Regulacja ekspresji genów u eucaryota

W komórce eukariotycznej aktywnych jest jedynie 15% genów, reszta pozostaje

dezaktywowana. Wybór genów podlegających ekspresji jest wieloetapowy.

Regulacja odbywa się już na poziomie modyfikacji upakowania chromatyny, a

kończy na regulacji posttranslacyjnej.

1. Regulacja na poziomie matrycy DNA

DNA może istnieć w trzech formach

• Forma I; superzwinięta. Naprężenia nici wywołane dodatkowymi

obrotami powodują, że przybiera ona kształt warkocza

• Forma II; odpowiada rozluźnionej postaci DNA, który przybiera kształt

kolisty.

• Forma III; liniowa postać DNA.

Podstawową formą przestrzenną DNA jest forma I, umożliwiająca najlepszy

dostęp do helisy różnym białkom. Interakcja DNA-białko jest podstawą regulacji

ekspresji. Zmiana stopnia skręcenia zmienia możliwości dostępu białek do DNA,

stanowiąc tym samym czynnik regulujący ekspresję.

Mutacje w genach topoizomeraz (enzymy usuwające lub tworzące

superzwoje) zmniejszające ich aktywność, prowadzą do zmniejszenia

transkrypcji wielu genów.

Obszar DNA otaczający gen lub grupę genów ulegających ekspresji nazwano

domeną funkcjonalną. Domenę taką można znaleźć poprzez trawienie

fragmentów chromatyny DNA-zą I, która wyszukuje „wyeksponowanych”

odcinków DNA, do których ma uprzywilejowany dostęp.

Miejsca wrażliwe na DNA-zę I: odpowiadają one genom aktywnym, także

tym, które były aktywne w przeszłości (np. kodujące białka płodowe). Dowodzi

to, że geny te znajdują się w konformacji ułatwiającej DNA-zie I dostęp.

Dostępność ta odnosić się będzie prawdopodobnie także do innych białek takich

jak polimeraza RNA. Specyficzna struktura przestrzenna jest najwyższym

poziomem egulacji ekspresji, na którym odbywa się selekcja genów, które mają

być transkrybowane.

Miejsca nadwrażliwe na DNA-zę I: niektóre miejsca genomu są jeszcze

bardziej wrażliwe na enzym. W miejscach tych nie ma nukleosomów, tak więc

białka wiążące mają tu najłatwiejszy dostęp do DNA. Geny te w kontakcie z

DNA-zą nie są niszczone. Wykonuje ona tylko kilka precyzyjnych cięć, które

mogą zostać ponownie połączone. Pełni więc ona rolę restryktazy. Miejsca

nadwrażliwe najczęściej zlokalizowane są w promotorach genów aktywnych.

2. Regulacja ekspresji na drodze metylacji

Metylacja DNA polega na enzymatycznym przyłączeniu grup metylowych do

nukleotydów. U eucaryota dotyczy ona wyłącznie cytozyn wchodzących w skład

nukleotydu CpG. Metylacja wiąże się ze spadkiem aktywności transkrypcyjnej

genów. Jest ona procesem odwracalnym. Obecnie wiadomo że proces ten

odgrywa zajebiście dużą rolę w różnicowaniu się komórek.

3. Regulacja na poziomie transkrypcji

Białka regulatorowe; zwane inaczej czynnikami transkrypcyjnymi. Są to

białka oddziałujące z polimerazą RNA (np. TF II D, TF II B). są one zdolne

przyłączać się do specyficznych sekwencji DNA, mogąc regulować poziom

transkrypcji. Niektóre występują tylko w określonych typach komórek, Inne we

wszystkich. Są one kodowane przez geny regulatorowe, stanowiące 5-10%

genomu człowieka. Mają one budowę modularną i składają się z pełniących

określone funkcje domen białkowych. Powszechnie występują 3 typy domen:

(1)domeny wiążące DNA (2)domeny odpowiedzialne za dimeryzację (3)domeny

transaktywujące. Domeny wiążące DNA i odpowiedzialne za dimeryzację

zawierają

charakterystyczne

struktury

białkowe,

zwane

motywami.

Scharakteryzowano trzy typy domen wiążących:

Helisa-zwrot-helisa (HTH): białko HTH posiada dwa krótkie fragmenty

tworzące helisę, rozdzielone odcinkiem tworzącym zwrot. Jedna z dwóch helis

(rozpoznawcza) lokalizuje w cz. DNA specyficzne zasady i łączy się z nimi

słabymi wiązaniami. Połączenie helisa rozpoznawcza-DNA zależy od pozostałych

części białka. W momencie związania obie cząsteczki ulegają zmianom

konformacji.

Palce cynkowe: motyw ten zawiera atom cynku otoczony 4 aminokwasami.

Istnieją dwie formy „palców”: Cys2His2 oraz Cys4 . motyw ten jest wielokrotnie

powtórzony w domenie wiążącej DNA. Oddziaływanie zachodzi między

aminokwasy zasadowe a dużym rowkiem helisy DNA. Przykładem występowania

tego motywu jest czynnik transkrypcyjny Sp1 powszechnie występujący u

eucaryota. Palce cynkowe występują w czynnikach, będących receptorami

hormonów steroidowych. Białka GATA, istotne w rozwoju linii erytrocytalnej

(GATA-1) i innych w układzie krwiotwórczym.

Domena zasadowa zawiera motywy: helisa-pętla-helisa oraz suwak leu-

cynowy.

Suwak leucynowy: jego charakterystyczną cechą jest występowanie leucyny w

co siódmej pozycji w obrębie 35 reszt aminokwasowych. Białka suwaka tworzą

dimer złożony z dwóch skręconych łańcuchów. Leucyny, które znajdują się

wewnątrz superhelisy, stabilizują ich strukturę. W pobliżu N- końca dimerów

znajduje się 30- aminokwasowa domena wiązania DNA.

Helisa-pętla-helisa: składa się z dwóch hydrofobowych helis, oddzielonych

pętlą. W skład pętli wchodzi 12-28 aminokwasów. Przypuszczalnie helisy biorą

udział w tworzeniu heterodimerów białkowych, a pętla oddziałuje z DNA.

Regulacja ekspresji w pozycji cis i trans: wydajność transkrypcji może być

kontrolowana przez sekwencje DNA, zwane wzmacniającymi (enchancer), które

mogą się znajdować w odległości tysięcy pz od wzmacnianego genu. Mają one z

reguły długość 100-200 pz i są w stanie wiązać czynniki transkrypcyjne. Niektóre

miejsca wiążą czynniki zmniejszające wydajność transkrypcji (silencer).

Sekwencje wzmacniające posiadają szereg wspólnych właściwości

• Wzmacniają znacznie poziom transkrypcji danego genu.

• Ich inwersja nie zmienia właściwości, a jedynie lekko je osłabia (tj.

można sobie je obracać na wszystkie strony świata a Itak działają)

• Utrzymują swe właściwości nawet przemieszczone o kilka tys. Pz, ale

do pewnego punktu, kiedy je tracą.

• Mogą modyfikować strukturę przestrzenną DNA i stopień

spiralizacji.

4. Regulacja postranskrypcyjna

Wycinanie intronów- system alternatywny. Wycinanie poszczególnych

intronów jest od siebie niezależne. Może także dochodzić do usuwania

niektórych eksonów, przez co powstają białka zupełnie odmienne. Przykładem

na to jest synteza kalcytoniny w tarczycy. Produkt tego samego, co kalcytonina

genu, wytwarzany w mózgu i dojrzewający w sposób odmienny staje się

neurotransmitterem.

Redagowanie RNA. Dotyczy między innymi syntezy apolipoproteiny Apo-

B100 w wątrobie i Apo-B48 w jelicie cienkim (co to takiego ta apolipoproteina

dowiecie się na biochemii i pewnie pożałujecie swojej ciekawości). Obie

apolipoproteiny różnią się masą. Sekwencja ich RNA jest identyczna, gdyż są

kodowane przez jeden gen, ale w Apo-B48 w przepisanym mRNA następuje

zastąpienie cytozyny uracylem w pozycji 2153, co powoduje pojawienie się

kodonu STOP i wcześniejszy koniec translacji.

Regulacja przez zmianę stabilności mRNA. Stabilność mRNA określa się

używając terminu „czas półtrwania”. U bakterii wynosi on 2 minuty, a w kom.

zwierzęcych 4-24h. przykładem takiej regulacji są onkogeny c-myci c-fos,

kodujące białka, które wzmacniają ekspresję niektórych genów regulujących

przebieg cyklu komórkowego. Stabilizacja mRNA tych onkogenów powoduje

wzrost stężenia kodowanych przez nie białek, co prowadzi do wzmożonej

proliferacji. Za niestabilność prawidłowego mRNA c-mych odpowiedzialny jest

region 51 nukleotydów, głównie AT, znajdujący się w części 3’ mRNA. Delecja

tego regionu powoduje znaczne wydłużenie czasu półtrwania, czyniąc go

jebanym onkogenem.

Regulacja przez magazynowanie mRNA. Ma ono bardzo istotny wpływ na

kontrolowanie ekspresji. mRNA wielu genów zostaje zaraz po przepisaniu

zmagazynowany w jądrze lub cytozolu i nigdy nie pojawia się jakikolwiek

produkt ich translacji. W trakcie działania sygnałów takich jak hormony zmiana

stężeń białek i mRNA jest bardzo szybka, podczas gdy transkrypcja ulega tylko

nieznacznemu przyspieszeniu. W takich właśnie przypadkach uwolnione zostają

te zmagazynowane rezerwy mRNA. Dobrym przykładem tego zjawiska jest

składowanie mRNA w komórce jajowej, które nie ulega translacji. Dopiero po

pewnej liczbie podziałów zostaje użyte do produkcji białek indukujących

różnicowanie komórek. Rozmieszczenie tego mRNA w komórce jajowej nie jest

jednolite, co sprawia, że różne komórki potomne dziedziczą różną jego ilość.

5. Regulacja na poziomie translacji

Jest to etap o którym na dzień dzisiejszy gówno wiemy. Prawdopodobnie

mechanizmy kierujące tą regulacją odgrywają rolę w magazynowaniu mRNA

opisanym powyżej. Przykładem na to jest regulacja ekspresji genów globiny

przez hem. Jeżeli nie dotrze on do środowiska, bądź zostanie wyczerpany, to

translacja genów globin bardzo szybko się zatrzymuje. Hem działa za

pośrednictwem białka posiadającego aktywność kinazową wobec czynnika

inicjacji eIF-2. elementem regulacyjnym może być także obróbka nowo

powstałych białek, do której należą: glikozylacja, fosforylacja, acetylacja.

6. Regulacja pod wpływem temperatury- białka HSP

Komórki eukariotyczne reagują na nieznacznie podwyższoną temperaturę

wzmożoną syntezą polipeptydów zwanych białkami szoku cieplnego. Do ich

syntezy może dochodzić także w przypadku infekcji wirusowej, etanolu lub

innych stresorów. Wiele z HSP pełni funkcje białek opiekuńczych inne są

protezami. Występujący w komórkach zwierząt czynnik HSF, który wiązać się

może z sekwencją DNA zwaną HSE, zlokalizowanej 80-200 pz od początku

transkrypcji mRNA indukując odpowiedź szoku termicznego. Aktywacja genów

szoku cieplnego jest jedną z form odpowiedzi na stres. Aktywność jądra

komórkowego należy do najbardziej wrażliwych na stres. Synteza DNA ulega

spowolnieniu, kumulują się prekursory rRNA i zahamowane zostaje usuwanie

intronów. Nawet krótki szok cieplny wywołuje zmiany w funkcjonowaniu jądra.

7. Białka Chaperonowe

Są one powoli działającymi ATP-azami. Uczestniczą w ATP- zależnym procesie

zwijania polipeptydów oraz tworzeniu kompleksów białkowych. Biorą one udział

w formowaniu oktamerów pistonowych, przenoszenia białek przez błony

mitochondrialna i nadawania im właściwej konformacji wewnątrz organelli.

Blokują one niepożądane reakcje między cząsteczkami i utrzymują w całości

rosnący łańcuch. Kompleks ADP-chaperon ma duże powinowactwo do

niesfałdowanych, nie wykazując go wcale wobec białek natywnych. Związanie

chaperonu z polipeptydem powoduje odłączenie od niego ADP i przyłączenie

ATP. Powstały kompleks formuje kawałek polipeptydu, zużywając energię z ATP

i znowu jako ADP-chaperon przyłącza się do kolejnego niepofałdowanego

segmentu.

8. Regulacja przez hormony steroidowe

Hormony steroidowe odgrywają zajebiście dużą rolę w regulacji ekspresji,

wpływając między innymi na wzrost i różnicowanie się komórek. Sygnał

hormonalny (ligand) jest przekazywany do genu docelowego przez receptory

wewnątrzkomórkowe.

Wiązanie

liganda

uruchamia

interakcję

z

charakterystyczną regulatorową sekwencją DNA w genie docelowym (HRE-

element odpowiedzi hormonalnej). Receptor związany z ligandem ułatwia

tworzenie się kompleksu z innymi czynnikami transkrypcyjnymi i stymuluje

transkrypcję. Wszystkie receptory hormonów steroidowych posiadają identyczną

strukturę ogólną składającą się z:

• końca NH2- terminalnego specyficznego dla receptora

• regionu ok. 65 aminokwasów (domena C), który jest bardzo

konserwatywny. W domenie C występują dwa motywy palców

cynkowych.

• Regionu niekonserwatywnego o zmiennej długości.

• Zakończenia domeną o różnej długości, wiążącą hormon.

Ze względu na strukturę i funkcję receptory hormonów można podzielić na

dwie grupy; (1)zawierająca receptory glikokortykoidów, progesteronu,

androgenów i mineralokortykoidów (2)zawierającą receptory estrogenów,

hormonu tarczycy, kwasu retinowego i witaminy D3.

Element odpowiedzi hormonalnej (HRE). Są to specyficzne sekwencje

DNA, do których wiążą się aktywowane receptory hormonów steroidowych.

Regulują one ekspresję sąsiadujących genów. Badania nad HRE pozwoliły odkryć

palindromowi sekwencje 15 par zasad, mogących znajdować się w odległości 100-

kilka tys. Pz od miejsca startu transkrypcji. HRE dzieli się na 4 klasy:

• GRE- element odpowiedzi glikokortykoidów

• ERE- element odpowiedzi estradiolu

• TRE- element odpowiedzi hormonu tarczycy

• DRE- wiąże receptory sieroce (takie, których funkcji ani ligandów nie

znamy)

Ligandy aktywują geny poprzez wywoływanie niewielkich zmian w kinetyce

receptorów i jego powinowactwie do HRE, co ułatwia dostęp czynnikom

transkrypcyjnym i polimerazie. Podczas nieobecności liganda większość

receptorów zlokalizowanych jest w cytoplazmie, a kompleks receptor-hormon

migruje do jądra komórkowego aby modulować ekspresję genów. Niektóre

receptory występują w jądrze niezależnie od obecności liganda.

Białko G jest heterotrimerem ulokowanym w błonach komórkowych, który

tłumaczy i wzmacnia sygnały przekazywane do wnętrze komórki, powodując

zmianę aktywności enzymów komórkowych. Posiada ono strukturę IV rzędową i

trzy podjednostki, które wiążą i hydrolizują GTP. Białka G stają się aktywne w

interakcji z kompleksem receptor-hormon w obecności Mg2+ i GTP. W

momencie aktywacji białka G jego podjednostki dysocjują, a podjednostka alfa

aktywuję cyklazę adenylową. Powoduje to pośrednio syntezę cAMP, biorącego

udział w wielu szlakach metabolicznych.