Biochemia Biotechnologia Fizjologia Genetyka Medycyna Mikrobiologia Inne
Biologii komórki Biologii molekularnej Medycyny molekularnej Histologii Botaniki
Leksykon medyczny Testy
Botanika Budowa komórki Ewolucja Genetyka Medycyna Terminologia Zoologia
A B C D E F G H I J K L Ł M N O P R S Ś T U W Z Ż Cała lista
Apoptoza PDB Biochemia Biotechnologia Czasopisma Książki Uczelnie Uniwersytety Zdjęcia
O nas Tu jesteś: Biologia.pl < Artykuły
Aleksander SochanikStanisław Szala Terapia genowa Jak przy pomocy transferu genów można leczyć choroby dziedziczne i nowotwory?
Co to jest terapia genowa? Uszkodzenia materiału genetycznego są przyczyną ponad czterech tysięcy chorób człowieka. Chorobotwórcze mutacje mogą dotyczyć pojedynczego genu (tak jest np. w mukowiscydozie, hemofiliach A i B, zespole ciężkiego złożonego niedoboru odporności, fenyloketonurii, dystrofii mięśniowej Duchennea) lub wielu genów jednocześnie (np. w nowotworach, miażdżycy, chorobach reumatycznych i chorobie Parkinsona). Teoretycznie takie schorzenia można leczyć, kompensując brak uszkodzonego genu lub genów przez wprowadzenie prawidłowych genów do komórek pacjenta. W chorobach jednogenowych, na przykład w mukowiscydozie, szkodliwa mutacja może mieć charakter recesywny (choroba ujawnia się dopiero po uszkodzeniu obu alleli tego genu). Wprowadzenie prawidłowej kopii genu (tzw. addycja lub wzmocnienie) do chorych komórek powinno spowodować kompensację funkcji uszkodzonego genu. Co prawda nie likwiduje to samego defektu genetycznego, ale pojawienie się leczniczego białka w komórce usuwa skutki tego defektu. W innych chorobach jednogenowych (np. w rodzinnej hipercholesterolemii) mutacje mają charakter dominujący - choroba ujawnia się już po uszkodzeniu jednego allelu danego genu. Wtedy uszkodzenie genetyczne można naprawić tylko na drodze wymiany (substytucji) zmutowanego allelu lub allelów, czyli usunięcia wadliwej kopii genu i wprowadzenia prawidłowej kopii na zasadzie rekombinacji homologicznej. Jest to znacznie trudniejszy problem do rozwiązania. W niektórych schorzeniach wielogenowych (np. w nowotworach) dochodzi do mutacji tak wielu genów, że korekta patologicznego fenotypu wydaje się nieosiągalna. Zamiast naprawiać wadliwie działające geny, należałoby raczej wybiórczo eliminować uszkodzone komórki. Do niedawna terapia chorób dziedzicznych i uwarunkowanych genetycznie polegała raczej na próbach leczenia objawowego. Takie leczenie polega na dostarczaniu do organizmu pacjenta białka lub peptydu, którego brak jest przyczyną choroby - przykładem jest leczenie cukrzycy insuliną. Jednak ta metoda leczenia często wiąże się z nietrwałym efektem terapeutycznym (zależy to od stabilności podanego białka w organizmie ludzkim). Terapia genowa (genoterapia) jest nowym podejściem do leczenia tego typu schorzeń. Polega ona na wprowadzaniu do określonych komórek wybranych genów. Białka kodowane przez te geny umożliwiają przywrócenie prawidłowych funkcji uszkodzonych komórek. Osiągnięty efekt terapeutyczny jest znacznie bardziej trwały. Terapia genowa stała się możliwa dzięki osiągnięciom inżynierii genetycznej, pozwalającym na tworzenie zrekombinowanych genów. Dalszy postęp w terapii genowej będzie zależał od opracowania skuteczniejszych metod transferu (przenoszenia) leczniczych genów do komórek. Najprostszym sposobem wprowadzenia genu do komórki w warunkach in vivo jest jego bezpośredni transfer za pomocą metod fizykochemicznych (np. tzw. pistoletem genowym) albo pod postacią plazmidowego, tzw. nagiego DNA (naked DNA) zawierającego dany gen. Jednak nagie cząsteczki DNA można wprowadzać tylko do określonych, powierzchniowo położonych tkanek. Najczęściej gen jest wprowadzany do komórek za pomocą specjalnego nośnika (wektora). W terapii genowej stosuje się dwa typy nośników DNA. Pierwszy to nośniki wirusowe. Dzięki inżynierii genetycznej możliwe jest usuwanie z genomu wirusów genów związanych z cyklem rozwojowym i wstawianie w ich miejsce genu terapeutycznego. Zmodyfikowany wirus nie ulega namnażaniu w komórce, ale pozostawia w niej wprowadzony leczniczy DNA. Drugi typ nośnika DNA to nośniki niewirusowe. Są to związki chemiczne będące polimerami kationowymi lub syntetyczne konstrukty, np. liposomy czy dendrymery. Nośniki niewirusowe dostarczają do komórek cząsteczki DNA z genem terapeutycznym na drodze endocytozy. W terapii genowej odpowiednikiem klasycznych leków jest połączenie nośnika z genem terapeutycznym. Dalszy postęp w zastosowaniu transferu genów do terapii różnych chorób zależy między innymi od opracowania wydajniejszych sposobów wprowadzania DNA do organizmu (czyli nowych, skuteczniejszych nośników); stworzenia zwierzęcych modeli chorób ludzkich i rozwoju strategii związanych z tworzeniem nowych konstruktów genowych (na przykład tzw. przełączników molekularnych, które pozwalają dowolnie regulować aktywność transkrypcyjną genów). Jak można leczyć recesywne choroby monogenowe? Mukowiscydoza (zwłóknienie torbielowate) jest jedną z recesywnych chorób monogenowych, w których przeprowadzono wstępne próby terapii genowej. Ta choroba jest związana z mutacją w genie kodującym białko CFTR. Do terapii mukowiscydozy z wykorzystaniem cDNA (sekwencji kodujących białko) genu CFTR zaaprobowano ponad 15 protokołów klinicznych. W tych próbach jako nośniki genów wykorzystuje się liposomy, adenowirusy i wirusy AAV (wirusy stowarzyszone z adenowirusami, Adeno-Associated Viruses) [Boulikas]. Terapia genowa może także pomóc w leczeniu ciężkiego złożonego niedoboru odporności (severe combined immune deficiency, SCID). SCID polega na obecności w komórkach niewłaściwego allelu deaminazy adenozyny - enzymu uczestniczącego w katabolizmie puryn. Do objawów choroby należy m.in. upośledzenie funkcji limfocytów T, spowodowane gromadzeniem się toksycznych produktów przemiany adenozyny w limfocytach. Powoduje to nawracające zakażenia, które mogą doprowadzić do śmierci pacjenta. Terapia genowa polega na pobraniu limfocytów z organizmu pacjenta i wprowadzaniu do nich prawidłowego genu deaminazy adenozyny (ADA) przy pomocy wektorów retrowirusowych. Następnie genetycznie zmodyfikowane limfocyty można znowu wprowadzić do układu krwionośnego pacjenta [Boulikas]. Inna recesywna choroba o podłożu genetycznym - hemofilia A - jest spowodowana brakiem czynnika VIII kaskady krzepnięcia krwi. Krew nie może prawidłowo krzepnąć i pojawiają się obfite krwawienia, które mogą stać się przyczyną śmierci. W tym przypadku terapia genowa polega na wprowadzeniu genu wytwarzającego brakujący czynnik krzepnięcia krwi np. do komórek wątroby albo do komórek nabłonka wyścielającego naczynia krwionośne. Terapia genowa szczególnie dobrze nadaje się do leczenia hemofilii A - nawet niewielki wzrost stężenia czynnika VIII we krwi powoduje znaczne złagodzenie objawów choroby. W próbach klinicznych wykorzystuje się protokoły z użyciem fragmentów genów (cDNA genu czynnika VIII lub genu czynnika VIII bez fragmentu zwanego domeną B, który jest zbędny w procesie krzepnięcia) i nośników retrowirusowych oraz syntetycznych [Boulikas]. Hemofilia B jest chorobą wynikającą z braku czynnika IX kaskady krzepnięcia krwi. Próby terapii genowej tego schorzenia polegały na powtórnej transplantacji mioblastów, do których wprowadzono gen czynnika IX przy pomocy retrowirusów, adenowirusów oraz wirusów AAV [Boulikas]. Terapia genowa a nowotwory Zdrowa komórka może zmienić się w komórkę nowotworową wskutek powstania dziedzicznych uszkodzeń pewnych genów. W ten sposób wykształca się tzw. złośliwy fenotyp. Komórki o takim fenotypie charakteryzują się brakiem kontroli podziałów, zdolnością do naciekania zdrowych tkanek oraz ucieczki spod nadzoru układu odpornościowego, umiejętnością pobudzania wzrostu nowych naczyń krwionośnych (angiogenezy) oraz zanikiem zdolności do ulegania apoptozie. Nowotwór pojawia się w wyniku namnożenia się właśnie takich zmienionych komórek. Leczenie mogłoby polegać na próbie naprawy działania niektórych kluczowych genów, np. genów supresorowych (p53, RB1 czy BRCA1) oraz onkogenów (np. erbB-2, K-ras, c-myc) na drodze wprowadzenia prawidłowych kopii tych genów do komórek. Taką naprawę genetyczną jest jednak bardzo trudno uzyskać w praktyce, głównie ze względu na udział wielu genów w procesie nowotworzenia. Obecnie taka korekta procesów życiowych komórek nowotworowych jest nieosiągalna - między innymi dlatego, że manipulacje genetyczne prowadzą do zmian różnych odpowiedzi wewnątrzkomórkowych, a nie lokalnych czy układowych (jak w przypadku chemioterapii molekularnej czy mobilizacji układu odpornościowego), więc tylko modyfikacja procesów przebiegających we wszystkich komórkach nowotworowych mogłaby przynieść efekt terapeutyczny. W tej chwili brak jest odpowiednich wektorów, które zapewniłyby aż tak wysoką skuteczność przenoszenia terapeutycznego DNA bez wywoływania skutków ubocznych, takich jak niepożądana odpowiedź immunologiczna, ryzyko aktywacji onkogenów i toksyczność samego nośnika. Dlatego w próbach leczenia nowotworów dąży się raczej do swoistego zniszczenia i wyeliminowania komórek nowotworowych z organizmu. Przykładem może być wprowadzenie do tych komórek genów samobójczych, immunomodulacyjnych (zmieniających aktywność układu odpornościowego), antyangiogennych (hamujących wzrost naczyń krwionośnych) lub proapoptotycznych (pobudzających śmierć komórki na drodze apoptozy). W przypadku genów samobójczych enzym kodowany przez terapeutyczny gen umożliwia przekształcenie nieaktywnego związku chemicznego (tzw. proleku) w substancję, której działanie prowadzi do śmierci komórki [Missol] lub do uczulenia komórki na chemioterapię albo radioterapię. Najbardziej znane geny samobójcze to: gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (enzym kodowany przez ten gen zmienia prolek - gancyklowir - w substancję hamującą syntezę kwasów nukleinowych) oraz gen dezaminazy cytozyny pałeczki okrężnicy (ten enzym przekształca inny prolek - 5-fluorocytozynę - w pochodną chemiczną, która też hamuje produkcję kwasów nukleinowych i jest szeroko stosowana w konwencjonalnej chemioterapii. Kombinacje różnych systemów genów samobójczych i proleków jeszcze skuteczniej niszczą in vitro komórki nowotworowe, wykazując działanie synergistyczne. Druga grupa genów stosowanych w próbach leczenia nowotworów to geny immunomodulacyjne [Gomez-Navarro]. Białka kodowane przez te geny pośredniczą w eliminacji komórek nowotworowych. Mogą bezpośrednio zabijać komórki albo pobudzać limfocyty T, które niszczą komórki nowotworowe. Najprostszą i najlepiej zbadaną strategią tego rodzaju jest wprowadzenie do chorych komórek genów różnych cytokin. Obecnie stosuje się geny kodujące takie cytokiny, jak np. TNF-a, różne interleukiny (IL-2, IL-4, IL-12) czy GM-CSF. Trzeci rodzaj genów stosowanych w próbach terapii nowotworów to geny hamujące powstawanie nowych naczyń krwionośnych w guzie [Wilczyńska]. Rozrost nowotworu jest uzależniony od odpowiedniego rozwoju układu naczyniowego w powiększającym się guzie. Angiogenezę można regulować przez hamowanie komórkowych sygnałów pobudzających wzrost nowych naczyń albo przez nasilenie działania substancji hamujących rozwój naczyń. Terapia genowa wykorzystująca geny kodujące substancje hamujące wzrost naczyń (np. geny angiostatyny czy endostatyny) pozwoliłaby ominąć szereg ograniczeń zwykłego leczenia przeciwnowotworowego, np. oporność na leki (bo komórki naczyń krwionośnych nowotworu w przeciwieństwie do komórek rakowych nie są genetycznie niestabilne i nie mogą łatwo uodpornić się na działanie leku) czy wysokie koszty leczenia. Według niektórych danych transfer tego rodzaju genów zwiększa także skuteczność konwencjonalnej chemio- i radioterapii. Na razie postęp antyangiogennej terapii genowej ogranicza brak odpowiednich wektorów umożliwiających skuteczny transfer leczniczych genów w warunkach in vivo. Czwarty rodzaj genów, który też może znaleźć zastosowanie w leczeniu nowotworów, to geny proapoptotyczne [Szala]. W komórkach nowotworowych dochodzi do zaburzeń procesu apoptozy - zjawiska, które w warunkach fizjologicznych eliminuje uszkodzone komórki. Nagromadzenie mutacji w materiale genetycznym komórki nowotworowej prowadzi do zaburzeń ekspresji genów pobudzających (np. p53) i hamujących apoptozę (np. bcl-2). Naukowcy usiłują przywrócić wrażliwość komórek nowotworowych na apoptozę poprzez transfer takich genów, jak bax, Bcl-Xs, Bim, E4orf4 i apoptyny. Nośniki terapeutycznych genów Dobry wektor stosowany w terapii genowej powinien skutecznie przenosić DNA do docelowych komórek i chronić leczniczy gen przed zniszczeniem. Niektóre stosowane obecnie wektory przenoszą geny nie tylko do komórek docelowych, inne niezbyt wydajnie przenoszą DNA, a jeszcze inne pobudzają niepożądaną odpowiedź układu odpornościowego. Do tej pory nie udało się skonstruować uniwersalnego i pozbawionego wad nośnika DNA. Szybki rozwój terapii genowej ograniczony jest brakiem nośników DNA zdolnych do skutecznego (wydajnego) przenoszenia i ochrony wprowadzanego genu w warunkach in vivo. Niektóre badania polegają na zmianie właściwości różnych wektorów wirusowych. Retrowirusy potrafią zakażać wiele rodzajów komórek, ale ulegają stabilnej integracji z DNA i wymagają syntezy DNA gospodarza, a to nie zawsze jest korzystne. Adenowirusy mogą wnikać do nie dzielących się komórek, ale wywołują niepotrzebną reakcję odpornościową. Niektóre wirusy AAV nie wywołują odpowiedzi układu odpornościowego, ale w warunkach laboratoryjnych trudno jest wytwarzać dużą liczbę kopii tych wirusów. DNA "dzikich" wirusów AAV łączy się z chromosomem 19, a formy zrekombinowane nie mają zdolności do specyficznego łączenia się z DNA gospodarza i istnieją w komórce w postaci episomalnej. Wektory skonstruowane w oparciu o genom wirusa opryszczki (HSV) mogą przedostawać się do nie dzielących się komórek i przenosić duże fragmenty obcego DNA, ale są toksyczne dla komórek. Obecnie prowadzone są interesujące badania nad systemem rekombinazy Cre-loxP, pozwalającym na pozbywanie się niepożądanych sekwencji wirusowego DNA użytego do transferu genu terapeutycznego [Palo]. Prowadzi się także intensywne badania nad niewirusowymi, syntetycznymi nośnikami DNA nowej generacji [Sochanik]. Wielką zaletą takich wektorów jest to, że nie pobudzają one układu odpornościowego. W porównaniu z wirusami mają one jednak niższą wydajność transferu DNA. Dlatego przy wytwarzaniu nowych nośników niewirusowych naukowcy próbują uzyskać takie zalety wektorów wirusowych, jak np. zdolność do kondensowania przenoszonego DNA oraz wydajność i wybiórczość transferu DNA do określonego typu komórek. Do nośników niewirusowych nowej generacji próbuje się przyczepiać grupy chemiczne rozpoznające swoiste receptory powierzchni komórek. Badacze starają się także ułatwić przedostawanie się wektora z endosomu do cytoplazmy przy pomocy specjalnych peptydów rozbijających endosomy oraz umożliwić wprowadzenie DNA do jądra komórki przy pomocy białek lub peptydów zawierających naturalne sekwencje lokalizacji jądrowej. Co dalej z terapią genową? Sukces w walce z rakiem i innymi chorobami zależy przede wszystkim od zdolności kontrolowanego dostarczania terapeutycznych genów do patologicznie zmienionych komórek. Żeby stworzyć wektory spełniające te wymagania, biolodzy muszą współpracować również z chemikami. Aleksander SochanikStanisław SzalaZakład Biologii MolekularnejCentrum Onkologii - Instytut im. Marii Skłodowskiej-CurieWybrzeże Armii Krajowej 15, 44-100 Gliwice
Piśmiennictwo
1. RAC-approved human gene therapy protocols; Gene Therapy and Molecular Biology, ed. Boulikas T, Gene Therapy Press, Palo Alto, CA (USA), Vol. 1, 107 [1998]; 2. RAC-approved human gene therapy protocols; Gene Therapy and Molecular Biology, ed. Boulikas T, Gene Therapy Press, Palo Alto, CA (USA), Vol. 1, 109 [1998]; 3. RAC-approved human gene therapy protocols; Gene Therapy and Molecular Biology, ed. Boulikas T, Gene Therapy Press, Palo Alto, CA (USA), Vol. 1, 114-115 [1998]; 4. RAC-approved human gene therapy protocols; Gene Therapy and Molecular Biology, ed. Boulikas T, Gene Therapy Press, Palo Alto, CA (USA), Vol. 1, 115 [1998]; 5. Lin CM, Tan Y, Lee YM, Chang CC, Hsiao KJ: Expression of human phenylalanine hydroxylase activity in T lymphocytes of classical phenylketonuria children by retroviral-mediated gene transfer, J. Inherit. Metab. Dis. 20, 742-754 [1997]; 6. Wakefield PM, Tinsley JM, Wood MJ, Gilbert R, Karpati G, Davies KE: Prevention of the dystrophic phenotype in dystrophin/utrophin-deficient muscle following adenovirus-mediated transfer of a utrophin minigene, Gene Ther. 7, 201-204 [2000]; 7. Missol E, Sochanik A, Szala S: The use of E.coli Cytosine Deaminase Gene as an Example of Suicide Gene Therapy of Cancer, Biotechnologia 4, 80-90 [1996]; 8. Gomez-Navarro J, Curiel DT, Douglas JT: Gene Therapy for Cancer, Eur. J. Cancer 35, 867-885 [1999]; 9. Wilczyńska U, Szary J, Szala S: Antyangiogenna terapia genowa, Współczesna Onkologia 4, 139-142 [1999]; 10. Szala S: Swoista indukcja apoptozy w komórkach nowotworowych, Nowotwory 50: 3-13 [2000]; 11. Gene Therapy and Molecular Biology, ed. Boulikas T, Gene Therapy Press, Palo Alto, CA (USA), Vol. 1, 6 [1998]; 12. Sochanik A, Szala S: Perspektywy wykorzystania syntetycznych wirusów w terapii genowej, Postępy Biochemii 3: w druku [2000].
CZWARTEK13 września 2001
Sponsor serwisu:
Jak szukać?
Znajdź
Zobacz także:
Leksykon medyczny
Kurs histologii
Wiedza i Życie
Świat Nauki
dlaczego.pl
gimnazjum.pl
liceum.pl
mapaPolski.pl
pilot.pl
Serwis nominowany do 'Złotej witryny' konkursu Webfestival 2001.