Różne parametry normy metodą szokową CaCl2/heat w sprawie przekształcenia
Escherichia coli szczepu DH5α-T1R z plazmidu pUC19 zostały zoptymalizowane. z
czterech różnych temperaturach, szok termiczny (32 ° C, 37 ° C, 42 ° C i 47 ° C)
badanych, 42 ° C leczenie wystawione maksymalną wydajność transformacji
objawione przez oporne na ampicylinę kolonie znajdujące się na LB Agar ampicylina
płyty. Z pięciu razy różnych szoku cieplnego ekspozycji, impuls 30 sekund
czas trwania w połączeniu z 42 ° C ciepła temperatura szok wystawione maksymalnie
wydajności. Stwierdzono, że chociaż transformacja komórek traktowanych CaCl2
Dzieje się tak nawet przed rozpoczęciem leczenia szoku termicznego, wydajność była około 15 razy większa
po szoku termicznego. Kiedy komórki dalej inkubowano na lodzie (po ciepło
wstrząs) przez 10 min, wydajność transformacji wzrosła o 24 razy
w porównaniu do braku szoku cieplnego i 1,6-krotnie w porównaniu do leczenia szoku
termicznego.
Nie było marginalny spadek transformacji, gdy komórki inkubowano w
temperaturze pokojowej zamiast lodu po szoku termicznego. Wyniki te sugerują, że
impuls szoku cieplnego 30 sek w 42 ° C, a następnie 10 min lodu etapie inkubacji
są idealne parametry w celu uzyskania maksymalnej wydajności przetwarzania w DH5α -
Szczep T1R. Wyniki sugerują również, że ciepło po szoku zimna etapie inkubacji jest
także ważnym czynnikiem i poprawia transformacji E. coli znacznie.
wprowadzenie
Możliwość wprowadzenia plazmidu cząsteczek DNA w komórkach została centralnego
znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej. Kilka metod, które zostały opisane w literaturze do wprowadzenia plazmidu DNA do komórek. te metody
obejmują obróbkę chemiczną (1, 2), elektroporacji (3, 4), korzystanie z biolistic pistolet (5), glikol polietylenowy (6), USG (7), kuchenka mikrofalowa (8) i hydrożelu (9). Jednakże,
metody chemiczne osiągnęły wiele uwagi w większości laboratoriów, z powodu
ich dostępności i efektywności kosztowej.Stan fizjologiczny komórek, która umożliwia
ich wiązania i podjęcia dużej masie cząsteczkowej, egzogenny DNA nazywa
"Kompetencje". Wychwyt wolnego DNA przez komórki Escherichia coli, które stały się
przez właściwe leczenie chemiczne dostarczanie jonów Ca2 + po szoku cieplnego
impuls po raz pierwszy zgłoszone przez Mandel i Higa (10). Później, kilka
modyfikacje tej metody stały się dostępne do transformacji E. coli z
plazmidu DNA (1, 11-13).
Wśród wielu badanych kationów (Ca2 +, Mn2 +, Sr2 +, Ba2 +, Mg2 +,
Na + i Rb +), Ca2 + (100-200 mm Zakres) pod warunkiem, stosunkowo lepiej
transformacji E. coli (14). Fizjologiczne optymalnych warunków transformacji,
jednak różnić w zależności od szczepu do szczepu, ich tło genetyczne i typ
transformacji DNA (14). Transformacja częstotliwości uzyskanych za pomocą tych metod
zakresie około 105-107 transformantów / ug DNA.Częstotliwości są nadal
około dziesięciokrotnie niższe, gdy ligacji DNA mieszaniny reakcyjnej jest używany jako wejście DNA,
powoduje obniżenie rekombinowanych klonów na talerzu. Chociaż do klonowania i sub-
klonowanie
celów wysokiej wydajności transformacji nie jest krytyczna, takich jak
Budowa biblioteki genomowe i cDNA wymagają bardzo wysokiej wydajności
transformacji, aby mieć odpowiednią reprezentację sekwencji niskiej liczbie kopii.
Jest zatem ważne, aby zoptymalizować i poprawić częstotliwość transformacji
żądany szczep gospodarza w celu osiągnięcia klonowania niskiej liczbie kopii cząsteczek DNA.
Materiał i metody:
Szczepów bakteryjnych, pożywki i plazmidu DNA używane
Escherichia coli szczepu DH5α-T1R (genotyp: F-Φ80lacZΔM15 Δ (lacZYAargF)
U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk
-, Mk
+) PhoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tona)
był stosowany w tym badaniu (Invitrogen Inc.) Luria-Bertani (LB) medium (Sigma Aldrich
Inc) została rutynowo stosowane do kultury E. coli. Do tworzenia płyt średniej był zestalony
z 1,6% agaru. Antybiotyk płyty do selekcji transformantów zawarte na ampicylinę
(Sigma Aldrich Inc) w końcowym stężeniu 100 mg / ml. Super pUC19 zwinięte
plazmidu DNA (2686bp długo) był używany jako DNA transformacji.
Procedura transformacji
CaCl2 traktowane 50μl porcje komórek kompetentnych przechowywano w temperaturze -80 ° C
rozmrożono na lodzie
przez 30 min. Pięć uL z pUC19 plazmid zawierający łącznie 50pg DNA bezpośrednio
pipety na właściwe komórki. Komórki te delikatnie wymieszać naciskając 4-5 razy,
inkubowano na lodzie przez 30 min, po którym nastąpiło leczenie szoku termicznego. po
leczenie komórki rutynowo inkubowano w lodzie przez 2 min następnie dodano
250 uL SOC mediów do każdej fiolki. Fiolki w końcu w temperaturze 37 ° C przez 1 godzinę w
225 obrotów na minutę w inkubatorze trzęsie. Hodowle właściwie rozcieńczonego w LB
średnich i 50-100μl każdej kultury wysiano w trzech egzemplarzach na ampicylinę zawierające
mediów płyt. Te płytki inkubowano w temperaturze 37 ° C przez noc i
wynikające kolonie transformanta oceniano i analizowano.
Obliczanie sprawności przemiany
Sprawności przemiany (transformantów / DNA mg) została obliczona w następujący sposób:
Wyniki i dyskusja
Wpływ czasu trwania leczenia szoku cieplnego na plazmidu transformacji
Literatura pokazuje różne czasy obróbki cieplnej prądem w zakresie od 30 s do 2 min
w celu uzyskania transformacji E. coli. Nie ma spójnego sprawozdania, jak dużo ciepła
szok wyniki czasie w maksymalnej wydajności transformacji. W celu określenia optymalnej
czas leczenia szoku cieplnego dla DH5α-T1R komórkach, CaCl2 traktowanych komórek tego
szczepu
inkubowano w temperaturze 42 ° C w łaźni wodnej do pięciu różnych punktach czasowych tj. 1, 30, 60, 90
i 120 sekund, indywidualnie.Sprawności przemiany (x108) obserwowano po
tych zabiegów było 1,21 ± 0,23; 2,98 ± 0,16; 2,62 ± 0,22; 1,92 ± 0,23 i 0,96 ± 0,17 do
1, 30, 60, 90 i 120 sekund, odpowiednio (rys.1). Wyniki te wskazują, że 30
czas trwania sekundy jest optymalne dla uzyskania maksymalnej wydajności transformacji
DH5α-T1R szczep z pUC19 plazmidu DNA. Już ciepło zabiegi prądem
znacząco zmniejsza wydajność transformacji. Wiadomo, że żywotność komórek
zmniejsza się z dłuższej ekspozycji na wysokie temperatury i być może mogłoby to mieć
przyczyniły się do ograniczenia w wydajności transformacji obserwowane.
Rysunek 1: Wpływ szoku czas inkubacji ciepło na przemian: Komórki
leczonych z powodu różnych razy w 42 ° C. Dane stanowią średnie ± SD trzech powtórzeń. każdy
leczenia wysiano w trzech egzemplarzach.
Wpływ temperatury szoku termicznego w transformacji:
Czterech różnych temperaturach, tj. 32 ° C, 37 ° C, 42 ° C i 47 ° C było przetestowane w celu
ustalenia
Optymalna temperatura powoduje wyższą wydajność transformacji E. coli
DH5α.Określonym czasie inkubacji 30 sekund był używany do każdego zabiegu. jak pokazano
na rysunku. 2, obserwowaliśmy sprawności przemiany (x108) z 2,07 ± 0,08, 2,4 ± 0,13,
3,31 ± 0,44 i 1,32 ± 0,17 do 32 ° C, 37 ° C, 42 ° C i 47 ° C zabiegi szoku cieplnego,
odpowiednio. Wyniki te wskazują, że temperatura 42 ° C jest optymalna do uzyskania
Maksymalna transformacji CaCl2 traktowane E. coli DH5α komórek. transformacja
wydajność jest znacznie zmniejszony w podwyższonej temperaturze 47 ° C. Został on
wykazały, że szok termiczny powoduje pewne geny do wyrażania białek szoku termicznego (HSP)
które pomagają komórkom przetrwać w podwyższonej temperaturze, a tym samym wyższe
sprawności przemiany. Możliwe jest, że 42 ° C jest optymalna temperatura
tych genów być wyrażone na optymalnym poziomie.Temperatury wyższej niż 42 ° C może być
szkodliwe dla przeżycia komórek, a tym samym spadek wydajności transformacji. to
może być również możliwe, że inkubacji w niższej temperaturze przez dłuższy okres czasu
może osiągnąć takie same wyniki.
Rysunek 2: Wpływ temperatury szoku termicznego w transformacji: Komórki inkubowano przez 30
sekund w czterech różnych temperaturach indywidualnie. Dane przedstawiają średnią ± SD z
dwóch powtórzeń. Każdy zabieg wysiano w trzech egzemplarzach.
Wpływ zimna inkubacji ciepło szok komórki traktowane na przemian:
Jak sprawności przemiany wpływają na zimno inkubacji komórek bakteryjnych
po szoku cieplnego traktowania nie jest jasno określony. Aby przetestować działanie zimna
inkubacji
(po szoku cieplnego) na transformacji E. coli, eksperyment został zaprojektowany w sposób
pokazany na rysunku. 3A. Nasze wyniki wskazują, że transformacja odbywa się jeszcze przed
ciepła
terapia szokowa jest podana do CaCl2 traktowanych komórek (rys. 3, leczenia 1). Niemniej jednak, wydajność transformacji jest około 15 razy mniejsze w porównaniu do szoku termicznego
(Ryc. 3B, leczenie 1 vs 2). Wyniki te potwierdzają wcześniejsze obserwacje, że ciepło
szok znacznie zwiększa wydajność transformacji. Niemniej jednak,
mechanizm szoku wywołanego ciepła pobieranie DNA w komórkach traktowanych CaCl2 nadal nie
jest
dokładnie znane. Przypuszcza się, że dwuwartościowych kationów, takich jak Mg2 + i Ca2 +
odgrywają znaczącą rolę w interakcji z DNA z fosfolipidów błon. te
kationy są zobowiązane do fosfolipidów i dostarczyć ładunek dodatni do nich. ujemnie
opłata DNA wydaje się dołączyć do cząsteczki lipidów w drodze mediacji dwuwartościowych
kationy (15). Nagły wstrząs pod wpływem ciepła zmienia membrany i pomaga DNA
internalizacji w szybszym tempie być może wpuklenie powierzchni komórki niosącej
związany z błoną DNA do komórek. Założenia te są obsługiwane przez wcześniejsze
obserwacji, że E. coli, z których lipopolisacharydy (LPS) mają wypłukany pokazać
wysoką wydajność transformacji, gdy przekształciła z plazmidu-LPS kompleksów
zamiast plazmidowego DNA sam (16, 17).
Rys. 3: Wpływ zimna inkubacji na przemian po leczeniu szoku cieplnego
komórek: Panel-przedstawia doświadczenia podczas panelu-B pokazuje
sprawności przemiany po odpowiedniej terapii. Numery 1, 2, 3 i 4
cztery niezależne zabiegi, jak pokazano na panelu A. liczba Tube 1 nigdy nie otrzymał szoku
termicznego. Numer rury 2 został wyposażony w SOC media natychmiast po szoku termicznego.
Numer rury 3 inkubowano w temperaturze pokojowej (RT) do 10 min po szoku cieplnego
leczenie przed otrzymaniem SOC mediów. 4 liczba Tube inkubowano w lodzie przez 10
min przed otrzymaniem SOC mediów. 0 ° C wskazuje na etapie inkubacji lodu. dane przedstawiają
średnia ± SD z 3 powtórzeń. Każdy zabieg wysiano w trzech egzemplarzach. statystyczny
znaczenie między grupami była wykonywana przez studentów niesparowany t-test za pomocą
Oprogramowanie GraphPad. Wartości prawdopodobieństwa są przedstawione na wykresie. Jak
widać na wykresie
wartości są bardzo istotne statystycznie na poziomie <0,0002 wyjątkiem jednego
grupy (leczenie 2 vs 3), który jest nieznaczna.
Co ciekawe, inkubacji komórek na lód po kroku szoku termicznego dodatkowo
zwiększa wydajność przetwarzania przez około 1,6 krotnie (ryc. 3B, leczenie 2 vs 4). Kiedy
czterech różnych niskich temperaturach inkubacji (1, 15, 30 i 60 min) szoku cieplnego postu
były testowane, 15 min zimno inkubacji wykazała maksymalną wydajność transformacji
poza którym nie ma znaczny wzrost (dane nie pokazane). Podczas ciepła
okres szoku ruchu drobnych cząsteczek plazmidu DNA właściwe komórki
Mieszanina może wzrosnąć. Jest możliwe, że ciepło szoku po lodzie etapie inkubacji
zmniejsza ruch cieplny cząsteczek plazmidu DNA, a tym samym wspieranie dalszego wiązania
z lewej na (plazmid DNA nie wychwytywana przez komórki podczas szoku cieplnego) DNA do
komórki
powierzchni. Te dodatkowe cząsteczki DNA mogą być dalej wychwytywana przez komórki,
podczas gdy
inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez godzinę w drżenie inkubatorze. Ten wysokiej
temperaturze 37 ° C
może służyć jako drugi etap szoku cieplnego, a tym samym zwiększa ogólną transformacji
efektywności E. coli. Wykazano, że konwersja z DNA do odporne DNazy
forma występuje podczas inkubacji lód po kroku szoku cieplnego (1). Jest możliwe, że DNazy
odporne postaci DNA zapewnić jej przetrwanie wewnątrz komórek, a tym samym spowodowały
wzrost
sprawności przemiany. Wydaje się, że indukcja kompetencji i wychwyt DNA
to dwa odrębne etapy, a szoku cieplnego w komórkach traktowane Ca2 + może grać
ważną rolę w absorpcji DNA. Wydaje się, że niewielki spadek
transformacji, gdy komórki są inkubowane w temperaturze pokojowej, a nie po lodzie
leczenia szoku cieplnego (ryc. 3B leczenia 3 vs 2). Być może ze względu na fakt, iż niektóre
komórek do ożywienia po ekspozycji bardzo delikatne CaCl2 komórki traktowane do temperatury
pokojowej.
Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że impuls szoku cieplnego 30 sekund w temperaturze 42 °
C
następnie 10 min lodu etapie inkubacji są idealne parametry w celu uzyskania maksymalnego
sprawności przemiany w DH5α-T1R szczep z pUC19 plazmidu DNA. To
Badanie sugeruje również, że ciepło po szoku zimna etapie inkubacji jest również ważnym
czynnik i zwiększa częstotliwość transformacji znacząco.