Kurs nr 13. Neurogenetyka w diagnostyce klinicznej
organizator: J. Zaremba
A
n
a
l
i
z
a
D
N
A
w
c
h
o
r
o
b
a
c
h
n
e
r
w
o
w
o
-
m
i
ę
S

n
i
o
w
y
c
h
n
a
p
r
z
y
k
ł
a
d
z
i
e
S
7
5
7
1. Analiza DNA w chorobach nerwowo-mięS
niowych na przykładzie S 757
dystrofii mięS
niowej Duchenne'a-Beckera (DMD/BMD)
d
y
s
t
r
o
f
i
i
m
i
ę
S

n
i
o
w
e
j
D
u
c
h
e
n
n
e
'
a
-
B
e
c
k
e
r
a
(
D
M
D
/
B
M
D
)
i rdzeniowego zaniku mięS
ni (SMA)
i
r
d
z
e
n
i
o
w
e
g
o
z
a
n
i
k
u
m
i
ę
S

n
i
(
S
M
A
)
Janusz G. Zimowski
A
n
a
l
i
z
a
D
N
A
w
c
h
o
r
o
b
a
c
h
n
e
u
r
o
d
e
g
e
n
e
r
a
c
y
j
n
y
c
h
s
p
o
w
o
d
o
w
a
n
y
c
h
S
7
6
1
2. Analiza DNA w chorobach neurodegeneracyjnych spowodowanych S 761
mutacjami dynamicznymi
m
u
t
a
c
j
a
m
i
d
y
n
a
m
i
c
z
n
y
m
i
Anna Sułek
Z
a
s
t
o
s
o
w
a
n
i
e
t
e
c
h
n
i
k
i
P
C
R
w
c
z
a
s
i
e
r
z
e
c
z
y
w
i
s
t
y
m
w
d
i
a
g
n
o
s
t
y
c
e
S
7
6
3
3. Zastosowanie techniki PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce S 763
nosicielstwa rdzeniowego zaniku mięS
ni (SMA) oraz przypadków
n
o
s
i
c
i
e
l
s
t
w
a
r
d
z
e
n
i
o
w
e
g
o
z
a
n
i
k
u
m
i
ę
S

n
i
(
S
M
A
)
o
r
a
z
p
r
z
y
p
a
d
k
ó
w
bez delecji w genie SMN1
b
e
z
d
e
l
e
c
j
i
w
g
e
n
i
e
S
M
N
1
Maria Jędrzejowska
W
y
k
o
r
z
y
s
t
a
n
i
e
m
e
t
o
d
a
n
a
l
i
z
y
D
N
A
w
a
t
a
k
s
j
i
F
r
i
e
d
r
e
i
c
h
a
S
7
6
6
4. Wykorzystanie metod analizy DNA w ataksji Friedreicha S 766
Tomasz Mazurczak, Dorota Hoffman-Zacharska, Anna Sułek
KURS NR 13  WYKŁAD 1
Analiza DNA w chorobach nerwowo-mięS
niowych na przykładzie dystrofii
mięS
niowej Duchenne a-Beckera (DMD/BMD) i rdzeniowego zaniku mięS
ni (SMA)
Janusz G. Zimowski
Zakład Genetyki Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie
nia całkowity brak dystrofiny u chorych z DMD i znacz-
Obraz kliniczny dystrofii
O
b
r
a
z
k
l
i
n
i
c
z
n
y
d
y
s
t
r
o
f
i
i
nie zmniejszoną jej iloS
ć u chorych z BMD.
mięS
niowej Duchenne a-Beckera
m
i
ę
S

n
i
o
w
e
j
D
u
c
h
e
n
n
e

a
-
B
e
c
k
e
r
a
Wykryte w genie dystrofiny mutacje to w 60 65%
(DMD/BMD)
(
D
M
D
/
B
M
D
)
przypadków delecje, w 5 10% duplikacje i w ok. 30%
mutacje punktowe. Ostry i łagodny przebieg choroby
Dystrofia mięS
niowa Duchenne a (DMD) jest cięż-
tłumaczy hipoteza Monaco, która zakłada, że mutacje
kim, postępującym, nieodwracalnym zanikiem mięS
ni
naruszające fazę odczytu powodują całkowity brak biał-
dotykającym chłopców. Rozpoczyna się w wieku kilku
ka, zaS
mutacje zachowujące fazę odczytu powstanie
lat kłopotami z wstawaniem, chodzeniem po schodach,
uszkodzonego białka (ang. truncated protein) pozbawio-
bieganiem, niekiedy towarzyszy jej upoS
ledzenie umy-
nego tej częS
ci, która odpowiada zakresowi delecji [3].
słowe. Unieruchomienie pacjenta następuje w wieku
Molekularna diagnostyka DMD/BMD polega na
8 12 lat, a S
mierć wywołana niewydolnoS
cią krążenia
poszukiwaniu delecji w obrębie genu dystrofiny i jest
lub/i oddechową następuje pod koniec 2. dekady życia.
wykonywana za pomocą reakcji PCR-multiplex z uży-
Choroba wywoływana jest mutacją dziedziczoną w spo-
ciem starterów flankujących co najmniej 30 eksonów
sób recesywny, sprzężony z płcią lub mutacją nowo po-
(ryc. 1.). Niewykrycie delecji nie zaprzecza wczeS
niej-
wstałą. CzęstoS
ć zachorowań okreS
la się jako 1 na 3 500
szej diagnozie. Sugeruje jedynie możliwoS
ć występowa-
żywo urodzonych chłopców. Znana jest rzadsza, allelicz-
nia innego rodzaju uszkodzenia w genie dystrofiny lub
na postać choroby nazwana dystrofią mięS
niową Becke-
możliwoS
ć mutacji w innym genie, od którego może
ra (BMD), objawiająca się łagodniejszym i wolniejszym
również zależeć prawidłowe funkcjonowanie mięS
nia.
przebiegiem niż DMD. Niektórzy chorzy dotknięci
Poszukiwanie mutacji punktowych w tak ogromnym
BMD przez wiele lat zachowują zdolnoS
ć do samodziel-
genie, jakim jest gen dystrofiny, choć możliwe, jest nie-
nego chodzenia i dożywają sędziwego wieku [1].
zwykle pracochłonne, kosztowne i rzadko stosowane,
stąd potrzeba uzupełniających badań immunohistoche-
micznych, rozstrzygających w wypadku braku delecji.
Podłoże molekularne DMD/BMD
P
o
d
ł
o
ż
e
m
o
l
e
k
u
l
a
r
n
e
D
M
D
/
B
M
D
Podłożem molekularnym obu postaci choroby jest
Badanie nosicielstwa mutacji
B
a
d
a
n
i
e
n
o
s
i
c
i
e
l
s
t
w
a
m
u
t
a
c
j
i
uszkodzenie genu dystrofiny. Ten największy z dotych-
wywołującej DMD/BMD
w
y
w
o
ł
u
j
ą
c
e
j
D
M
D
/
B
M
D
czas poznanych ludzkich genów, o długoS
ci 2,5 mln nu-
kleotydów, położony jest w cytogenetycznym prążku
Za przypadek rodzinny wystąpienia DMD/BMD
Xp21 i składa się z 79 eksonów, których łączna długoS
ć
należy uważać sytuację, gdy kobieta ma więcej niż jed-
wynosi 14 tys. nukleotydów. Białkowy produkt genu 
nego chorego syna lub poza chorym synem miała cho-
dystrofina o ciężarze cząsteczkowym 427 kD  występu-
rego brata lub kuzyna, ale tylko w rodzinie swojej mat-
je we wszystkich włóknach mięS
niowych. Jest ona połą-
ki. Siostry matki i siostry chorego mogą być nosicielka-
czona z kompleksem glikoprotein błonowych (dystrophin
mi uszkodzonego genu dystrofiny z 50% prawdopodo-
glicoprotein complex, DGC), tworząc strukturalno-funk- bieństwem. Analiza dziedziczenia poszczególnych alle-
cjonalny pomost pomiędzy cytoszkieletem komórki
li tego genu z zastosowaniem technik genetyki moleku-
a matriks zewnątrzkomórkową [2]. Immunohistoche- larnej u wszystkich członków rodziny (analiza dziedzi-
miczne barwienie skrawków włókien mięS
niowych ujaw- czenia haplotypów) daje możliwoS
ć okreS
lenia nosiciel-
S 757
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Janusz G. Zimowski
z użyciem DNA wyizolowanego z komórek trofoblastu
lub amniocytów. Namnożone fragmenty DNA pocho-
dzące z prawidłowej i defektywnej kopii genu są odpo-
48 wiednio wielkoS
ci 500 pz i 350 pz. ObecnoS
ć obu pro-
49
51
8
45
50 duktów wskazuje płeć męską i jest sygnałem do dalszych
4
53
54
42 badań. Wykrycie delecji genu dystrofiny u płodu ozna-
29
55
cza prenatalną diagnozę DMD/BMD i może być wska-
zaniem do zakończenia ciąży. Podobnie jest w przypad-
ku stwierdzenie haplotypu identycznego jak u probanta.
Zarówno poszukiwanie delecji, jak i analiza haplotypów
są czasochłonne, dlatego też wskazane jest wczeS
niejsze
Ryc. 1. Poszukiwanie delecji w genie dystrofiny. Produkty PCR-multiplex roz-
R
y
c
.
1
.
zgłaszanie się rodzin w celu wykonania molekularnej we-
dzielone w 2% żelu agarozowym, w obecnoS
ci bromku etydyny. W S
cieżce
ryfikacji diagnozy klinicznej, ustalenia nosicielstwa
oznaczonej 1 i 1 produkty reakcji z użyciem DNA od zdrowego mężczyzny
(kontrola pozytywna), w S
cieżkach 2, 2 , 3 i 3 DNA od dwóch osób chorych, i przygotowania się do diagnozy prenatalnej.
w S
cieżce 4 i 4 bez użycia DNA (kontrola negatywna). Prążki wielkoS
ci 439
pz, 360 pz, 307 pz, 212 pz, 155 pz i 119 pz odpowiadają odpowiednio
eksonom 49, 8, 45, 53, 42 i 55 (S
cieżki 1 4) oraz prążki wielkoS
ci 506 pz,
Obraz kliniczny rdzeniowego
O
b
r
a
z
k
l
i
n
i
c
z
n
y
r
d
z
e
n
i
o
w
e
g
o
388 pz, 271 pz, 196 pz, 149 pz i 118 pz odpowiadają odpowiednio ekso-
zaniku mięS
ni (SMA)
z
a
n
i
k
u
m
i
ę
S

n
i
(
S
M
A
)
nom 48, 51, 50, 4, 54 i 29 (S
cieżki 1  4 ). Strzałka obok zdjęcia żelu
oznacza kierunek migracji rozdzielanych fragmentów DNA. Brak prążka jest
Proksymalny rdzeniowy zanik mięS
ni (spinal mu-
wynikiem delecji. Wykryto delecje  u pacjenta 2 eksonu 45, i u pacjenta
scular atrophy  SMA) charakteryzuje się zwyrodnie-
3 eksonów 49 54
niem neuronów ruchowych rogów przednich rdzenia
kręgowego i niekiedy jąder ruchowych nerwów czasz-
stwa z prawdopodobieństwem bliskim 100% lub
kowych. Choroba prowadzi do postępującego niedo-
w szczególnych przypadkach z całkowitą pewnoS
cią.
władu połączonego z zanikiem mięS
ni.
Wystąpienie pojedynczego (izolowanego) przypadku
Najczęstsza postać SMA, występująca u dzieci
DMD/BMD w rodzinie oznacza, że matka jest nosi-
i młodzieży, dziedziczy się w sposób autosomalny rece-
cielką z prawdopodobieństwem 66%; pozostałe 33%
sywny i występuje z częstoS
cią 1 na 6 000 10 000 uro-
przypadków izolowanych powstaje w wyniku nowej mu-
dzeń [1]. Ocenia się, że co 40. 50. człowiek jest nosi-
tacji. Istnieje też niewielka grupa kobiet, które somatycz-
cielem mutacji wywołującej SMA.
nie nie są nosicielkami, lecz w linii komórek rozrodczych
Obraz kliniczny dziecięcego i młodzieńczego SMA
posiadają klon zawierający mutację. Są to przypadki mo-
jest bardzo zróżnicowany. W najcięższych przypadkach
zaikowatoS
ci germinalnej. Dowiadujemy się o tym, nie-
objawy rozpoczynają się jeszcze w okresie płodowym,
stety, jedynie w przypadku urodzenia następnego chore-
w najłagodniejszych początek objawów przypada na
go syna  wbrew przewidywaniom opartym na analizie
wiek dorosły. Kierując się przede wszystkim kryterium
DNA. Wykluczenie nosicielstwa zmutowanego allelu
nasilenia objawów choroby, ale biorąc również pod
u matki jednego chorego chłopca może być obarczone
uwagę wiek zachorowania, przyjęto (International SMA
takim właS
nie błędem. Badaniem uzupełniającym, nie-
Consortium) podział choroby na 3 grupy [4]:
dającym pewnoS
ci, jest oznaczenie poziomu aktywnoS
ci
1) typ I  choroba Werdniga-Hoffmanna (postać
kinazy kreatyny (CK) w surowicy krwi kobiety podejrza-
ostra) charakteryzująca się ostrym, uogólnionym
nej o nosicielstwo. U większoS
ci kobiet nosicielek muta-
osłabieniem mięS
ni, hipotonią od momentu urodze-
cji obserwuje się podwyższony poziom tego enzymu.
nia i S
miercią zazwyczaj przed upływem 2. roku ży-
cia. Chorzy nigdy nie osiągają zdolnoS
ci samodziel-
nego siadania.
Diagnostyka prenatalna DMD/BMD
D
i
a
g
n
o
s
t
y
k
a
p
r
e
n
a
t
a
l
n
a
D
M
D
/
B
M
D
2) typ II  postać poS
rednia charakteryzująca się nieco
Zastosowanie reakcji PCR umożliwia w krótkim
łagodniejszym przebiegiem. Dzieci siadają samo-
czasie ustalenie płci płodu. Stosuje się w tym celu am-
dzielnie, lecz nigdy nie stają i nie chodzą bez pomocy.
plifikację fragmentu genu amelogeniny znajdującego
R
mierć następuje na ogół między 2. a 6. rokiem życia.
się w chromosomie X, i którego defektywna kopia
3) typ III  choroba Kugelberga-Welander, postać
obecna jest w chromosomie Y. Reakcję wykonuje się
młodzieńcza charakteryzująca się osłabieniem mię-
S 758 Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Analiza DNA w chorobach nerwowo-mięS
niowych na przykładzie dystrofii mięS
niowej Duchenne a-Beckera (DMD/BMD) i rdzeniowego zaniku mięS
ni (SMA)
S
ni proksymalnych i rozpoczynająca się po 18. mies. PCR
P
C
R
życia. Chorzy chodzą samodzielnie. DługoS
ć życia
SMN2 Ekson 7
SMN1 Ekson 7
może być nawet taka sama, jak w populacji ogólnej.
Podłoże molekularne rdzeniowego
P
o
d
ł
o
ż
e
m
o
l
e
k
u
l
a
r
n
e
r
d
z
e
n
i
o
w
e
g
o
zaniku mięS
ni (SMA)
z
a
n
i
k
u
m
i
ę
S

n
i
(
S
M
A
)
Podłożem molekularnym SMA są mutacje wystę-
miejsce rozpoznawane
przez Dral
pujące w genie SMN1 (survival of motor neuron gene 1)
188 bp 188 bp
położonym w obszarze SMA, w cytogenetycznym
prążku 5q11.2 13.3. W tym samym obszarze znajdu-
trawienie enzymem Dral
t
r
a
w
i
e
n
i
e
e
n
z
y
m
e
m
D
r
a
l
je się niemal identyczna kopia tego genu oznaczana
SMN2. U większoS
ci chorych z SMA (95% wszyst-
188 bp 25 bp 163 bp
kich przypadków) wykrywa się delecje obejmujące
obie kopie genu SMN1. Pozostałe przypadki wywoła-
elektroforeza
e
l
e
k
t
r
o
f
o
r
e
z
a
ne są mutacjami punktowymi lub są heterozygotami
złożonymi (na jednym chromosomie mutacja punkto-
1 2 3 4 5 6 7 8
wa, na drugim  delecja). W 45% przypadków ostrej
postaci SMA i w 18% przypadków postaci poS
redniej
i łagodnej wykrywane delecje obejmują również obie
kopie położonego obok SMN1 genu NAIP (neuronal
apoptosis inhibitory protein gene). W 5% grupie osób
zdrowych wykrywa się delecje obu kopii genu SMN2.
Obecnie uważa się, że zasadnicze znaczenie w patoge-
188 bp
nezie SMA mają mutacje w genie SMN1, a geny
163 bp
SMN2 i NAIP mogą mieć jedynie znaczenie modyfi-
kujące ekspresję kliniczną choroby.
25 bp
Analiza DNA w celu wykrycia
A
n
a
l
i
z
a
D
N
A
w
c
e
l
u
w
y
k
r
y
c
i
a
delecji w genie SMN1
d
e
l
e
c
j
i
w
g
e
n
i
e
S
M
N
1
Analiza sekwencji obu kopii genów SMN ujawniła
Ryc. 2. Schemat poszukiwania delecji w genie SMN1. Analiza obejmuje:
R
y
c
.
2
.
5 jednonukleotydowych różnic, po jednej w eksonach
amplifikację eksonów 7 genów SMN1 i SMN2, trawienie otrzymanych pro-
7 i 8, pozostałe 3 w intronach 6 i 7. Różnice sekwencji duktów enzymem restrykcyjnym DraI i ich elektroforetyczny rozdział. Elek-
troforetyczne S
cieżki 1, 3, 4 i 6  osoby zdrowe, 2 i 5  osoby chore, 7 
eksonów 7 zostały wykorzystane do odróżnienia genów
kontrola negatywna (bez DNA), 8  standard wielkoS
ci (100 bp DNA Lad-
SMN1 i SMN2  odpowiednio brak lub obecnoS
ć
der GibkoBRL). Brak prążka 188 bp jest przejawem delecji eksonu 7 genu
miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
SMN1
DraI. Występująca w obu allelach osoby chorej homo-
zygotyczna delecja powoduje brak produktów reakcji
PCR amplifikacji eksonu 7 kopii genu SMN1, a zatem kiwaniu homodelecji genu SMN1 w DNA wyizolowa-
wS
ród produktów PCR brak jest fragmentu nieulega- nym z komórek trofoblastu lub amniocytów.
jącego trawieniu. W obrazie elektroforetycznym brak
jest w takim przypadku największego prążka (ryc. 2.).
PiS
miennictwo
P
i
S

m
i
e
n
n
i
c
t
w
o
1. Hausmanowa-Petrusewicz I. Choroby mięS
ni. Wyd. III. Wy-
Diagnostyka prenatalna SMA
D
i
a
g
n
o
s
t
y
k
a
p
r
e
n
a
t
a
l
n
a
S
M
A
dawnictwo Naukowe PWN, 1993.
2. Suzuki A., Yoshida M., Hayashi K., i wsp. Molecular organiza-
Diagnostyka prenatalna, podobnie jak molekularna
tion at the glycoprotein-complex-binding site of dystrophin. Eur
weryfikacja rozpoznania klinicznego, polega na poszu- J Biochem 1994; 220: 283-292.
S 759
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Janusz G. Zimowski
3. Monaco A.P., Bertelson C.J., Liechti-Gallati S. i wsp. An expla-
nation for the phenotypic differences between patients bearing
partial deletions of the DMD locus. Genomics 1988; 2: 90-95.
4. Pearn J. Classification of spinal muscular atrophies. Lancet
1980; 1: 919-922.
5. Lefebvre S., Burglen L., Reboullet S. i wsp. Identification and
characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.
Cell 1995; 80: 155-165.
6. Burghes AHM. When is a deletion not a deletion? When it is
coverted. Am J Hum Genet 1997; 61: 9-15.
S 760 Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
KURS NR 13  WYKŁAD 2
Analiza DNA w chorobach neurodegeneracyjnych
spowodowanych mutacjami dynamicznymi
Anna Sułek
Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
Mutacje dynamiczne powodujące zwielokrotnienie Allele, w których została przekroczona granica pra-
liczby powtórzeń mikrosatelitarnych są przyczyną wie- widłowego zakresu powtórzeń mikrosatelitarnych, wy-
lu chorób zwyrodnieniowych oS
rodkowego układu krywa się u osób chorych. Przyczyną dalszego zwięk-
nerwowego. Należą do nich m.in. choroba Huntingto- szania się liczby powtórzeń z pokolenia na pokolenie
na (HD), grupa ataksji rdzeniowo-móżdżkowych jest ich niestabilnoS
ć w gametogenezie. W wielopoko-
(SCA), rdzeniowo-opuszkowy zanik mięS
ni (SBMA), leniowych rodzinach z HD lub ataksją rdzeniowo-
zespół łamliwego chromosomu X i dystrofie mioto- -móżdżkową może się zdarzyć, że liczba powtórzeń
niczne (DM1 i DM2). NajczęS
ciej spotykane są po- CAG osiągnie nawet kilkaset, co jest powodem wystą-
wtórzenia trójnukleotydowe, które mogą być zlokalizo- pienia objawów chorobowych we wczesnym dzieciń-
wane zarówno w kodujących częS
ciach genów (HD, stwie i ciężkiego przebiegu choroby. Zjawisko to, cha-
SCA 1, 2, 3, 6, 7, 17, SBMA), jak i w regionach nie- rakterystyczne dla większoS
ci typów ataksji rdzeniowo-
ulegających translacji (FRAX, DM, SCA8, SCA12). -móżdżkowych, choroby Huntingtona i dystrofii mio-
Powtórzenia mikrosatelitarne są polimorficzne pod tonicznej, okreS
la się mianem antycypacji. Jest to więc
względem ich liczby, która występuje w charaktery- coraz wczeS
niejszy początek choroby oraz coraz cięż-
stycznym dla każdego genu zakresie. Zwielokrotnienie szy jej przebieg w kolejnych pokoleniach.
liczby powtórzeń i przekroczenie tego zakresu leży W niektórych genach obserwuje się występowanie
u podstaw tzw. mutacji dynamicznych oraz procesu tzw. alleli poS
rednich (intermediate alleles), w których
chorobowego. Zmiana liczby powtórzeń trójnukleoty- liczba powtórzeń wykracza poza prawidłowy zakres,
dowych polega zazwyczaj na ich zwiększeniu (amplifi- ale nie powoduje jeszcze wystąpienia objawów choroby.
kacji); niekiedy ulega jednak zmniejszeniu (kontrak- Allele poS
rednie mają jednak mniejszą stabilnoS
ć i ist-
cji). Dokładny mechanizm zwiększania liczby powtó- nieje duże prawdopodobieństwo, że podczas kolejnej
rzeń trójnukleotydowych nie jest do końca poznany. transmisji ulegną dalszemu wydłużeniu, osiągając za-
Wiadomo, że obszary DNA zawierające trójnukle- kres chorobotwórczy.
otydowe powtórzenia (CAG)n* (CTG)n oraz Ataksje rdzeniowo-móżdżkowe typu 1, 2, 3, 6, 7, 17
(CGG)n* (CCG)n mogą tworzyć trójniciowe, a nawet wraz z HD i SBMA należą do poliglutaminopatii po-
czteroniciowe struktury zaburzające procesy replikacji, wodowanych mutacjami dynamicznymi  ze zwiększe-
naprawy i rekombinacji DNA. Jedną z hipotez tłuma- niem liczby powtórzeń CAG w otwartej ramce odczytu,
czących znaczne zwiększanie liczby powtórzeń trójnu- co prowadzi do wydłużenia ciągu poliglutaminowego
kleotydowych jest tzw. S
lizganie się polimerazy DNA w kodowanym przez dany gen białku. Obszary oS
rod-
podczas replikacji. kowego układu nerwowego objęte zmianami to przede
Dla każdego z genów ustalono specyficzny, prawi- wszystkim głębokie warstwy kory móżdżku, jądra pod-
dłowy zakres powtórzeń CAG, w którym ciąg CAG stawy mózgu, pnia mózgu, jądro zębate, komórki Pur-
jest stabilny, tzn. nie wykazuje tendencji do ekspansji. kinjego oraz rdzeniowe i opuszkowe neurony motorycz-
Nie przekracza on z reguły 40 powtórzeń CAG. Jed- ne. Jednakże związek pomiędzy zwiększoną liczbą reszt
nak allele z dużą, graniczną liczbą powtórzeń CAG glutaminowych w białku a zwyrodnieniem swoistych ko-
mogą tracić stabilnoS
ć i ulegać ekspansji, co jest rów- mórek nerwowych nie został do końca wyjaS
niony.
noznaczne z powstawaniem mutacji de novo; zostało to Procesy patogenetyczne, prowadzące do neurode-
zaobserwowane w HD i SCA3. generacji, mają prawdopodobnie związek z przyjęciem
S 761
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Anna Sułek
przez wydłużone łańcuchy poliglutaminowe konfor- reakcja PCR jest niewystarczająca i konieczne staje się
macji nietypowej dla białek, w których się znajdują. zastosowanie modyfikowanych metod z użyciem starte-
Nie powoduje to całkowitej utraty aktywnoS
ci tych bia- rów, z których jeden jest specyficzny dla danego genu,
łek, a raczej wpływa na zmianę ich funkcji i wiąże się a drugi dla sekwencji mikrosatelitarnej. Ta metoda nie
z tendencją do tworzenia charakterystycznych inkluzji, umożliwia jednak okreS
lenia liczby powtórzeń, więc
głównie w jądrach neuronów. W inkluzjach tych w przypadkach, w których jest to niezbędne, stosuje się
stwierdza się także obecnoS
ć różnych innych białek po- technikę hybrydyzacji (Southern blot).
za fragmentami poliglutaminowymi. W chorobach o dziedziczeniu autosomalnym do-
Diagnostyka molekularna chorób powodowanych minującym prawdopodobieństwo zachorowania dzieci
mutacjami dynamicznymi polega na analizie DNA chorego rodzica wynosi 50%. Wykorzystanie badań
prowadzącej do ustalenia liczby powtórzeń mikrosateli- molekularnych w diagnozowaniu chorób neurodege-
tarnych w genach związanych z występowaniem po- neracyjnych ma duże znaczenie w poradnictwie gene-
szczególnych ww. chorób. Potwierdzenie diagnozy kli- tycznym. Pacjentowi i jego rodzinie można zapropo-
nicznej i okreS
lenie typu choroby jest możliwe, gdy wy- nować następujące rodzaje badań:
każe się, że liczba powtórzeń mikrosatelitarnych w jed- " badanie diagnostyczne  poszukiwanie mutacji dy-
nym z badanych genów przekracza prawidłowy zakres. namicznych w genach związanych z występowaniem
Wskazaniem do analizy DNA u pacjentów z obja- klinicznych objawów choroby,
wami choroby powinien być pozytywny wywiad ro- " badanie przedobjawowe  wykonywane na życzenie
dzinny wskazujący na dominujący sposób dziedzicze- pełnoletnich osób z rodziny, w której wczeS
niej na
nia lub recesywny sprzężony z płcią w przypadku podstawie badań molekularnych u probanta ustalo-
SBMA i zazwyczaj póx
ny wiek zachorowania. Dane no rozpoznanie choroby,
o pacjencie powinny obejmować szczegółowy wywiad " badania prenatalne  analiza DNA płodu, jeS
li
rodzinny oraz opis badania fizykalnego  ogólnego u jednego z rodziców stwierdzono uprzednio wystę-
i neurologicznego. Ze względu na podobieństwo obja- powanie ekspansji powtórzeń mikrosatelitarnych.
wów klinicznych, występujących we wszystkich posta-
ciach ataksji rdzeniowo-móżdżkowych (z wyjątkiem
SCA7), ustalenie dokładnego rozpoznania jest możli-
we wyłącznie na podstawie badań molekularnych.
Obecnie badania DNA umożliwiają diagnostykę
HD, SBMA oraz 7 postaci autosomalnych dominują-
cych ataksji rdzeniowo-móżdżkowych: SCA1, SCA2,
SCA3, SCA6, SCA7, SCA12, SCA17, jak również
dystrofii miotonicznej.
Analiza DNA oparta jest na wykorzystaniu reakcji
PCR z użyciem starterów specyficznych dla danego ge-
nu, zlokalizowanych tak, aby amplifikacja obejmowała
region zawierający powtórzenia mikrosatelitarne. Do
wizualizacji wykorzystuje się znaczniki radioizotopowe
lub fluorescencyjne. Następnym etapem jest rozdział
elektroforetyczny otrzymanych produktów reakcji
w żelach poliakrylamidowych i ocena wielkoS
ci tych
produktów z odniesieniem do standardu wielkoS
ci.
Uzyskaną liczbę powtórzeń porównuje się z charakte-
rystycznym dla badanego genu prawidłowym zakre-
sem. W przypadku powtórzeń mikrosatelitarnych zlo-
kalizowanych w niekodujących regionach genu obser-
wowany stopień niestabilnoS
ci może być znacznie więk-
szy i mutacje dynamiczne mogą prowadzić do ekspan-
sji liczących kilkaset, a nawet kilka tysięcy powtórzeń
(dotyczy to dystrofii miotonicznej). Wówczas klasyczna
S 762 Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
KURS NR 13  WYKŁAD 3
Zastosowanie techniki PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce nosicielstwa
rdzeniowego zaniku mięS
ni (SMA) oraz przypadków bez delecji w genie SMN1
Maria Jędrzejowska
Zespół Badawczy Chorób Nerwowo-MięS
niowych, Instytut Medycyny DoS
wiadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa
Dosiebny dziecięcy i młodzieńczy rdzeniowy zanik W tym samym regionie chromosomu 5q występuje
mięS
ni (spinal muscular atrophy  SMA) jest chorobą ge- drugi, niemal identyczny gen SMN2. Jego obecnoS
ć
netycznie uwarunkowaną, dziedziczoną jako cecha auto- łagodzi objawy SMA, z drugiej strony utrudnia ocenę
somalna recesywna. W przebiegu choroby dochodzi do stanu nosicielstwa zmutowanego genu i identyfikację
utraty motoneuronów rdzenia kręgowego, co w konse- przypadków związanych z mutacjami punktowymi.
kwencji prowadzi do postępującego niedowładu i zani- JednorodnoS
ć defektu molekularnego sprawiła, że ba-
ku mięS
ni. CzęstoS
ć występowania SMA szacuje się 1 na danie obecnoS
ci delecji w genie SMN1 stało się badaniem
7 10 tys. urodzeń, co odpowiada częstoS
ci nosicielstwa podstawowym w diagnostyce SMA. W badaniu tym,
zmutowanego genu od 1 na 42 do 1 na 50 osób. opartym na technice PCR i trawieniu enzymem restryk-
Genem, którego mutacje determinują wystąpienie cyjnym, wykorzystana jest jednonukleotydowa różnica
objawów choroby, jest gen SMN1 (5q11.2) (survival of pomiędzy genem SMN1 i SMN2 w sekwencji ekso-
motor neuron gene, gen warunkujący przeżycie motoneu- nu 7 [2]. Badanie nie daje jednak możliwoS
ci okreS
lenia
ronów). W polskiej populacji chorych 96,6% tych mu- liczby uszkodzonych alleli, a tym samym identyfikacji
tacji stanowi obualleliczna delecja eksonu 7 [1]. W ok. osób z delecją tylko na jednym allelu (nosicieli). Nie da-
2 3% przypadków za objawy choroby odpowiedzialne je także możliwoS
ci identyfikacji chorego z delecją na
są mutacje punktowe, występujące w układzie heterozy- jednym allelu i mutacją punktową na drugim. W obu
gotycznym z delecją. W pozostałym odsetku podłoże przypadkach uzyskiwany wynik jest tożsamy z wyni-
genetyczne choroby nie jest znane. kiem badania osoby zdrowej, która nie jest nosicielem
1 2 3 M
1
2
3
M
500bp
5
0
0
b
p
SMN2
300bp
3
0
0
b
p
SMN2
SMN1
150bp
1
5
0
b
p
SMN1
SMN1 SMN2 SMN1 SMN2
SMN1 SMN2
SMN2 SMN2
SMN1 SMN2
A B C
Ryc. 1. Obraz elektroforezy na żelu agarozowym produktów amplifikacji eksonu 7 genu SMN1, trawionych enzymem restrykcyjnym DraI: 1  pacjent (widoczny je-
R
y
c
.
1
.
dynie fragment odpowiadający kopii centromerowej genu), 2  osoba zdrowa (obecna kopia genu SMN1 i SMN2); identyczny wynik uzyskamy u nosiciela choroby
i u osoby chorej, której objawy wywołane są obecnoS
cią mutacji punktowej
S 763
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Maria Jędrzejowska
(ryc. 1.). Podobieństwo genów SMN1 i SMN2 utrud- Istotną wadą iloS
ciowego PCR jest możliwoS
ć uzy-
nia także interpretację wyników sekwencjonowania. skania wyniku fałszywie ujemnego. Według badań nie-
W trakcie namnażania matrycy amplifikują się obie ko- mieckich na ok. 2% alleli występują 2 kopie genu
pie genu i obie są równoczeS
nie sekwencjonowane. Dla- SMN1 (4). JeS
li zatem badana osoba będzie miała na
tego tak trudna jest identyfikacja mutacji punktowych. jednym allelu delecję, a na drugim duplikację genu
Wymaga ona właS
ciwie stosowania RT-PCR, techniki SMN1, wynik badania iloS
ciowego okaże się fałszywie
rzadko używanej w procedurach diagnostycznych. ujemny. Badanie to nie daje także możliwoS
ci identyfi-
Nowe możliwoS
ci badania nosicielstwa pojawiły się kacji nosicielstwa mutacji punktowych. Przedstawione
w momencie opracowania techniki iloS
ciowej  real-ti- problemy interpretacyjne obniżają czułoS
ć metody ilo-
me PCR (PCR w czasie rzeczywistym) [3]. Dzięki S
ciowej o ok. 5 6%.
iloS
ciowej ocenie produktu reakcji PCR metoda ta sta- Badania nosicielstwa w SMA prowadzone są
je się doskonałym narzędziem w ocenie dawki genu. w Polsce od tego roku, w ramach badań naukowych.
Podstawowym parametrem ocenianym w tej metodzie Istnieje wielka potrzeba, by badanie to przeszło do
jest CT (threshold cycle, cykl progowy)  cykl, w którym standardów diagnostycznych. Brak badania nosiciel-
reakcja PCR zachodzi w sposób liniowy, a tym samym stwa w rodzinach wysokiego ryzyka SMA rodzi bo-
liczba powstałych w tym okresie cząsteczek jest wprost wiem poważne problemy w poradnictwie genetycz-
proporcjonalna do wyjS
ciowej liczby cząsteczek. Po- nym. W przypadku rodziców  niemal obligatoryj-
równując różnicę CT badanego genu (SMN1) i genu nych nosicieli, ryzyko powtórzenia choroby wynosi
reporterowego o stałej znanej liczbie kopii (RN-asa) 25%. W przypadku zdrowego rodzeństwa ryzyko wy-
do różnicy CT genu wzorcowego (znana liczba kopii stąpienia choroby u ich potomstwa wynosi od 1:200 do
SMN1) i genu reporterowego możemy ocenić dawkę 1:300 (w zależnoS
ci od częstoS
ci nosicielstwa w popu-
badanego genu (1 lub 2 kopie) (ryc. 2.). lacji  1:34 1:50). Nie jest ono wysokie, ale wyższe
ObecnoS
ć dwukrotnie obniżonej liczby kopii niż populacyjne. Podwyższone ryzyko wystąpienia
SMN1 (jedna kopia) w porównaniu z kontrolą (dwie choroby u potomstwa wpływa na decyzje prokreacyjne
kopie) S
wiadczy o nosicielstwie SMA. rodzin. W przypadku aberracji chromosomowych ta-
Metodykę powyższego badania przedstawiono na kie ryzyko oceniane jest jako wskazanie do badania
łamach Neurologii i Neurochirurgii Polskiej w bieżącym prenatalnego. Wykluczenie nosicielstwa u członków
roku [1]. rodzin czy u partnera nosiciela choroby ułatwia porad-
RN-aza RN-aza
R
N
-
a
z
a
R
N
-
a
z
a
SMN1 SMN1
S
M
N
1
S
M
N
1
"CT8
"
C
8
T
"CT7
"
C
7
T
SMN1 SMN2 SMN1 SMN2
SMN1 SMN2
SMN2
A B
nie-nosiciel
n
i
e
-
n
o
s
i
c
i
e
l
nosiciel
n
o
s
i
c
i
e
l
Ryc. 2. Wynik amplifikacji genu SMN1 metodą real-time PCR zdrowej kontroli i nosiciela. Różnica jednego cyklu w "CT między badanymi osobami S
wiadczy o dwu-
R
y
c
.
2
.
krotnie mniejszej iloS
ci produktu PCR w przypadku B, a zatem dwukrotnie mniejszej dawce genu, co jest równoznaczne ze stwierdzeniem stanu nosicielstwa
S 764 Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Zastosowanie techniki PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce nosicielstwa rdzeniowego zaniku mięS
ni (SMA) oraz przypadków bez delecji w genie SMN1
nictwo genetyczne, a osoby z rodzin ryzyka nie stają
przed koniecznoS
cią podejmowania trudnych decyzji
dotyczących badań prenatalnych. Badanie nosicielstwa
rozwiązuje także problem małżeństw, których dziecko
zmarło z podejrzeniem SMA, a nie wykonano diagno-
styki molekularnej.
Technika real-time PCR może zostać wykorzystana
jako przesiewowa metoda poszukiwania mutacji punk-
towych u pacjentów niewykazujących homozygotycz-
nej delecji w genie SMN1. Uzyskiwany wynik badania
molekularnego opartego na technice PCR weryfikuje
96,6% przypadków SMA. W pozostałych przypad-
kach wynik jest nieinformatywny. Brak homozygotycz-
nej delecji nie potwierdza, ale i nie wyklucza choroby.
Za objawy mogą być odpowiedzialne mutacje punkto-
we, nieidentyfikowane w badaniu przesiewowym.
Stwierdzenie obniżonej liczby kopii genu SMN1
u chorego bez obuallelicznej delecji sugeruje udział
mutacji punktowej w patogenezie choroby (układ he-
terozygotyczny mutacji punktowej i delecji) i jest
wskazaniem do poszerzenia diagnostyki molekularnej.
PiS
miennictwo
P
i
S

m
i
e
n
n
i
c
t
w
o
1. Jędrzejowska M., Wiszniewski W., Zimowski J. i wsp. Applica-
tion of a rapid non-invasive technique in the molecular diagno-
sis of spinal muscular atrophy (SMA). Neurol Neurochir Pol
2005; 39: 89-94.
2. Van der Steege G., Grootscholten P., Van der Vlies P. i wsp.
PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal
recessive spinal muscular atrophy. Lancet 1995; 345: 985-986.
3. http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html
4. Feldkotter M., Schwarzer V., Wirth R. i wsp. Quantitative ana-
lyses of SMN1 and SMN2 based on real time light Cycler PCR:
fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity
of spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet 2002; 70: 358-368.
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3) S 765
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
KURS NR 13  WYKŁAD 4
Wykorzystanie metod analizy DNA w ataksji Friedreicha
Tomasz Mazurczak1, Dorota Hoffman-Zacharska2, Anna Sułek3
1
Klinika Neurologii, Epileptologii i Zaburzeń Snu u Dzieci i Młodzieży, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie
2
Pracownia Neurogenetyki, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie
3
Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii w Warszawie
Ataksja Friedreicha (Friedreich ataxia, FRDA) ry Late Onset Friedreich Ataxia) czy FARR (Friedreich
(MIM 229300) jest postępującą chorobą wieloukłado- Ataxia with Retained Reflexes)  charakteryzują się
wą, dziedziczącą się jako cecha autosomalna recesyw- mniejszą liczbą powtórzeń [1,3,4]. Poznanie defektu
na. Choroba ujawnia się zazwyczaj przed okresem doj- molekularnego prowadzącego do wystąpienia FRDA
rzewania. Jest jedną z najczęstszych form ataksji dzie- umożliwiło opracowanie zasad diagnostyki molekular-
dzicznych. CzęstoS
ć występowania FRDA w populacji nej tej choroby. Ma to istotne znaczenie zarówno dla
kaukaskiej szacuje się na 1:50 000, a częstoS
ć nosiciel- weryfikacji rozpoznania klinicznego i opracowania
stwa zmutowanego genu na 1:90 [1,3,4]. Kryteria dia- optymalnego programu terapeutycznego dla chorego,
gnostyczne FRDA obejmują: ujawnienie się choroby jak również objęcia jego rodziny poradnictwem gene-
przed 25. rokiem życia, bezład kończyn i tułowia, za- tycznym. Obecnie rutynowa diagnostyka FRDA opie-
nik odruchów głębokich w kończynach dolnych, objaw ra się na zastosowaniu reakcji łańcuchowej polimerazy
Babińskiego, znaczne zwolnienie szybkoS
ci lub brak (PCR), która jest uzupełniana metodą hybrydyzacyj-
przewodzenia we włóknach czuciowych przy prawidło- ną. Stwierdzenie braku produktu w standardowej reak-
wym przewodzeniu we włóknach ruchowych kończyn cji PCR wskazuje na obecnoS
ć ekspansji na dwóch al-
górnych, zaburzenia mowy. Ponadto stwierdza się lelach genu. Metoda ta nie pozwala jednak na rozróż-
skrzywienie boczne kręgosłupa, zanik odruchów głę- nienie homozygot dla alleli prawidłowych od heterozy-
bokich w kończynach górnych, kardiomiopatię przero- gotycznych nosicieli. Do wykrywania obecnoS
ci dłu-
stową, nieprawidłowe EKG, zniekształcenie stóp, za- gich alleli stosuje się metodę long PCR, która jednak
nik nerwów wzrokowych, głuchotę, zaniki mięS
niowe, może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie
zez obuoczny oraz cukrzycę [4]. Wystąpienie FRDA dodatnich. Raport z Programu kontroli jakoS
ci diagnosty-
związane jest z mutacjami w obrębie położonego na ki FRDA, który został przeprowadzony w 2002 r.
chromosomie 9q13 genu FRDA1 (MIM 606829), ko- przez EMQN (European Molecular Genetics Quality
dującego frataksynę  białko pełniące istotną rolę w re- Network), wskazywał na błąd genotypowania heterozy-
gulacji transportu jonów żelaza w mitochondrium. got na poziomie 11,7%. Wyniki te potwierdziły ko-
U 96% pacjentów jest to tzw. mutacja dynamiczna  niecznoS
ć wprowadzenia dodatkowych procedur dia-
ekspansja powtórzeń GAA w pierwszym intronie ge- gnostycznych. Metodą z wyboru weryfikacji takich
nu, na obu jego allelach. W przypadku 4% pacjentów wyników jest zastosowanie hybrydyzacji metodą
są to współistniejące z ekspansją powtórzeń mutacje Southerna, która jako technika pracochłonna i długo-
punktowe na drugim allelu genu [1,3]. Zróżnicowanie trwała, a przy niezbyt dużej liczbie pacjentów kosztow-
obrazu klinicznego u chorych z ekspansją trypletów na, nie jest powszechnie stosowana. Opracowanie no-
[GAA]n w układzie homozygotycznym jest wynikiem wych technik PCR do analizy obszarów o dużej liczbie
polimorfizmu powtórzeń w zakresie patogennym. Za- powtórzeń trójnukleotydowych TP-PCR (zastosowa-
kres powtórzeń u pacjentów waha się w granicach nie primerów specyficznych do rejonów flankujących
66 1 700, przy czym w najczęS
ciej występującej posta- powtórzenia GAA) znacznie usprawnia diagnostykę
ci FRDA wynosi zazwyczaj 200 1 700. Rzadsze po- rutynową i pozwala na szybkie okreS
lenie nosicielstwa
stacie FRDA, ujawniające się w póx
niejszym okresie ekspansji u krewnych probanta z FRDA. Pozwala też
życia (po 25. roku życia)  LOFA/VLOFA (Late/Ve- na wyodrębnienie grupy pacjentów, u których mogą
S 766 Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a
Wykorzystanie metod analizy DNA w ataksji Friedreicha
występować mutacje punktowe na jednym z alleli. Dla-
tego też ta metoda zaczyna być wprowadzana jako ba-
danie uzupełniające, umożliwiające szybkie i efektyw-
ne wyszukiwanie nosicieli ekspansji powtórzeń
[GAA]n [2,5]. Celem prezentowanej pracy jest cha-
rakterystyka defektu molekularnego u pacjentów skie-
rowanych do Poradni Genetycznej i Kliniki Neurolo-
gii IMiDz z rozpoznaniem FRDA oraz ich krewnych.
PiS
miennictwo
P
i
S

m
i
e
n
n
i
c
t
w
o
1. Campuzano V., Montermini L., Molto M.D. i wsp. Friedreich s
ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA
triplet repeat expansion. Science 1996; 271: 1423-1427.
2. Ciotti P., DiMaria E., Bellone E. i wsp. Triplet repeat primed
PCR (TP PCR) in molecular diagnostic testing for Friedreich
ataxia. J Mol Diagn 2004; 6: 285-289.
3. De Michele G., Filla A. Cavalcanti F. The correlation of clini-
cal phenotype in Friedreich ataxia with the site of point mutation
in the FRDA gene. Neurogenetics 1998; 1: 253-257.
4. Harding A.E. Friedreich s ataxia: a clinical and genetic study of
90 families with an analysis of early diagnostic criteria and intra-
familial clustering of clinical features. Brain 1981; 104: 589-620.
5. Schmitt M., Warner J., Barron L. i wsp. Detection of large
(GAA) n repeat expansions by fluorescent PCR. European So-
ciety for Human Genetics, 2000. Poster presentation.
S 767
Neurologia i Neurochirurgia Polska 2005; 39, 4 (supl. 3)
N
e
u
r
o
l
o
g
i
a
i
N
e
u
r
o
c
h
i
r
u
r
g
i
a
P
o
l
s
k
a