Cz.3_ GENETYKA_Laboratorium_2013/14

Teoria

1. PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy lub polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR) - technika amplifikacji (powielania) in vitro określonych, bądź przypadkowych, fragmentów DNA (a w pewnych przypadkach RNA). Kluczowym momentem w rozwoju tej techniki było wprowadzenie przez Kary’ego Mullisa (Saiki i wsp. 1985, Mullis i wsp. 1986, Mullis i Faloona 1987) termostabilnej polimerazy umożliwiającej przeprowadzenie wielu cykli reakcji (obejmujących denaturację DNA w 94-95°C). Reakcja polega na powielaniu fragmentu DNA na matrycy kwasu nukleinowego z użyciem starterów i termostabilnej polimerazy. Starterami są hybrydyzujące ze specyficznymi sekwencjami w DNA (annealing) oligonukleotydy wyznaczające miejsca rozpoczęcia syntezy komplementarnych nici DNA. W zależności od amplifikowanego materiału (DNA lub RNA), oraz celu prowadzonej reakcji, istnieje szereg odmian polimerazowej reakcji łańcuchowej takich jak:

Klasyczny PCR - technika umożliwiająca amplifikację specyficznych fragmentów DNA. W metodzie tej używa się jako starterów syntetycznych jednoniciowych fragmentów DNA (o długości od 10 do ok. 30

par zasad - zależnie od prowadzonej reakcji). Miejsce przyłączenia starterów wyznacza amplifikowany obszar; konieczne jest aby hybrydyzowały one z komplementarnymi nićmi, umożliwiając syntezę komplementarnych do siebie fragmentów DNA. Reakcja PCR składa się zazwyczaj z 25 do 40 cykli.

Jeden cykl stanowią następujące po sobie reakcje: a) denaturacji DNA (zazwyczaj 20-30 sek. w temp.

94-95°C), b) hybrydyzacji starterów (annealing - w zależności od stosowanych starterów 20-90 sek. w temp. 40-65°C) oraz c) syntezy komplementarnych nici (zazwyczaj 20-90 sek. w temp. 72°C). Warunki prowadzonej reakcji PCR muszą być optymalizowane (temperatura i długość cykli, ilość cykli, stosowana termostabilna polimeraza - np. Taq, Pvu, Tth, Tfl, stężenie MgCl , ilość matrycy i stężenie starterów oraz szereg innych specyficznych parametrów) dla każdego doświadczenia.

RT-PCR –( ang. reverse transcription PCR) jest odmianą PCR pozwalającą na amplifikację cząsteczek (określonych lub przypadkowych) RNA. RT-PCR jako pierwszy opisał P. Seeburg. Reakcja może przebiegać w dwóch etapach: 1) synteza jednoniciowego DNA komplementarnego do RNA (prowadzona przez odwrotną transkryptazę) oraz 2) klasyczny PCR - amplifikacja uzyskanego cDNA.

real-time PCR , (ang. real-time polymerase chain reaction) ilościowe PCR DNA (z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym,) - jest to czuła metoda analityczna wykorzystująca techniki fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w każdym cyklu prowadzonej reakcji PCR. Dzięki temu cała procedura analizy jest stosunkowo szybka i pozwala wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości produktu na początku reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej metodzie PCR. Ponadto dzięki temu, że amplifikacja kwasów nukleinowych i detekcja produktu odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu, ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalne. Metody real-time PCR nie należy mylić z metodą reverse transcription PCR (RT-PCR).

1

2. Identyfikacja płci u ptaków metodą PCR

Niektóre gatunki ptaków nie wykazują dymorfizmu płciowego, pozwalającego na oznaczenie płci dorosłych osobników na podstawie cech morfologicznych. Podobna sytuacja występuje często u młodych osobników. Dlatego do oznaczania płci ptaków wykorzystuje się analizy genetyczne oparte na metodzie PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy, ang. Polymerase Chain Reaction). W tym celu wykorzystuje się geny CHD1 zlokalizowane na chromosomach płci. Należy pamiętać, że u ptaków płcią heterogametyczna są samice, gdyż posiadają dwa różne chromosomy płci (ZW), a samce są płcią homogametyczną (ZZ). Gen CHD1-W zlokalizowany jest w chromosomie W i jest charakterystyczny dla samicy. Gen CHD1-Z znajduje się w chromosomie Z i występuje zarówno u samca jak i u samicy.

W przypadku oznaczania płci ptaków najczęściej wykorzystuje się startery zaprojektowane przez Griffithsa i in. (1998), które namnażają fragmenty genów CHD1-W i CHD1-Z (po jednym fragmencie z każdego genu, Z i W) wyraźnie różniące się długością, co umożliwia łatwy rozdział

uzyskanego produktu na żelach agarozowych. W efekcie końcowym, na obrazie elektroforetycznym widoczne są dwa prążki, gdy testowany osobnik jest samicą (ZW) lub jeden prążek, gdy osobnik jest samcem (ZZ).

1. Izolacja DNA

Analizowane próbki pochodzą od sikory modrej ( Cyanistes caeruleus) z populacji żyjącej na Gotlandii (Szwecja). DNA zostało wyizolowane z krwi ptaków przy użyciu metody Chelex-100. Jest to prosta i szybka metoda wykorzystująca polarne kuleczki żywicy (chelex), które wiążą polarne składniki komórkowe powstające po homogenizacji tkanek. W wyniku czego niepolarne jądrowe DNA i RNA pozostaje w roztworze wody powyżej Chelexu.

Protokół izolacji DNA z krwi (przygotowane wcześniej)

1.

Grudkę krwi umieścić na bibułce filtracyjnej i pozostawić na kilka minut w celu odparowania etanolu (pobierane próbki krwi są przechowywane w 96% etanolu)

2.

Wysuszoną krew przenieść do uprzednio opisanej probówki 1,5ml

3.

Dodać 200µl 5% roztworu Chelexu

4.

Próbki worteksować przez około 1 min

5.

inkubować w 56°C przez 20 min, a następnie inkubować w 94°C przez 9 min

6.

próbki wirować przez 3-5 min przy obrotach 10 000-15 000 rpm

7.

przenieść supernatant (górna, płynna warstwa (faza)) do nowej, opisanej probówki 8.

przechowywać w temp. -20°C

PYTANIA

1. Jakie znasz rodzaje PCR? Do czego służy każdy z nich?

2. Wymień czynniki odpowiedzialne za sukces reakcji PCR?

3. Dlaczego w reakcji PCR używa się termostabilnej polimerazy DNA?

4. Czy jeden protokół (dokładny skład mieszaniny, temperatury reakcji itp.) może być stosowany do namnażania różnych fragmentów DNA? Uzasadnij odpowiedź.

2

Cz.3_ GENETYKA_Laboratorium_2012

1. Ćwiczenie praktyczne – oznaczanie płci ptaków metodą PCR

Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałeś. Jednorazowe zużyte materiały wyrzuć, a materiały wielokrotnego użytku umyj.

Przed przystąpieniem do ćwiczeń przeczytaj ze zrozumieniem całą instrukcję.

Odczynniki i aparatura:

- pipety automatyczne i jednorazowe końcówki

- mikrowirówka,

- odczynniki do PCR: próbki DNA, polimeraza,

- pisaki do probówek/ ręczniki papierowe/stojaki,

bufor do PCR, MgCl2, startery, woda

pojemniki z lodem/alkohol do sterylizacji miejsca

- probówki Eppendorfa,

pracy, rękawiczki

Przygotowanie reakcji PCR

1. Sprawdź ustawienia termocyklera

2. Na lodzie przygotuj w probówce Eppendorfa 1,5 ml mieszaninę do reakcji PCR (na 5 reakcji PCR, 8 µl na reakcję):

Skład mieszaniny

1 próbka (µl)

5 próbek (µl)

woda dejonizowana

3,3

16,5

10 x bufor PCR

2,0

10,0

25mM MgCl2

0,6

3,0

2 mM dNTP mix (A, G, C i T)

1,0

5,0

starter P2

0,5

2,5

starter P8

0,5

2,5

polimeraza Taq (5U/µl)

0.1

0,5

Razem

8,0

40,0

Uwaga! Każdy odczynnik (z wyjątkiem polimerazy Taq) przed dodaniem do mieszaniny musi być rozmrożony, wymieszany i odwirowany!

3. Umieść probówki do PCR w statywie na lodzie, podpisz numerem grupy i zespołu (np. „1.1”).

Mieszaninę do PCR dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i rozdziel po 8 µl do 4 probówek do PCR;

4. Do trzech pierwszych probówek dodaj po 2 µl DNA (próbki 1-3), natomiast do ostatniej probówki dodaj 2 µl wody dejonizowanej (kontrola negatywna). Wstaw próby do termocyklera i uruchom program:

5. Wybierz właściwy program PCR (BIRDSEX) w termocyklerze i sprawdź jego poprawność: 1. Wstępna denaturacja: 94˚C, 2 minuty

2. Właściwy PCR – 30 cykli składających się z:

1. Denaturacja: 94˚C, 30 sek

2. Przyłączanie starterów: 50˚C, 30 sek

3. Elongacja: 72˚C, 60 sek

3. Post-PCR:

1. Końcowe wydłużanie: 72˚C, 10 minuty

2. Przechowywanie produktu: 8˚C

4. Po zakończeniu reakcji wyjmij próbki z bloku termocyklera

3

2. Ćwiczenie praktyczne – cięcie DNA plazmidowego za pomocę enzymów

restrykcyjnych (skrypt cz. II)

3. Ćwiczenie praktyczne – Elektroforeza w żelu agarozowym (będziemy ją przeprowadzać na lab.4) (opis ćwiczeń znajduje się również w Cz. 2 skryptu (Izolacja plazmidowego DNA) 1.

Jeden 2% żel agarozowy na grupę został przygotowany wcześniej. Żel zawiera barwnik Gel Red.

2.

Bufor który został użyty do PCR zawierał barwnik i i gliceryne dlatego w tym przypadku ni mieszamy prób z barwnikim (obciążnikiem) do elektroforezy.

3.

Do każdej studzienki w żelu nałóż 5 µl produktu reakcji PCR z odpowiednich probówek. Do pierwszej studzienki w rzędzie nałóż 5 ul standardu wielkości.

4.

Włącz zasilacz (napięcie ok. 100 V). Po ok. 15-20 minutach wyłącz aparat. Zrób zdjęcie żelu na transiluminatorze UV.

5.

Zinterpretuj uzyskane wyniki.

Literatura:

1.

Griffiths, R., Double, M. C., Orr, K., & Dawson, R. J. G. (1998). A DNA test to sex most birds. Molecular Ecology, 7(8), 1071-1075.

2.

Walsh, P. S., Metzger, D. A., & Higuchi, R. (1991). Chelex® 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques, 10(4), 506-513.

Opracowały: mgr Edyta Podmokła, dr Dominika Włoch-Salamon (na podstawie skryptu http://www.igib.uw.edu.pl)

RAPORT

1. Zinterpretuj obraz na żelu poniżej – oznacz płeć osobników z których pochodzą próby analizowane i pokazane na zdjęciu. Odpowiedź uzasadnij?

2. Zastanów się i wyjaśnij dlaczego w PCR stosuje się kontrolę negatywną?

3. Czy w przeprowadzonym eksperymencie można stosować również kontrolę pozytywną?

Uzasadnij odpowiedź.

4.

Dlaczego reakcję PCR przeprowadza się „na lodzie”

4