Metoda lizy alkalicznej służy do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych. Metoda

pozwala na otrzymanie dobrze oczyszczonego materiału. W pierwszej kolejności zachodzi liza

komórek bakteryjnych, denaturacja białek, oraz DNA. W drugim etapie "pokomórkowy gruz" jest

strącany, a w roztworze pozostają cząsteczki plazmidów. Metoda, podczas oddzielania DNA

plazmidowego, wykorzystuje różnicę w zdolności do renaturacji plazmidów i chromosomu

bakteryjnego. To pierwsze ulega szybkiej renaturacji po usunięciu czynnika denaturującego (w tym

wypadku zneutralizowaniu alkalicznego pH) i jest to trzeci etap procedury. Otrzymany plazmid

może być oczyszczany na przystosowanych do tego minikolumnach, lub precypitowany w alkoholu

w celu przechowania.

Metoda jest szybka i prosta w wykonaniu, przez co stała się popularnym sposobem uzyskiwania

oczyszczonego plazmidu z komórek bakteryjnych.

Etapy procesu:

1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii,

hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych; niektórzy wraz z roztworem GTA dodają

lizozym, trawiący ściany bakteryjne;

2. Zniszczenie komórek bakteryjnych – plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do

roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz

nieodwracalna denaturacja białek.

3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i

chromosomu bakteryjnego.

Ad. 1

Komórki po zwirowaniu zostają zawieszone roztworze GTE (Glukoza/Tris/EDTA). Dodatkowo

można stosować lizozym.

Tris jest roztworu buforowym ma za zadanie utrzymać stałe pH (lekko zasadowe). EDTA jest

związkiem chelatującym jony biwalencyjne (np. Ca2+, Mg2+). Wynikiem tego procesu są dwa

efekty:

– zmniejszona stabilność ściany komórkowej bakterii spowodowana wiązaniem jonów Ca2+ przez

EDTA; ściana komórkowa bakterii gram ujemnych składa się z jednej warstwy mureiny i

otaczającej ją warstwy lipopolisacharydów, lipidów i lipoprotein; jak się wydaje, jony wapnia są

potrzebne do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej;

– zahamowanie działania DNaz, przez jony magnezowe; bowiem te enzymy, jeśli aktywne mogły

by pociąć plazmidowe DNA;

Glukoza jest dodana w celu zachowania właściwego ciśnienia osmotycznego; jest to ważne

szczególnie podczas stosowania lizozymu, który prowadzi do powstania protoplastów, komórek

pozbawionych ściany, a przez to wrażliwych na zewnętrzne ciśnienie osmotyczne; zbyt niskie

ciśnienie osmotyczne (czyli środowisko hipotoniczne) spowodowało by pobieranie wody przez

komórki i ich pęknięcie; środowisko izoosmotyczne lub słabo hiperosmotyczne nie jest szkodliwe

dla protoplastów;

Ad. 2

W tym etapie do zawiesiny komórek bakteryjnych dodaje się alkalicznego roztworu NaOH/SDS.

W zasadowym środowisku, przy udziale SDS dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. Uwolnione

białka są denaturowane przez SDS i NaOH. Genomowy i plazmidowy DNA ulega denaturacji pod

wpływem zasadowego pH.

Po dodaniu NaOH/SDS w probówce znajduje się mieszanina zniszczonych błon, zdenaturowanych

plazmidów, bakteryjnych chromosomów i białek, wolnych cząsteczek SDS i innych związków.

Ad. 3

Do roztworu lizatu dodawany jest octan potasu (bufor octanowy), który powoduje zmianę

obniżenie pH. W efekcie jego działania plazmidowe DNA renaturuje szybko, podczas gdy

chromosomowe DNA pozostaje zdenaturowane. Odmienna zdolność do renaturacji po obniżeniu

pH jest istotą metody lizy alkalicznej. Pozwala na późniejsze łatwe oddzielenie DNA

chromosomowego od plazmidowego. DNA genomowy wraz z białkami i fragmentami błon,

wytrąca się w postaci serowatego osadu. Następnym krokiem jest wirowanie roztworu, by oddzielić

plazmidowe DNA, które pozostaje rozpuszczone w supernatancie.

Po tym etapie otrzymana próbka może być dodatkowo odbiałczana mieszaniną fenol/chloroform,

lub oczyszczana na minikolumnach będących fragmentem zestawów sprzedawanych przez firmy

biotechnologiczne. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym

protokole.

Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można precypitować w etanolu lub izopropanolu.

Poniższy protokół uwzględnia ten proces.

Przykładowy protokół izolacji plazmidó