiolet krystaliczny w ten sposób, aby pokrył on powierzchnię, na którą naniesiono bakterie. Barwnik pozostawić na 2 minuty. Po tym czasie zmyć fiolet wodą destylowaną.
4)
Nanieś płyn Lugola na 1 minutę. Płyn należy obficie spłukać, najpierw alkoholem etylowym, a później wodą destylowaną
5)
Nanieś na preparat roztwór fuksyny zasadowej na 40 sekund. Po tym czasie spłucz szkiełko wodą destylowaną i wysusz preparat.
6)
Przed umieszczeniem preparatu na stoliku mikroskopu nanieś na szkiełko kroplę olejku immersyjnego.
Oglądaj używając obiektywu dającego stukrotne powiększenie.
Doświadczenie 1.2
Test na obecność katalazy
1) Na szkiełko podstawowe nanieś ezą kroplę
Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru, występuje
jałowego roztworu soli fizjologicznej (0,85%
u niemal wszystkich organizmów oddychających
NaCl) i równomiernie zawieś w nim niewielką
tlenowo.
ilość masy bakteryjnej pobranej z podłoża
stałego.
szczepy katalazo-dodatnie: rodzaj
2) Do otrzymanej zawiesiny bakteryjnej dodaj
Staphylococcus, Enterobacter, Pseudomonas,
kilka kropli wody utlenionej (3% r-r H2O2).
Citrobacter, Escherichia, Klebsiella,
Obserwuj preparat (gołym okiem).
szczepy katalazo-ujemne: rodzaj
Pojawienie się piany (bąbelków)
Enterococcus, Streptococcus, Aerococcus,
w preparacie świadczy o obecności katalazy
Lactococcus oraz większość bakterii
(wynik dodatni).
beztlenowych (jeden znany wyją tek)
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-3-
Instrukcje do ć wiczeń z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
→ Studenci, którzy stwierdzili w obrazie mikroskopowym obecność skupień Gram-dodatnich ziarniaków oraz uzyskali dodatni wynik w teście na katalazę wykonują t e s t a g l u t y n a c j i p r z y u ż y c i u z e s t a w u M i c r o g e n S t a p h firmy Microgen Bioproducts Ltd (Wielka Brytania). Test ten służy do wykrywania na drodze reakcji serologicznej obecności białka A oraz czynnika koagulującego.
→ Studenci, którzy stwierdzili w obrazie mikroskopowym obecność Gram-dodatnich bakterii w postaci łańcuszków oraz uzyskali ujemny wynik w teście na katalazę wykonują t e s t a g l u t y n a c j i p r z y u ż y c i u z e s t a w u M i c r o g e n S t r e p firmy Microgen Bioproducts Ltd (Wielka Brytania).
Doświadczenie 1.3a
Identyfikacja szczepów Staphylococcus aureus - wykrywanie obecności czynnika koagulującego i białka A przy pomocy testu aglutynacji Microgen Staph W teście Microgen Staph cząsteczki lateksu opłaszczone są króliczymi przeciwciałami swoistymi wobec czynnika koagulującego oraz białka A unikatowego dla bakterii Staphylococcus ureus
1) Temperaturę odczynników z zestawu do aglutynacji
Microgen Staph (Emapol) należy doprowadzić do
Białko A i czynnik koagulujący osocze
temperatury pokojowej. Odczynniki przechowywane
(CF) są jednymi z wielu czynników
są w temp. 4°C.
wirulencji gronkowca złocistego.
2) Na pole testowe nakropl roztwór przeciwciał swoistych
Białko (SpA) wiąże się z fragmentem Fc
wobec białek wytwarzanych przez bakterie gronkowca
przeciwciał IgG uniemożliwiając tym
złocistego: białka A oraz czynnika koagulującego
samym wiązanie się tych przeciwciał z
osocze. Obok nanieś ezą niewielką objętość roztworu
receptorami FcγR obecnymi na
soli fizjologicznej.
powierzchni komórek żernych. Chroni to
bakterie przed fagocytozą.
3) W roztworze soli zawieś niewielką ilość masy
bakteryjnej (4-5 kolonii bakterii pobranych z podłoża
Czynnik koagulujący osocze (CF) ułatwia
stałego).
gronkowcom kolonizację gospodarza,
4) Obydwie krople wymieszaj ezą (za każdym razem ezę
swoją nazwę zawdzięcza zdolności do
należy wyżarzyć i schłodzić) i obserwuj, delikatnie
koagulacji osocza. Związany jest z
kołysząc płytką.
obecnością dwóch niezależnych białek -
adhezyn ClfA i ClfB, które są
zakotwiczone w ścianie bakterii. ClfA
Odczyt: Obecność kłaczków (widocznych
wiąże się z fibrynogenem, ClfB wiąże poza
gołym okiem) świadczy o zajściu aglutynacji.
fibrynogenem także cytokeratynę 10.
W przypadku braku aglutynacji obserwuje się
jednolitą mieszaninę o mlecznym zabarwieniu.
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-4-
Instrukcje do ć wiczeń z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
Test aglutynacji Microgen Staph
Dodatni: Staphylococcus aureus
Ujemny: gronkowce koagulazo-ujemne:
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Doświadczenie 1.3b
Serotypowanie paciorkowców należących do grup A, B lub D
przy pomocy testu aglutynacji Microgen Strep
W teście Microgen Strep cząsteczki lateksu opłaszczone są króliczymi przeciwciałami swoistymi wobec antygenów paciorkowców grup A, B, C, D, F, G.
Kolonie paciorkowców pobrane ezą z płytki inkubowane są w roztworze enzymu pochodzącego ekstrahującego antygeny izolowanego z promieniowców Streptomyces globisporus. Ekstrakt anygenowy może być również otrzymywany przez traktowanie bakterii takimi związkami jak azotyn sodu i kwas octowy, kwas hydrochlorowy, kwas azotowy czy formamid. Wyekstrahowane antygeny są następnie testowane na płytce przy użyciu 6 opłaszczonych przeciwciałami cząsteczek reagentów lateksowych (każdy swoisty wobec jednej z grup A, B, C, D, F lub G paciorkowców).
1) Temperaturę odczynników z zestawu do aglutynacji Microgen Strep (Emapol) należy doprowadzić do temperatury pokojowej. Odczynniki przechowywane są w temp. 4°C.
2) Do próbówki Eppendorfa przenieś 0,4 ml roztworu zawierającego substancje ekstrahujące antygeny paciorkowcowe (odczynnik M47x).
3) W roztworze zawieś 4-5 kolonii bakterii pobranych z podłoża stałego. Uzyskaną mieszaninę inkubuj w łaźni wodnej w temp. 37°C przez 5 min. Po tym czasie w strząśnij zawartość próbówki.
4) Na każde pole czarnej płytki pipetą automatyczną nanieś po 1 kropli inkubowanej mieszaniny (ok. 10 µl).
Obok, przy pomocy kroplomierza, nanieś zawiesinę cząsteczek lateksowych opłaszczonych przeciwciałami swoistymi wobec określonego antygenu grupowego paciorkowców.
5) Obydwie krople wymieszaj ezą (za każdym razem ezę należy wyżarzyć i schłodzić) i obserwuj, delikatnie kołysząc płytką.
Odczyt: Obecność kłaczków (widocznych gołym
okiem) świadczy o zajściu aglutynacji.
W przypadku braku aglutynacji obserwuje się
System klasyfikacji paciorkowców w oparciu
jednolitą mieszaninę o mlecznym zabarwieniu.
o ich właściwości antygenowe zaproponowała
w 1933 r. Rebecca Lancefield. Na podstawie
reakcji serologicznej bakterii paciorkowców
z odpowiednią surowicą grupową oznacza się
Grupa serologiczna
Przedstawiciele
przynależność do jednej z grup serologicznych
paciorkowce grupy A
S. pyogenes
(od A do V).
paciorkowce grupy B
S. agalactiae
O przynależności paciorkowców do grupy
paciorkowce grupy C
-
A, B, C, F, G decyduje budowa
polisacharydów wchodzących w skład
paciorkowce grupy D
Enterococcus
ściany bakteryjnej paciorkowców.
(Streptococcus) faecalis,
Enterococcus faecium
O przynależności paciorkowców do grupy D
paciorkowce grupy F
-
decyduje struktura kwasów
lipotejchojowych.
paciorkowce grupy G
-
Bakterie wykorzystane w doświadczeniach:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus (Streptococcus) faecalis, S. agalactiae.
Stosowane skróty:
SpA – S. aureus protein A
CF – clumping factor
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-5-