1
METODY OCENY AKTYWNOŚCI UKŁADU IMMUNOLOGICZNEGO
1. metody oceny aktywności układu immunologicznego- istotne przy podejrzeniu
niedoborów immunologicznych
1.1 OCENA ODPOWIEDZI WRODZONEJ
1.1.1 ocena składowych dopełniacza- immunodyfuzja radialna, ELISA, nefelometria
1.1.2 ocena chemotaksji pod wpływem czynników andogennych (C3a,C5a, IL8) i
egzogennych (endotoksyny, zymosan)
- metoda „agarozowa” mierzy się na jaką odległość komórki ”odejdą” w
podłoŜu agarozowym od środkowej studzienki w kierunku czynnika
chemotaktycznego
- metoda „filtrowa” Boydena”- podzielona komora za pomoca filtra
miliporowego- (pory mniejsze od średnicy badanych komórek), w jednej
komorze badane komórki w drugiej roztwór czynnika chemotaktycznego-
badamy indeks chemotaktyczny- stosunek komórek które przeszły w obecności
czynnika chemotaktycznego w porównaniu do liczby komórek które przeszły
przez filtr kontrolny.
1..1.3 badanie zdolności fagocytarnych-
- metoda probówkowa- Drobnoustroje +zawiesina fagocytów---inkubacja---
--rozmazy na szkiełkach –liczymy
- metoda jednowarstwowa- ( od początku na szkiełku) opsonizowane
bakterie + fagocyty—inkubacja—odczyt ( drobnoustroje mogą być
znakowane fluorochromami- wtedy odczyt w mikroskopie
fluorescencyjnym)
1..1.4 badanie aktywności metabolicznej wewnątrzkomórkowej komórek:
A. test NBT,
B. pomiar zdolności wzbudzania chemiluminescencji
C. zdolnośc do redukcji cytochromu C
A. Co ocenia? zdolności generacji rodników ponadtlenkowych przez
neutrofile . test NBT test pochłaniania i redukcji NBT (błękitu
nitrotetrazolinowego)
NADH i NADPH wytwarzane w trakcie wybuchu tlenowego w fagocytach
mają zdolność redukcji związku NBT do formazanu (błękitne złogi)
Neutrofile inkubuje się z NBT-----odczyt ile % komórek jest NBT + (norma 8%)
podwyŜszone wartości – aktualna infekcja, obniŜone wartości- przewlekła ch.
Ziarniniakowata, toczeń, pacjenci leczeni sterydami
1.3 ODPOWIEDŹ HUMORALNA
1.3.1 Oznaczanie poziomu przeciwciał w surowicy i ich podklas
1.4 ODPWOIEDŹ KOMÓRKOWA
2
- ocena fenotypu limfocytów
- metody oceny zdolności limfocytów do aktywacji
nieaktywowany limf T
Proliferacja
Komórki potomne
Późna faza aktywacji
DNA synteza
Wczesna aktywacja
APC
mitogen
TCR
CD69
CD25(IL2R)
HLA DR
CD71-transferrin receptor
Proliferacja limfocyt
Proliferacja limfocyt
ó
ó
w
w
Izolacja limfocytów
>48h hodowla
kontrolal
PHA, ConA,
specific antigens
Znacznik radioaktywny
3H tymidina
24h hodowla
Detekcja promieniowania
3
Ocena cytotoksyczno
Ocena cytotoksyczno
ś
ś
ci
ci
Wyznakowanie znakowanym
Chromianem sodu Na2CrO4
Dodanie cytotoksycznych
Limf T do wyznakowanych
komórek docelowych
Zabicie komórki uwalnia
Radioaktywny chrom
Test transformacji blastycznej
Izolowane limfocyty ---hodowla z miogenami (laktynami)
Równolegle hodowla bez czynnika mitotycznego
Po inkubacji kilkudniowej ocenia się liczbę komórek ulegających transformacji.
(morfologicznie lub metodą izotopową)
4
Metody oparte na precypitacji
1. Co to jest precypitacja- zjawisko wytrącania się kompleksów antygen-przeciwciało
Antygen musi być wielowartościowy! Dochodzi do niej w momencie wyrównania
stęŜeń między przeciwciałem i antygenem
A. precypitacja probówkowa pierścieniowa
B. immunodyfuzja- proces precypitacji w Ŝelu agarozowym- w strefie
równowagi wytrącają się kompleksy
immunodyfuzja radialna
Immunodyfuzja podwójna
5
C. Immunoelektroforeza- słuŜy identyfikacji mieszaniny róŜnych białek (np. białek
osocza, immunoglobulin) połączenie metod elektroforezy i immunodyfuzji
Początek- rozdzielenie antygenów (białek) w oparciu o ładunek elektryczny potem
immunodyfuzja pod wpływem znanych surowic przeciw białkom, przeciwciała z
surowic dyfundują w Ŝelu łącząc się z rozdzielonymi elektroforetycznie białkami
badanej surowicy tworząc łuki precypitacyjne.
I przykładowy wynik
C. Nefelometria- powstaj
ą
ce kompleksy tworz
ą
zawiesin
ę
-w nefelometrii
mierzy si
ę
nat
ęŜ
enia
ś
wiatła rozproszonego przez precypitat, porównuje
6
si
ę
do wzorca-obecnie podstawowa metoda oznaczania immunoglobulin,
sładników dopełniacza i innych białek surowicy!!!!!
Metody oparte o aglutynacj
ę
Co to jest aglutynacja- przeciwciało ł
ą
cz
ą
c si
ę
z nierozpuszczalnym antygenem
pub antygenem opłaszczonym na powierzchni wi
ę
kszych cz
ą
stek (np.
komórek) prowadzi do zlepiania cz
ą
stek i powstawania AGLUTYNATÓW
2 rodzaje:
Aglutynacja bezpo
ś
rednia
- bez no
ś
nika: szkiełkowa i probówkowa
Szkiełkowa- kropla zawiesiny bakteryjnej + kropla surowicy- --je
Ŝ
eli jest reakcja w
surowicy znajduj
ą
si
ę
Ig przeciw antygenowi
Probówkowa- szereg rozciencze
ń
surowicy badanej dodaje si
ę
zawiesin
ę
komó®ek
bakteryjnych i ocenia przy jakim najmniejszym st
ęŜ
eniu jeszcze aglutynacja .
Przykł
ą
dy: odczyn Widala (diagnostyka Salmonelloz)
Miano surowicy- takie rozcie
ń
czenie surowicy badanej przy którym jeszcze
wyst
ę
puje aglutynacja-metoda półilo
ś
ciowa oznacze
ń
!!!
Typy aglutynacji: - somatyczna
-rz
ę
skowa
- Vi
Aglutynacja po
ś
rednia
– z no
ś
nikiem ( latex albo krwinki)
Reakcja przeciwciał z antygenem opłaszczonym na no
ś
niku- słu
Ŝ
y do wykrywania
przeciwciał- aglutynacja bierna
Je
Ŝ
eli opłaszczymy na no
ś
niku przeciwciała (aglutynacja odwrócona bierna)
metoda b
ę
dzie słu
Ŝ
y
ć
do detekcji antygenów
Je
Ŝ
eli no
ś
nikiem s
ą
krwinki czerwone mówimy o hemaglutynacji
7
Testy Coombsa
Bezpo
ś
redni test Coombsa:
Diagnostyka choroby hemolitycznej noworodków, niedokrwisto
ś
ci
autoimmunohemolitycznych, odczynów potransfuzyjnych-
Oceniamy czy krwinki pacjenta zostały opłaszczone przeciwciałami, dodajemy do
krwinek pobranych od dziecka surowic
ę
z przeciwciałami przeciw fragm. FcIgG-
je
Ŝ
eli dojdzie do hemaglutynacji- to znaczy,
Ŝ
e np. krwinki dziecka Rh- zostały
opłaszczone przeciwciałami anty Rh od matki- dziecko ma chorob
ę
hemolityczn
ą
8
Odczyn po
ś
redni Coombsa
Słu
Ŝ
y do wykrywania przeciwciał anty Rh w krwi matki, ( na tym opiera si
ę
te
Ŝ
próba
krzy
Ŝ
owa przed transfuzj
ą
)
2etapy: 1. erytrocyty wzorcow + badana surowica z Ig anty Rh----opłaszczenie
erytrocytów, 2. dodanie surowicy antyglobulinowej-----aglutynacja,
Matka
Odczyn wi
ą
zania dopełniacza
9
Nie słu
Ŝ
y do oceny dopełniacza!!!!
SłuŜy ocenie obecności badanego antygenu
Etap I
Antygen + Ig + dopełniacz brak antygenu Ig + dopełniacz
Dopełniacz ulega związaniu dopełniacz dalej w surowicy
Etap II
Dodajemy opłaszczone Ig komórki
Brak lizy – bo C związany
liza komórek
WYNIK DODATNI
WYNIK UJEMNY
TESTY ZE ZNACZNIKAMI
1. FLUORYMETRYCZNE
2. RADIOIMMUNOLOGICZNE
3. IMMUNOENZYMATYCZNE
4. CHEMILUMINESCENCYJNE