Tom 57 2008
Numer 1 2 (278 279)
Strony 29 38
Katarzyna BaranowsKa, anna rodziewicz
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
C.K. Norwida 25, Wrocław
E-mail: [e-mail]
MOLEKULARNE INTERAKCJE W BIOFILMACH BAKTERYJNYCH
WPROWADZENIE
Większość bakterii, zarówno saprofi- W jej skład wchodzą polisacharydy, biał-
tycznych, jak i patogennych, w warunkach ka, peptydy, kwasy nukleinowe, czÄ…steczki
naturalnych tworzy biofilmy (błony biolo- sygnalizacyjne oraz związki organiczne i
giczne, biowarstwy). Pod względem morfo- nieorganiczne pochodzące ze środowiska
logicznym wyróżnia się trzy typy budowy powstawania błony biologicznej. Komórki
błon biologicznych. Pierwszy z nich to pła- bakterii związane w warstwach biofilmu
ska, dwuwymiarowa i homogenna struktu- tworzą mikrokolonie, które różnią się feno-
ra, która tworzy się na przykład na płytce typowo i genetycznie od swobodnie żyją-
nazębnej. Drugi to  piętrowy układ mikro- cych. Mikroorganizmy mogą tworzyć błony
kolonii, otoczonych zewnątrzkomórkowymi biologiczne na wielu odmiennych podło-
związkami polimerów. Pod  kolumnami żach, zarówno wewnątrz żywych organi-
utworzonymi przez bakterie znajduje się zmów, np. na błonie śluzowej narządów
warstwa mikroorganizmów bezpośrednio wewnętrznych, na implantach, na tkankach
związanych z powierzchnią adhezji, o gru- roślin, jak i na powierzchniach abiotycz-
bości około 5 źm. Taki układ biofilmu na- nych jakimi są naturalne systemy wodne,
zywany jest  modelem heterogennej mozai- skały w strumieniach będące w kontakcie
ki , którą najczęściej wytwarzają bakterie z wodą czy rury kanalizacyjne (donlan
patogenne, m.in.: Pseudomonas aeruginosa 2002, o Toole 2003, czaczyK i wojcie-
czy Escherichia coli. Trzecim, najbardziej chowsKa 2003). Ponadto biofilmy mogÄ…
złożonym modelem biowarstwy, jest  model powstawać na granicy faz ciecz/powietrze
grzyba . Bakterie wytwarzają zbiorowiska poprzez wzajemną adhezję komórek (Mori-
mikrokolonii, które kształtem przypominają Kawa 2006). Istotną funkcję w tworzeniu i
grzyb. Pomiędzy poszczególnymi struktura- prawidłowym funkcjonowaniu biofilmu peł-
mi znajdują się kanały wypełnione płynem nią niskocząsteczkowe związki sygnałowe,
(kanaliki wodne), łączące wnętrze biofilmu za pomocą których poszczególne komórki
ze środowiskiem, w którym się znajduje. kontaktują się między sobą. Zdolność do
Jedną z funkcji kanalików jest rozprowa- wytwarzania biofilmów posiada wiele ga-
dzanie w obrębie biofilmu tlenu oraz skład- tunków mikroorganizmów, wśród których
ników odżywczych. Jest to również droga wyróżnia się: bakterie, promieniowce, droż-
dostępu dla substancji o działaniu antymi- dże oraz grzyby strzępkowe. Znane są tak-
krobiologiczym (Baj i MarKiewicz 2006). że biofilmy tworzone przez algi czy ameby,
Ważnym składnikiem błon biologicznych jednakże najwięcej uwagi poświęcono bak-
jest EPS (ang. extracellular polymeric sub- teriom, ze względu na ich znaczenie oraz
stances), wieloskładnikowa macierz (ang. powszechne występowanie w wielu środo-
matrix) otaczajÄ…ca mikrokolonie biofilmu. wiskach.
Katarzyna BaranowsKa, anna rodziewicz
30
ODDZIAA
YWANIA BAKTERII Z POWIERZCHNI
ICH ADHEZJI
Przekształcenie formy bytowania bakterii, nych na zasadzie syntrofii. W piątym etapie
ze swobodnie żyjących do uwięzionych (im- niektóre bakterie opuszczają biofilm w celu
mobilizowanych) wewnÄ…trz biofilmu, powiÄ…- utworzenia nowych skupisk poprzez koloni-
zane jest z adhezjÄ…, zmianami genotypowymi zacjÄ™ innych powierzchni (ang. detachment).
i metabolicznymi. Zmieniony fenotyp odpo- Vuong i współaut. (2003) wyizolowali auto-
wiada za szczególną odporność mikroorga- lizynę AtlE regulującą pierwszy etap adhezji.
nizmów na czynniki antydrobnoustrojowe. Zawiera ona w swojej strukturze powtarzalną
Nadal istnieje wiele niejasności co do prze- sekwencję aminokwasów, która prawdopo-
biegu tych procesów. dobnie oddziałuje hydrofobowo z abiotyczną
Model biofilmu bakteryjnego został opra- powierzchnią. Białko AtlE zawiera dwie do-
cowany na przykładzie bakterii Pseudomo- meny o aktywności enzymatycznej: amidazo-
nas sp. Proces formowania tej struktury roz- wÄ… oraz N-acetyloglukoamidazowÄ….
poczyna się od  rozpoznania i wstępnego Większość bakterii wytwarza adhezyny,
przytwierdzenia do powierzchni pojedyn- które stymulują powierzchniowe przylega-
czych komórek. Następnie mikroorganizmy nie komórek, co jest warunkiem niezbędnym
tworzą bardziej złożone zespoły i wytwarzają do utworzenia biofilmu. Adhezyny mają cha-
egzopolimeryczną macierz. Proces tworzenia rakter białkowy, sacharydowy lub kwasowy
oraz dojrzewania biofilmu uzależniony jest (kwasy tejchojowe, sjalowe). Ich receptora-
między innymi od dostępności tlenu, wielko- mi są zwykle glikoproteiny lub glikolipidy.
ści ciśnienia osmotycznego i pH środowiska. W interakcjach tych uczestniczą również ka-
Wyróżnia się dwa zasadnicze etapy formowa- tiony. Przykładem adhezyn są cząsteczki PIA
nia biofilmu bakteryjnego: pierwotnÄ… adhezjÄ™ (ang. polysaccharide intracellular adhesin)
bakterii do podłoża (ang. docking) oraz wtór- wytwarzane przez bakterie Staphylococcus
nÄ… adhezjÄ™ (ang. locking). Pierwszy etap jest epidermis. Adhezyna PIA zbudowana jest z
odwracalny, uwarunkowany wieloma czynni- 130 reszt ²-1,6-GlcNAc (²-1,6-N-acetylo-D-glu-
kami fizyko-chemicznymi, przekładającymi się kozaminy), co stanowi 80-85 % jej cząsteczki,
na interakcje pomiędzy powierzchnią bakterii oraz z frakcji anionowej, którą tworzą nie-
a kolonizowanÄ… powierzchniÄ…. W poczÄ…tko- acetylowane reszty D-glukozoaminy, zawiera-
wej fazie tego etapu mikroorganizmy muszÄ… jÄ…ce fosforan i reszty bursztynianu. Syntety-
zbliżyć się na odpowiednio bliską odległość zowana jest ona przy udziale UTP. Adhezyna
do podłoża, zwykle około 1 nm. Ostatecznie ta odpowiedzialna jest za drugi etap adhezji
o adhezji komórek do powierzchni decyduje komórek do powierzchni (shirtliff i współ-
suma oddziaływań elektrostatycznych i hydro- aut. 2002).
fobowych, pokonanie sferycznych przeszkód, Oprócz białkowych adhezyn, w proce-
sił Van der Waalsa, temperatura i oddziaływa- sie tworzenia biofilmu duże znaczenie mają
nia hydrodynamiczne (dunne 2002). W dru- również inne białka nazwane cząsteczkami
gim etapie, na skutek oddziaływań między- sygnałowymi. Wyłączenie genów kodujących
komórkowych i środowiskowych, następuje niektóre z nich powoduje utratę zdolności
nieodwracalne związanie komórek drobno- do wytwarzania biofilmu. o Toole i Kolter
ustrojów z powierzchnią. W tej fazie tworze- (1998) zbadali zdolność wytwarzania bio-
nia biofilmu luz
no zwiÄ…zane mikroorganizmy filmu przez P. fluorescens na powierzchni
rozpoczynają produkcję EPS, a wolno żyjące abiotycznej. W początkowym stadium bak-
bakterie przyłączają się do nowopowstającej terie syntetyzowały pozakomórkowe białka,
struktury. Interesujący jest fakt, że powstanie które miały wpływ na interakcje zachodzące
specyficznego skupiska jednego gatunku mi- pomiędzy przyłączającymi się mikroorgani-
kroorganizmów stymuluje adhezję innych. zmami a powierzchnią abiotyczną. Badacze
watnicK i Kolter (2000) wyróżnili dal- ci wyizolowali mutanty niezdolne do aktyw-
sze trzy etapy formowania bakteryjnego bio- nej adhezji do podłoża (mutanty genu sad
filmu. W etapie trzecim bakterie przekazujÄ… znajdujÄ…cego siÄ™ na transpozomie). Analiza
sygnały stymulujące przyłączone mikroorga- molekularna mutantów sad wykazała istot-
nizmy do rozmnażania i tworzenia mikroko- ną rolę białka Clp w formowaniu właściwej
loni. W czwartym etapie powstaje EPS, a gra- struktury biofilmu (Clp  proteaza cytopla-
dienty chemiczne umożliwiają współistnienie zmatyczna). Białko to jest syntetyzowane
drobnoustrojów różnych gatunków oraz znaj- przez komórki bakteryjne w odpowiedzi na
dujących się w różnych stadiach metabolicz- różnorodne sygnały pochodzące z otoczenia.
Molekularne interakcje w biofilmach bakteryjnych
31
Czynnikiem hamującym produkcję białka Clp do ruchu mutanty E. coli, stymulowane przez
jest tetracyklina (tc). Jej obecność hamowała allel genu ompR, produkowały adhezyny po-
rozwój biofilmu P. fluorescens, jednak doda- wierzchniowe. Ponadto uszkodzenia w ge-
nie tetracykliny po 30 min od zapoczątkowa- nie kodującym ruch rzęskowy P. fluorescens
nia procesu adhezji komórek, nie miało już mogą być cofnięte poprzez hodowle bakterii
wpływu na formowanie się biowarstwy ko- na podłożu z cytrynianem, glutaminianem
mórkowej. lub żelazem. Fimbrie typu I są niezbędne do
Wspólną cechą bakterii gramujemnych tworzenia biofilmu na wszystkich powierzch-
tworzÄ…cych biofilmy (E. coli, V. cholerae, niach przez bakterie E. coli. SÄ… one grupÄ… ad-
P. aeruginosa, P. fluorescens) jest ich ruchli- hezyn mannozowrażliwych (MS), gdyż man-
wość. Wszystkie przypadki uszkodzenia w noza i jej pochodne hamują adhezję fimbrii
genie kodującym ruch rzęskowy powodowa- do receptorów. Zbliżone wyniki dała gene-
Å‚y zaburzenia w tworzeniu biofilmu, a szcze- tyczna analiza biofilmu szczepu Vibrio cho-
gólnie w pierwszym etapie kontaktu z po- lerae E1 Tor. W ten sposób analogi manno-
wierzchnią. W pierwotnej adhezji tych bakte- zy można wykorzystać w celu zahamowania
rii uczestniczą fimbrie typu I i IV, odpowie- tworzenia biofilmów przez omawiane bakte-
dzialne za ruch pełzający. Mutanty niezdolne rie (Pratt i Kolter 1999).
do ich wytwarzania nie agregujÄ…. Niezdolne
DOJRZEWANIE BIOFILMU BAKTERII GRAM-UJEMNYCH I GRAM-DODATNICH
Wykazano istotne różnice w procesie doj- acylowane laktony homoseryny (acyl-AHLs).
rzewania biofilmu u bakterii Gram-ujemnych Genem kodujÄ…cym enzymy kierujÄ…ce syntezÄ…
oraz Gram-dodatnich. U Gram-ujemnych bak- laktonu N-(3-oksododekanylo)-L-homoseryny
terii P. aeruginosa składnikami EPS są kwas jest lasI. Mutanty lasI nie wykazują zdolności
alginowy (²-1,4-D-mannuronowy) oraz C-5 utworzenia wÅ‚aÅ›ciwej postaci biofilmu pomi-
epimer kwasu guluronowego. Bakterie nie- mo zachodzących interakcji komórka-komór-
zdolne do wytwarzania tego kwasu tworzy- ka. Proteom dojrzałego biofilmu P. aerugi-
ły biofilmy o zmienionej strukturze. Synteza nosa zawiera dodatkowe frakcje białek meta-
kwasu alginowego znajduje siÄ™ pod kontrolÄ… bolizmu energetycznego i procesu translacji,
genu algACD. Produkcja tego składnika ma- a także cząsteczki autoinduktorów odpowie-
cierzy egzopolimerycznej jest zdeterminowa- dzialne za wyczuwanie własnej gęstości (gu-
na wieloma czynnikami, między innymi wa- ina i współaut. 2003, MihouB i wsp. 2003).
runkami środowiska. Ekspresja genu algC u Za główny składnik egzopolisacharydowej
organizmów związanych w strukturę błony macierzy u E. coli uważa się kwas kolami-
biologicznej osiÄ…ga poziom prawie 19 razy nowy (ang. colanic acid.). Jest on konieczny
wyższy niż w komórkach planktonowych. do utworzenia biofilmu, jednakże nie odgry-
Również ilość gromadzonego kwasu uro- wa ważnej roli podczas adhezji bakterii do
nowego, będącego swoistym markerem in- podłoża. Za syntezę kwasu odpowiedzialne
tensywności syntezy kwasu alginowego, jest są geny ompC Korin oraz wca. Transkryp-
dwukrotnie wyższa w komórkach związanych cja tych genów regulowana jest indukcyj-
w stosunku do wolno żyjących. Mikroorgani- nie. Wykazano również wiele podobieństw
zmy nie wykazujące ekspresji genu algC, ce- w strukturach biofilmu między E. coli oraz
chują się większym prawdopodobieństwem P. aeruginosa, które dotyczyły mikrokolonii,
oddzielenia się od struktury biofilmu (daVey kanałów wodnych, różnorodności oraz gru-
i o Toole 2000, dunne 2002). Wytwarza- bości połączonej warstwy komórek i egzopo-
nie bardzo dużych ilości kwasu alginowego lisacharydów. W proteomie dojrzałej błony
odpowiada prawdopodobnie za odporność biologicznej E. coli pojawiają się białka stre-
bakterii P. aeruginosa na antybiotyk tobra- sowe, regulujÄ…ce translacjÄ™ i replikacjÄ™.
mycynę, będącego podstawowym lekiem w Spośród bakterii Gram-dodatnich, a
chorobach płuc wywołanych przez te mikro- zwłaszcza patogennych, najwięcej badań do-
organizmy. Polisacharyd ten może być ba- tyczy rodzajów: Staphylococcus, Streptococ-
rierą uniemożliwiającą przenikanie tobramy- cus, Enterococcus. W przypadku S. epidermis
cyn do wnętrza biofilmu i patogenu. Bardzo tworzenie i dojrzewanie biofilmu stymulo-
istotnym sygnałem stymulującym dojrzewanie wane jest wytwarzaniem wspomnianej już
makrostruktur biofilmu u P. aeruginosa są adhezyny PIA, która jest cząsteczką linearną,
Katarzyna BaranowsKa, anna rodziewicz
32
asocjujÄ…cÄ… do powierzchni. dunne (2002) proteomu podczas tworzenia i dojrzewania
wykazał pozytywny wpływ jonów Mg2+ oraz biofilmu na wacie szklanej. Profile białko-
negatywny jonów Zn2+ na tworzenie biofilmu we dojrzałego biofilmu i jego początko-
przez te bakterie. W agregacji międzykomór- wych etapów powstawania różniły się. Se-
kowej oraz adhezji do podłoża pewną rolę kwencjonowano osiem frakcji białek cha-
odgrywa również czynnik sigma b (jeden z rakteryzujących biofilm. Były wśród nich:
czynników odpowiedzialnych za rozpoznanie dehydrogenaza pirogronianowa (E1), dehy-
sekwencji zgodnej promotora; potrzebny do drogenaza mleczanowa (LctE), karbamylo-
inicjacji transkrypcji). Szczepy posiadające transferaza ornitynowa (cOTCase), białko
mutację genu kodującego ten czynnik oddzia- YhbH. Pojawienie się takich białek enzyma-
ływują między sobą dużo łatwiej niż szczepy tycznych było odpowiedzią na pogorszenie
dzikie. warunków, np. tlenowych, w utworzonym
Szczep Gram-dodatnich bakterii Bacil- biofilmie (oosthuizen i współaut. 2001,
lus cereus DL5 zbadano w kierunku zmian 2002).
FUNKCJE NISKOCZ
STECZKOWYCH ZWI
ZKÓW SYGNAA
OWYCH ORAZ ICH ENZYMATYCZNA
DEGRADACJA
Za koordynację procesów fizjologicznych sygnalizatora zagęszczania, będącego formą
i metabolicznych drobnoustrojów w obrębie chemicznej komunikacji między mikroorgani-
biofilmu odpowiedzialne są cząsteczki sygna- zmami w błonie biologicznej, najważniejszą
Å‚owe, nazywane autoinduktorami, z pomo- rolÄ™ odgrywajÄ… niskoczÄ…steczkowe zwiÄ…zki
cą których komórki komunikują się między sygnałowe (cząsteczki sygnalizacyjne) (hol-
sobą. Sygnalizator zagęszczenia (ang. quorum den i williaMs 2001, PawliK i KuczeK 2002,
sensing, QS) jest mechanizmem regulacji shirtliff i współaut. 2002). Ich stężenie w
ekspresji genów zależnym od zagęszczenia środowisku biofilmu jest ściśle związane z
komórek bakteryjnych w populacji (Ryc. 1, ilością komórek drobnoustrojów (ich zagęsz-
2). W ten sposób regulowane są także inne czeniem). Cząsteczki te wydzielane są do śro-
procesy, takie jak: sporulacja, różnicowanie dowiska na drodze dyfuzji lub wskutek ak-
komórek, biosynteza metabolitów wtórnych tywnego transportu z cytoplazmy do wnętrza
(antybiotyków, toksyn), przekazywanie pla- struktury biofilmu. W momencie przekrocze-
zmidów, wirulencja, bioluminescencja, re- nia wartości progowej (tzw. wartość quorum)
plikacja DNA, produkcja enzymów i toksyn przez stężenie cząsteczek sygnałowych, nastę-
(czajKowsKi i jafra 2006). W mechanizmie puje indukcja ekspresji genów i wywoływa-
ny jest efekt metaboliczny we wszystkich ko-
mórkach danej populacji. Niskocząsteczkowe
związki sygnałowe wykazują pewne cechy
Ryc. 1. Regulacja mechanizmu wrażliwości pro-
gowej QS u bakterii Gram-ujemnych.
LuxI  białko katalizujące syntezę AHL (laktonu ho-
Ryc. 2. Regulacja mechanizmu wrażliwości pro-
moseryny); LuxR  białko wiążące cząsteczkę AHL i
gowej QS u bakterii Gram-dodatnich.
kontrolujące ekspresję genów; AHL  acylowane lak-
P  fosforylacja; AIP  oligopeptydy. (wg taga i
tony homoseryny (wg taga i Basslera 2003, zmody-
Basslera 2003, zmodyfikowana).
fikowana).
Molekularne interakcje w biofilmach bakteryjnych
33
Ryc. 3. Cząsteczki sygnałowe (autoinduktory)
bakterii Gram-ujemnych  N-acylowane laktony
homoseryny.
(wg shirtliffa i współaut. 2002, zmodyfikowana).
Ryc. 5. Cząsteczki sygnałowe promieniowców
oraz komórek eukariotycznych.
charakterystyczne odróżniające je od meta-
(wg shirtliffa i współaut. 2002, zmodyfikowana).
bolitów wtórnych. Wynikają one z faktu, że
ich działanie biologiczne obserwowane jest
przy niskiej koncentracji w środowisku, pro-
porcjonalnie do liczby bakterii, a ekspresja faciens, czy N-(3-oksododekanylo)-AHL u P.
genów zachodzi w ściśle określonych warun- aeruginosa (Ryc. 3). U bakterii Gram-dodat-
kach (shirtliff i współaut. 2002). Te drob- nich funkcjonują: oligopeptydy (B. subtilis),
noczÄ…steczkowe zwiÄ…zki charakterystyczne sÄ… cykliczne oktapeptydy (S. aureus) (Ryc. 4),
dla poszczególnych grup mikroorganizmów, butyrolaktony (S. griseus), siderofory (Bacil-
jednak pojedynczy szczep może wytwarzać lus sp), białka (Micrococcus luteus). Promie-
kilka rodzajów cząsteczek sygnałowych, a niowce Streptomyces wytwarzają gammabu-
poszczególne rodzaje cząsteczek mogą być tyrolaktony (czynnik A) (Ryc. 5). Pomiędzy
wytwarzane przez różne szczepy. U bakte- bakteriami Gram-ujemnymi i Gram-dodatnimi
rii Gram-ujemnych najczęściej spotykane są funkcjonuje autoinduktory 2 (AI 2) (Ryc. 6).
acylowe pochodne laktonu homoseryny AHL Grzyby A. niger wydzielają do środowiska cy-
(ang. acyl, homoserine lactones), np. N-(3- kliczne czÄ…steczki PsIA, natomiast u innych
oksooktanoylo)-AHL u Agrobacterium tume- Eukariota czÄ…steczki powstajÄ…ce na bazie fu-
ranonu (Ryc. 5). Algi morskie, Delisea pulch-
na, produkujÄ… pochodnÄ… furanonu (5Z)-4-
Ryc. 4. Cząsteczki sygnałowe (autoinduktory)
bakterii Gram-dodatnich  tioestry oktapepty-
Ryc. 6. CzÄ…steczka autoinduktora 2 (AI-2)  uni-
dów.
wersalna jednostka sygnałowa bakterii.
(wg shirtliffa i współaut. 2002, zmodyfikowana).
(wg shirtliffa i współaut. 2002, zmodyfikowana).
Katarzyna BaranowsKa, anna rodziewicz
34
bromo-5-(bromometyleno)-3-butylo-2(5H)-fu- się do zewnętrznej domeny kinazy białkowej
ranon (fur1). Cząsteczki furanonu, oprócz związanej z błoną komórkową, gdzie ulega-
właściwości sygnałowych, posiadają zdolność ją fosforylacji. Cząsteczki AIPs regulują m.in.
hamowania mechanizmu wrażliwości progo- przetrwalnikowanie u B. subtilis oraz wiru-
wej (ang. quorum sensing) u bakterii E. coli lencję u S. aureus i E. faecalis. Specyficzność
oraz V. harveyi, bez hamowania ich wzrostu mechanizmu QS u S. aureus zdeterminowana
(holden i williaMs 2001, taylor i współ- jest przez interakcje zachodzące pomiędzy
aut. 2004). cząsteczkami sygnałowymi a kinazą białkową
N-acylowane laktony homoseryny tworzą usytuowaną w błonie komórkowej. AIPs pro-
rodzinę cząsteczek różniących się długością dukowane przez S. aureus aktywują nie tyl-
łańcucha bocznego (C4-C14) oraz stopniem ko geny odpowiedzialne za ich własną wiru-
utlenienia. Dotychczas wyizolowano i opi- lencję, ale również innych mikroorganizmów
sano 14 rodzajów AHL, różniących się dłu- (taga i Bassler 2003).
gością i obecnością podstawników w bocz- Jedynym niespecyficznym gatunkowo au-
nym łańcuchu acrylowym. Syntetyzowane są toinduktorem są cząsteczki AI-2, które okre-
w formie aktywnej, a następnie wydzielane śla się mianem  uniwersalnych w regulacji
do środowiska. Cząsteczki o krótszych łań- mechanizmu wrażliwości progowej zarówno
cuchach swobodnie dyfundują przez błonę u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujem-
i ścianę komórkową (dyfuzja prosta). Sygna- nych (Ryc. 6). Cząsteczki te kontrolują geny
lizatory dłuższe niż osiem atomów węgla są odpowiedzialne za bioluminescencję V. ha-
transportowane do środowiska zewnętrzne- rveyi, ekspresję genów odpowiedzialnych za
go przez specyficzne systemy transportu wy- wirulencjÄ™ E. coli, V. cholerae i C. perfrin-
korzystujące hydrolizę ATP (pompa MexAB- gens, produkcję antybiotyków przez Porphy-
OprM dla P. aeruginosa). Przy odpowiednim romonas gingivalis, ruchliwość Campylobac-
stężeniu, poprzez autoindukcję, zdolne są do ter jejuni oraz formację biofilmu w miesza-
kontroli ekspresji genów regulatorowych w nej kulturze P. gingivalis i S. gordinii (taga
systemie las i rhl, przy wiodÄ…cej roli mecha- i Bassler 2003).
nizmu pierwszego (holden i williaMs 2001, Niektóre Gram-dodatnie bakterie zdolne
taylor i współaut. 2004). AHL funkcjonują są do wytwarzania enzymów degradujących
zarówno w biofilmach mono-, jak i wieloga- cząsteczki AHL bakterii Gram-ujemnych. Wy-
tunkowych, tworzonych na powierzchniach różnia się dwie grupy bakterii, z których jed-
abiotycznych przez bakterie P. aeruginosa, ne produkujÄ… acylazy-amidohydrolazy (np.:
Chromobacterium violaceum, Yersinia sp. i AiiD), odrywające łańcuch boczny cząsteczki,
inne. Substratami w syntezie AHL sÄ…: S-ade- produkowane przez bakterie Ralstonia sp.,
nozylometionina (SAM) oraz grupa acylowa oraz laktonazy (np. AiiA), które rozkładają
przenoszona na cząsteczkę laktonu przez wiązania estrowe w pierścieniu laktonowym
białko ACP (ang. acyl carrier protein). Acylo- homoseryny, wytwarzane są przez niektóre
wy podstawnik pochodzi z przemian kwasów gatunki Bacillus (Ryc. 7) (d Angelo-Picard
tłuszczowych, a pierścień laktonu homosery- i współaut. 2005). Te hydrolityczne enzy-
ny jest dostarczany przez S-adenozylometioni- my pośrednio zaburzają transkrypcję, a w
nę. SAM przyłącza się do centrum aktywnego dalszej kolejności formowanie biofilmu, co
enzymu syntazy AHL, a następnie grupa acy- może mieć wykorzystanie terapeutyczne w
lowa zostaje przyłączona do SAM wiązaniem odniesieniu do bakterii chorobotwórczych
amidowym. Ostatnim etapem tworzenia czą- (KiM i współaut. 2005). W wielu badaniach
steczki AHL jest utworzenie wiązania estro- potwierdza się, że ingerencja w mechanizmy
wego w homoserynie. Produktem ubocznym QS daje możliwość opracowania nowych me-
tych przemian jest 5 -metylotioadenozyna tod zmniejszania lub zahamowania infekcyj-
(MTA) (czajKowsKi i jafra 2006). ności wielu patogenów.
Cząsteczki autoinduktorów peptydowych Pierwsza grupa enzymów degradujących
AIPs (ang. autoinducing polypeptides) stano- AHL to laktonazy, hydrolizujące pierścień
wią oligopeptydy zawierające od 7 do 9 reszt laktonu nie naruszając wiązania pomiędzy
aminokwasowych oraz pierścienie tiolakto- laktonem a bocznym łańcuchem acylowym.
nowe zawierające cysteinę w miejscu 5 od W przypadku hydrolizy pierścienia cząsteczki
C-końca łańcucha oligopeptydowego. Synte- sygnalizacyjnej, następuje około 1000-krotny
tyzowane są w cytozolu w postaci prekurso- spadek aktywności danej cząsteczki w mecha-
rów, a następnie modyfikowane i wydzielane nizmie QS. Enzymy te wyizolowano zarówno
pozakomórkowo. Cząsteczki te przyłączają z bakterii Gram-dodatnich  Bacillus sp., jak
Molekularne interakcje w biofilmach bakteryjnych
35
kwencji aminokwasowych. Odnalezienie en-
zymów hydrolizujących laktony u B. thurin-
gensis stwarza możliwości wykorzystania tej
bakterii w biokontroli nie tylko owadów, ale
też w zwalczaniu patogenów bakteryjnych
roślin. Sekwencję homologiczną do sekwen-
cji genu aiiA stwierdzono również dla gatun-
ków B. anthracis, B. cereus i B. mycoides.
Drugą grupą enzymów degradujących acy-
lowane laktony homoseryny są acylazy, które
hydrolizują wiązanie amidowe pomiędzy lak-
tonem a acylowym podstawnikiem bocznym
cząsteczki sygnałowej. W wyniku tej reakcji
Ryc. 7. Enzymatyczna hydroliza laktonu AHL
pozostaje nienaruszona struktura laktonu ho-
przez laktonazÄ™ (AiiA) pochodzÄ…cÄ… z bakterii
moseryny. Są to enzymy izolowane z komó-
Bacillus sp. oraz przez acylazÄ™ (AiiD) pocho-
rek bakterii Gram-ujemnych, m.in. P. aerugi-
dzÄ…cÄ… z bakterii Ralstonia sp.
nosa, Ralstonia solanaceum i V. paradoxus.
(wg czajKowsKiego i jafra 2006, zmodyfikowana).
Sekwencje genów kodujących acylazy AHL są
słabo poznane (czajKowsKi i jafra 2006).
i Gram-ujemnych  A. tumefaciens, a geny Enzym o aktywności acylazy AHL bakterii
kodujÄ…ce laktonazy znajdujÄ… siÄ™ na chromo- P. aeruginosa jest produktem genu pvdQ i
somie bakteryjnym, w niektórych zaś przy- wykazuje podobieństwo w 38 40% do acyla-
padkach na plazmidach (A. tumefaciens). zy AiiD wyizolowanej z Ralstonia eutropha
JednÄ… z lepiej poznanych laktonaz jest na poziomie sekwencji aminokwasowej. En-
enzym pochodzący z rodzaju Bacillus sp. zym ten rozkłada wiązania amidowe w czą-
Oczyszczone białko AiiA, będące produk- steczkach C8-AHL, C10-AHL, C12-AHL i C14-AHL.
tem genu aiiA, inaktywuje 3-oxo-C6-AHL, 3- Podobnie jak laktonaza, acylaza AiiD z Bacil-
oxo-C8-AHL oraz 3-oxo-C10-AHL. AiiA uznana lus sp. jest enzymem wysoce specyficznym
została za enzym działający wewnątrz ko-  nie wykazuje aktywności względem czą-
mórki, w cytoplazmie, gdyż nie znaleziono steczek sygnałowych o krótszych łańcuchach
hydrofobowego peptydu sygnałowego odpo- bocznych (mniej niż osiem atomów węgla).
wiedzialnego za transport laktonazy do bło- W wyniku degradacji cząsteczki AHL przez
ny komórkowej (czajKowsKi i jafra 2006). acylazy powstają kwasy tłuszczowe i homose-
AiiA zawiera dwa motywy aminokwasowe ryna, która może być toksyczna dla mikroor-
spotykane dość powszechnie, z których ganizmu. Kwasy tłuszczowe wykorzystywane
pierwszy charakterystyczny jest dla glikozy- są przez komórkę jako z
ródło energii, nato-
dazy II, acylosulfataz oraz metylo-²-laktamaz, miast homoseryna rozkÅ‚adana jest do CO2,
drugi to motyw wiÄ…zania jonu Zn+2, wystÄ™- NH3 oraz H2O.
pujący w tych enzymach. Obydwie sekwen- Cząsteczki sygnałowe bakterii mogą
cje aminokwasowe są niezbędne do hydro- uczestniczyć w apoptozie, która jest progra-
lizy laktonu homoseryny przez AiiA. Ustalo- mowaną śmiercią komórek, ściśle regulowa-
no również, że laktonaza AiiA jest enzymem ną genetycznie. Proces ten jest niezwykle
o dużej specyficzności działania, gdyż nie istotny dla prawidłowego funkcjonowania
hydrolizuje ona laktonów pozbawionych organizmu. Głównymi komponentami tego
acylowego bocznego łańcucha i niecyklicz- procesu są kaspazy, zaliczane do proteaz
nych estrów. Obecność podstawnika oraz cysteinowych. W ostatnich latach zebrano
pierścienia jest niezbędna do aktywności dużo danych eksperymentalnych świadczą-
enzymu. Obniżenie pH poniżej wartości 5,0 cych o udziale bakteryjnych cząsteczek sy-
powoduje dramatyczny spadek aktywności gnalizacyjnych w stymulacji apoptozy w za-
AiiA, jak również temperatura powyżej 37oC infekowanych komórkach eukariotycznych.
prowadzi do inaktywacji enzymu. Przykładem mogą być bakterie z rodzaju
Analiza sekwencji nukleotydowej genu Pseudomonas, które dzięki wydzielaniu
aiiA B. thuringensis pozwoliła ustalić wysoki specyficznych metabolitów modulują odpo-
stopień podobieństwa enzymu z tego mikro- wiedz
immunologicznÄ… w zainfekowanych
organizmu do laktonazy AiiA innych bakterii tkankach. Bakterie P. aeruginosa zdolne sÄ…
z rodzaju Bacillus sp. Wynosiło ono 89 95% do wytwarzania i wydzielania dwóch rodza-
dla sekwencji nukleotydów i 90 96% dla se- jów cząsteczek sygnalizacyjnych N-3-oksodo-
Katarzyna BaranowsKa, anna rodziewicz
36
Ryc. 8. Rola 3-okso-C12-AHL w pato-
genezie komórek węzłów chłonnych
wywoływanej przez rodzaj Pseudo-
monas.
(wg tatedy i współaut. 2003, zmodyfiko-
wana).
dekanol laktonu homoseryny oraz N-butyry- staglandyny oraz gamma interferonu w ko-
lolaktonu homoseryny. Pierwszy z nich sty- mórkach T. Badania przeprowadzone przez
muluje komórki epiteliarne oraz fibroblasty TATEDA i współaut. (2003) wykazały rów-
do wzmożonej produkcji różnych substan- nież stymulacje przez cząsteczkę 3-okso-C12-
cji, takich jak: interleukina 8 (IL-8), enzymu AHL apoptozy komórek makrofagów oraz
cyklooksygenazy, hormonu tkankowego pro- neutrofili (Ryc. 8).
GENETYCZNA REGULACJA MECHANIZMU WRAŻLIWOŚCI PROGOWEJ QS
U PSEUDOMONAS AERUGINOSA
U bakterii P. aeruginosa regulacja two- torowego RhlR oraz czÄ…steczki autoindukto-
rzenia jednogatunkowego biofilmu odbywa ra N-butyrylolaktonu homoseryny (C4-AHL),
się poprzez system QS, który pozwala tym będącego produktem genu rhlI, mającego
mikroorganizmom na monitorowanie własnej zdolność swobodnego przenikania przez bło-
gęstości komórek. Mechanizm QS oraz regula- ny komórkowe. Podobnie jak w pierwszym
cja ekspresji kontrolowane są przez dwa ści- przypadku, gdy cząsteczka C4-AHL wydziela-
śle od siebie zależne, ale różne mechanizmy, na na zewnątrz osiągnie odpowiedni poziom,
a mianowicie system QS las oraz QS rhl. W następuje jej wniknięcie do komórki bakteryj-
przypadku systemu las, produkty genu lasI nej i połączenie z Rhl, który jest aktywatorem
kontrolują bezpośrednio syntezę pozakomór- transkrypcji. Powstały kompleks Rhl-C4 regu-
kowej cząsteczki sygnałowej N-(3-oksodode- luje między innymi operon odpowiedzialny za
kanylo)-laktonu homoseryny (3-okso-C12-AHL), syntezę ramnolipidów (rhlAB), proteazy zasa-
wydzielanej w sposób aktywny na zewnątrz dowej czy PAIL  lektyny. Dominujący wpływ
komórki. Gdy stężenie laktonu w otoczeniu systemu las nad systemem rhl zaobserwowa-
komórek wzrasta, następuje jego pobranie no w przypadku inhibicji 3-okso-C14-AHL na łą-
do wnętrza mikroorganizmów i połączenie czenie się C4-AHL z aktywatorem transkrypcji
3-okso-C12-AHL z aktywatorem transkrypcji RhlR. Oprócz omówionych cząsteczek sygna-
LasR. Powstały kompleks posiada zdolność łowych, komórki P. aeruginosa syntetyzują
aktywowania ekspresji wielu genów, w tym jeszcze inne pochodne homoseryny (Ryc. 1).
enzymów, np. lasB  elastazy, lasA  prote- Działanie mechanizmu QS u tych patogenów
azy serynowej. Transkrypcja genu lasR jest regulowane jest na zasadzie autoindukowane-
indukowana stężeniem glukozy. Drugi system go sprzężenia zwrotnego dodatniego (ang. up
QS P. aeruginosa składa się z białka regula- regulation) (KjelleBerg i Molin 2002).
Molekularne interakcje w biofilmach bakteryjnych
37
PODSUMOWANIE
Skupiska bakterii tworzących biofilmy, odpowiednich genów, białkowe adhezyny,
na skutek wzajemnych interakcji z udziałem enzymy, białka aglutyninopodobne i inne.
cząsteczek sygnałowych, mogą w powstałej Znajomość mechanizmów odpowiedzialnych
populacji koordynować procesy życiowe. Zja- za te procesy, umożliwia aplikację bakterii
wisko to upodabnia je w pewnym stopniu tworzących błony biologiczne, np. w proce-
do prymitywnych wielokomórkowych orga- sach detoksykacji czy biodegradacji. Może też
nizmów eukariotycznych. Efektem tego jest, przyczynić się do większego ograniczenia ich
między innymi, wysoka oporność mikroorga- patogenności lub szkodliwego działania w
nizmów w biofilmie jako zespole, na czynni- miejscach niepożądanych, co ma wymiar me-
ki antymikrobiologiczne, co znacznie utrud- dyczny, ekologiczny i przemysłowy. Zdolność
nia ich zwalczanie. W powstałej niszy ekolo- niszczenia autoinduktorów jednych mikroor-
gicznej, jaką stanowią biofilmy, oprócz drob- ganizmów (szczególnie patogennych) przez
nocząsteczkowych autoinduktorów, zasad- inne, może znalez
ć wykorzystanie terapeu-
niczą funkcję spełniają składniki proteomu: tyczne a także w produkcji żywności.
białka regulujące transkrypcję lub represję
MOLECULAR INTERACTIONS IN BACTERIAL BIOFILMS
S u m m a r y
Bacterial biofilm may be defined as a commu- ing compounds for gram negative bacteria are acyl
nity of microorganisms embedded in an exopoly- homoserine lactones, for gram positive  tioesters
saccharide matrix and attached to a surface. Forma- containing octapeptides and gamma-butyrolactones,
tion and maturation of biofilms is connected with while for eukaryotic cells  furanone derivatives.
production of extracellular polymeric substances. Molecular interactions between the bacteria them-
In this process, microorganisms also secrete specif- selves, the bacteria in biofilm and the surface,
ic, low molecular signaling compounds, proteins or mechanisms of initial attachment, development and
polysaccharides and their derivatives. Structure of change of the biofilm phenotype, and genetic regu-
those compounds, synthesis regulation and the way lation, are important to elucidate the impact of bio-
of secretion are different for gram-negative and films on medical, industrial, environmental applica-
gram-positive bacteria. The quorum-sensing signal- tions.
LITERATURA
holden M. t. g., williaMs P., 2001. Quorum Sens-
Baj j., MarKiewicz z., 2006. Biologia molekularna
ing. Encyclopedia of Life Sciences, Nature Pub-
bakterii. Wydawnictwo Naukowe PWN.
czaczyK K., wojciechowsKa K., 2003. Tworzenie bio- lishing Group, www.els.net.
filmów bakteryjnych  istota zjawiska i mecha- KiM M. h., choi w.-C., Kang h. O., lee j. s., Kang
B. s., KiM K.-J., derewenda z. s., oh t.-K., lee c.
nizmy oddziaływań. Biotechnologia 3, 180 192.
czajKowsKi r., jafra S., 2006. Enzymatyczna degra- h., lee J.-K., 2005. The molecular structure and
dacja laktonów acyl-L-homoseryny i jej poten- catalytic mechanism of a quorum-quenching N-
cjalne wykorzystanie w biokontroli i hamowa- acyl-L-homoserine lactone hydrolase. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 102, 17606 17611.
niu rozwoju infekcji. Biotechnologia 2, 49 64.
KjelleBerg s., Molin S., 2002. Is there a role for quo-
d Angelo-Picard c., faure d., Penot i., dessaux y.,
rum sensing signals in bacterial biofilms? Curr.
2005. Diversity of N-acyl homoserine lactone
Opin. Microbiol. 5, 254 258.
 producing and degrading bacteria in soil
MihouB f., Mistou M. y., guillot a., leVeau j. y., aB-
and tabacco rhizosphere. Environ. Microbiol. 7,
delKader B., Billaux F., 2003. Cold adaptation of
1796 1808.
Escherichia coli: microbiological and proteomic
daVey M. e., o Toole g. A., 2000. Microbial biofilms:
approaches. Int. J. Food Microbiol. 89, 171 184.
from ecology to molecular genetics. Microbiol.
MoriKawa M., 2006. Beneficial biofilm formation by
Molec. Biol. Rev. 64, 847 867.
donlan R. M., 2002. Biofilms: microbial life on sur- industrial bacteria Bacillus subtilis and related
species. J. Biosci. Bioeng. 101, 1 8.
face. Emerg. Infect. Dis. 7, 277 281.
o Toole G. A., 2003. To build a biofilm. J. Bacteriol.
dunne W. M., 2002. Bacterial adhesion: seen any
185, 2687 2689.
good biofilms lately? Clin. Microbiol. Rev. 15,
o Toole g. a., Kolter R., 1998. Initiation of biofilm
155 166.
formation in Pseudomonas fluorescens WCS365
guina t., PurVina s. o., yi e. c., eng j., goodlett d.
proceeds via multiple, convergent signaling
r., aeBersold r., Miller S. I., 2003. Quantitave
proteomic analysis indicates increased synthe- pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28,
449 461.
sis of a quinolone by Pseudomonas aeruginosa
oosthuizen M. c., steyn B., lindsay d., Brozel V. s.,
isolates from cystic fibrosis airways. Proc. Natl.
Von holy A., 2001. Novel method for the pro-
Acad. Sci. USA 100, 2771 2776.
Katarzyna BaranowsKa, anna rodziewicz
38
teomic investigation of dairy  associated Ba- tateda K., ishii y., horiKawa M., MatsuMoto t., Mi-
cillus cereus biofilm. FEMS Microbiol. Lett. 194, yairi s., Pechere j. c., standiford t. j., ishiguro
47 51. M., yaMaguchi K., 2003. The Pseudomonas ae-
oosthuizen M. c., steyn B., theron j., cossett P., ruginosa autoinductors N-3-oxododecanoyl ho-
lindsay d., Von holy a., Brozel V. s., 2002. moserine lactone accelerates apoptosis in mac-
Proteome analysis reveals differential protein rophages and neutrophils. Infect. Immun. 71,
expression by Bacillus cereus during biofilm 5785 5793.
formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2770 taylor M. w., schuPP P. j., Baillie h. j., charlton
2780. t. s., de nys r., KjelleBerg s., steinBerg P. D.,
PawliK K., KuczeK K., 2002. NiskoczÄ…steczkowe bak- 2004. Evidence for acyl homoserine lactone
teryjne cząsteczki sygnałowe. Biotechnologia 4, signal production in bacteria associated with
165 175. marine sponges. Appl. Environ. Microbiol. 70,
Pratt l. a., Kolter R., 1999. Genetic analyses of 4387 4389.
bacterial biofilm formation. Curr. Opin. Micro- Vuong c., gerKe c., soMerVille g. a., fischer e. r.,
biol. 2, 598 603. otto M., 2003. Quorum 0 Sensing control of
shirtliff M. e., Madey j. t., caMPer A. K., 2002. Mo- biofilm factors in Staphylococcus epidermis. J.
lecular interactions in biofilms. Chem. Biol. 9, Infect. Dis. 188, 706 718.
859 871. watnicK P. i., Kolter R., 2000. Biofilm, city of mi-
taga M. e., Bassler B. L., 2003. Chemical commu- crobes. J. Bacteriol. 182, 2675 2679.
nication among bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 100, 14549 14554.