Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy
Cel ćwiczenia:
Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z metodą oznaczania aktywności peroksydazy
chrzanowej jako jednego z enzymów z klasy oksydoredukataz.
Wprowadzenie:
Peroksydazy (EC 1.11.1.1-14) to grupa enzymów naleŜących do klasy oksydoreduktaz
katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru róŜnych substratów organicznych i
nieorganicznych (Verma i Dubey, 20003). Grupą prostetyczną peroksydaz moŜe być kofaktor
hemowy, a takŜe reszty selenocysteiny lub cysteiny luźno związane z apoenzymem.
W reakcji katalizowanej przez peroksydazę, nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem
róŜnych związków np. kwasu askorbinowego, hydrohinonów i zredukowanego cytochromu.
Sumarycznie równanie reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco:
H2O2 + AH2
2 H2O + A
gdzie: AH2 i A to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym.
Peroksydazy roślinne naleŜą do kluczowych enzymów kontrolujących róŜnicowanie się i
rozwój komórek roślinnych. Biorą one udział w takich procesach, jak: wczesny rozwój roślin,
kiełkowanie, dojrzewanie owoców, starzenie oraz opadanie liści. Dodatkowo pełnią funkcję
enzymów o charakterze antyoksydantów, uczestnicząc w unieczynnianiu reaktywnych form
tlenu (RFT). RFT powstają w kaŜdej Ŝywej komórce jako nieuchronny produkt metabolizmu
tlenowego. Nadmierne ich generowanie prowadzi do stresu „oksydacyjnego” oddziałując
negatywnie na funkcje wszystkich organelli komórkowych, uszkadzając białka, lipidy oraz
kwasy nukleinowe (Zacchini i in., 2003). Organizmy roślinne i zwierzęce wykształciły system
antyoksydacyjny, który składa się zarówno z enzymów (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza,
peroksydaza oraz alternatywna oksydaza) jak i związków niskocząsteczkowych (askorbinian,
cysteina, glutation). Do peroksydaz biorących udział w usuwaniu RFT naleŜą: peroksydaza
glutationowa, gwajakolowa czy askorbinowa (Mehlhorn, i in., 1996). Enzymy te zlokalizowane są m.in. w cytozolu, wakuoli, chloroplastach, ścianie komórkowej i przestrzeni
międzykomórkowej. Uczestniczą nie tylko w obronie antyoksydacyjnej, ale równieŜ biorą
udział w procesach lignifikacji, biosyntezie etylenu i obronie przed patogenami.
Peroksydazy są wysoce specyficzne w stosunku do donora wodoru (np. peroksydaza
cytochromowa, peroksydaza NADH, peroksydaza NADPH) lub niespecyficzne przenosząc
atom wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru (np. peroksydaza chrzanowa).
Prawie wszystkie peroksydazy niespecyficzne są hemoproteinami. Dzięki występowaniu
ugrupowania hemowego połączonego ze specyficznym białkiem wykazują one
charakterystyczne widmo absorpcyjne. Utworzenie przejściowego kompleksu enzymu z
H2O2, powoduje aktywacje nadtlenku wodoru, w wyniku, czego działa jako akceptor wodoru.
Peroksydazy mogą równieŜ katalizować reakcję bezpośredniego utlenienia substratów z
udziałem tlenu cząsteczkowego.
Do peroksydaz o charakterze niespecyficznym naleŜy m.in. peroksydaza chrzanowa. Jest
ona glikoproteiną o masie cząsteczkowej 44 kDa, zawierającą cztery reszty lizynowe.
1
Substratem, a więc donorem wodoru mogą być m.in. fenole oraz aminy tj. e-toluidyna,
gwajakol czy pirogalol.
Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej
Aktywność peroksydazy moŜe być oznaczana na podstawie: spadku stęŜenia nadtlenku
wodoru, spadku stęŜenia donoru wodoru lub pomiarze poziomu utworzonych produktów
utlenienia. Na dzisiejszych ćwiczeniach pomiar aktywności peroksydazy chrzanowej będzie
się opierał na trzeciej metodzie, czyli na pomiarze poziomu utworzonych produktów
utlenienia. Przy oznaczaniu aktywności peroksydazy nadtlenek wodoru stosuje się w
niewielkim nadmiarze ze względu na jego inaktywujące działanie na enzymy. Reakcję
przeprowadza się przez 5-10 minut ze względu na szybkie wyczerpywanie się nadtlenku
wodoru.
Zasada fotometrycznej metody oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej
Metoda opiera się na reakcji utleniania pirogalolu do purpurogaliny przy udziale nadtlenku
wodoru. Ilość powstającej purpurogaliny mierzona jest fotometrycznie przy długości fali 430
nm i temperaturze 25°C. Próbę materiałową wykonuje się bez dodatku H2O2 w celu
wyeliminowania aktywności oksydazy polifenolowej, która równieŜ wykazuje właściwości
utleniające. Aktywność peroksydazy uzyskujemy poprzez odjęcie od absorbancji dla prób
pełnych wartość absorbancji dla prób materiałowych (Próba pełna – Próba materiałowa).
+ 3 H
2
2 0 2
+
C0 2 + 5 H 20 2
pirogalol
purpurogalina
Rys. 1. Utlenienie pirogalolu do purpurogaliny.
Odczynniki
1. 1M NaOH:
2. 0.1 M bufor fosforanowy pH 6.0:
3. 5.33% roztwór pirogallolu (m/v)
4. 0.5% H2O2
5. 10% Kwas siarkowy
6. 10% Siarczan sodowy
Wykonanie
Wyciąg enzymowy (zadanie kontrolne) uzupełnić wodą destylowaną w kolbie miarowej na
25 ml.
Procedura
Wykonywane są następujące próby:
2
1) kontrolna zawiera wszystkie składniki, ale bez wyciągu enzymowego. SłuŜy do wyzerowania
spektrofotometru
i
kompensuje
absorbancję
pochodzącą
od
odczynników.
2) materiałowa bez dodatku H2O2 w celu wyeliminowania aktywnej w roślinach
oksydazy polifenolowej wykazującej właściwości utleniające pirogalol.
3) pełna zawierająca wszystkie odczynniki oraz enzym i H2O2.
Aktywność peroksydazy chrzanowej wykonuje się w buforze fosforanowym pH 7.0,
temperaturze 25oC, inkubację prowadzi się przez 10 minut.
Do probówek naleŜy odpipetować następujące ilości odczynników:
Próba kontrolna
Próba materiałowa
Próba pełna
(w 2 powtórzeniach)
(w 2 powtórzeniach)
0.15 ml
0.15 ml
0.15 ml
Bufor fosforanowy
Bufor fosforanowy
Bufor fosforanowy
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Woda destylowana
Enzym
Enzym
0.7 ml
0.7 ml
0.7 ml
Woda destylowana
Woda destylowana
Woda destylowana
Wstawić do łaźni wodnej na 5 minut o temperaturze 25 ° C
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Nadtlenek wodoru
Woda destylowana
Nadtlenek wodoru
0.15 ml
0.15 ml
0.15 ml
Pirogalol
Pirogalol
Pirogalol
Inkubować w łaźni wodnej przez 10 minut o temperaturze 25 ° C
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Kwas siarkowy
Kwas siarkowy
Kwas siarkowy*
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Siarczan sodowy
Siarczan sodowy
Siarczan sodowy**
2.5 ml
2.5 ml
2.5 ml
Woda destylowana
Woda destylowana
Woda destylowana
*zahamowanie reakcji przez dodanie 10 % kwasu siarkowego
** rozłoŜenie pozostałego nadtlenku wodoru
Absorbancję uzyskanych roztworów (2 próby pełne, 2 próby materiałowe) naleŜy odczytać w
fotometrze wobec próby kontrolnej przy długości fali 430 nm.
Opracowanie wyników
Od średniej wartości absorbancji prób pełnych odjąć średnią wartość absorbancji prób
materiałowych. Dla otrzymanej absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej stęŜenie
purpurogaliny. Obliczyć aktywność peroksydazy wyraŜona w µmol purpurogaliny utworzonej
w ciągu 1 minuty w przeliczeniu na 1 g korzenia.
3
Absorbancja Absorbancja
Średnia
Absorbancja
Absorbancja
Średnia
StęŜenie
prób
prób
absorbancja
prób
prób
absorbancja
RóŜnica purpurogaliny
pełnych
pełnych
prób
materiałowych materiałowych
prób
(µg)
1
2
pełnych
1
2
materiałowych
0.175
0.164
0.170
0.020
0.030
0.025
0.145
900
RóŜnica absorbancji 0.145
W 0.5 ml próby znajduje się 900 µg purpurogaliny
W 25 ml (w kolbce)- 45 000 µg purpurogaliny (900 µg x 50)
Do kolbki przed dopełnieniem jej wodą do objętości 25 ml wlano np. 3 ml analizowanego
ekstraktu z korzenia chrzanu (wartość tę poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu róŜnic
absorbancji P pełna – P materiałowa).
W 3 ml roztworu było 45 000 µg purpurogaliny, zatem w 1000 ml:
45 000 µg purpurogaliny x 1000/3 = 15 000 000 µg purpurogaliny
Masa molowa purpurogaliny 220 µg/µmol, zatem 15 000 000 µg/220 µg/µmol = 68 181 µmol
Do doświadczenia uŜyto 2.5 g korzenia chrzanu a aktywność musimy przeliczyć na 1 g i na 1
minutę:
68 181 µmol x 1 g/2.5 g = 27 272 µmol
27 272 µmol x 1 minuta/10 minut = 2727 µmol
Schemat rozcieńczeń
2.5g
1000 ml
X ml
25 ml
Zadanie
kontrolne
0.5 ml
Pytania:
1) Do jakiej klasy enzymów naleŜą peroksydazy i jakie reakcje katalizują?
2) Wyjaśnij, dlaczego w metodach oznaczania aktywności peroksydaz reakcję prowadzi
się tylko przez krótki czas?
3) W jaki sposób przerywa się na ćwiczeniu reakcję katalizowaną przez peroksydazę
chrzanową? W jakim celu po zakończeniu reakcji enzymatycznej dodaje się siarczynu
sodowego?
4
4) Czym róŜnią się próby kontrolne od prób pełnych w fotometrycznej metodzie
oznaczania aktywności peroksydazy? Do czego słuŜy próba kontrolna, materiałowa
oraz pełna?
Literatura:
1) Becana M, Dalton DA, Moran JF, Iturbe-Ormaetxe I, Matamoros MA, Rubio
MC. 2000. Reactive oxygen species and antioxidants in legume nodules. Physiologia
Plantarum 109: 372–381.
2) Mehlhorn H, Lelandais M, Korth HG, Foyer CH. 1996. Ascorbate is the natural
substrate for plant peroxidases? FEBS Lett: 378:203–206
3) Małecka A., Tomaszewska B. 2005. Reaktywne formy tlenu w komórkach
roślinnych i enzymatyczne systemy obronne. Postępy Biologii Komórki 32:311-325
4) Verma , S. and R.S. Dubey, 2003. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Sci: 164: 645-655.
5) Zacchini M. , Rea E., Tullio M., de Agazio M. 2003. Increased antioxidative capacity in maize calli during and after oxidative stress induced by a long lead treatment. Plant
Physiology and Biochemistry: 41: 49-54.
5