Tom 59

2010

Numer 1–2 (286–287)

Strony

141–149

jaceK Kozdrój

Katedra Mikrobiologii

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków

E-mail: [e-mail]

IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH ZE ŚRODOWISKA — PIERWSZY KROK W

ANALIZIE METAGENOMU

Wybór właściwej metody badawczej jest wową wadą tych metod jest znaczne niedo-

podstawowym wymogiem stawianym przed szacowanie rzeczywistej różnorodności mi-

eksperymentatorem pragnącym opisać rze-

kroorganizmów, gdyż ogranicza się ona tylko

czywistość przyrodniczą. W przypadku ba-

do wyodrębnienia organizmów zdolnych do

dań

mikrobiologicznych

nieodpowiednie wzrostu na podłożu (Wellington i współaut.

decyzje na tym etapie w znacznym stopniu 1997). Przeważająca liczba bakterii występuje

skutkują błędną identyfikacją mikroorgani-

w środowisku, np. glebie, w stadium uśpie-

zmów i brakiem rzetelnego poznania ich nia (ang. dormant phase), z metabolizmem

funkcji w środowisku. Ogromna różnorod-

ograniczonym do minimum. Komórki tych

ność mikroorganizmów w środowisku jest organizmów mają rozmiary ultramikrobakte-

niewątpliwie faktem obiektywnym, lecz jej rii (0,2–0,3 µm) i są zaadaptowane do warun-

stopień poznania w zasadniczy sposób zale-

ków głodowych (tj. niedobór substancji po-

ży od tego, czy w badaniach posłużono się karmowych), jakie w glebie dominują. Trud-

tradycyjnymi technikami hodowlanymi, czy ności z wyhodowaniem takich organizmów

też zastosowano metody oparte na analizach stanowią kolejne ograniczenie dla poznania

molekularnych wyekstrahowanych kwasów bioróżnorodności w glebie (Kozdrój 2003).

nukleinowych (Kozdrój 2003). Ograniczenia Dominująca większość mikroorganizmów,

dla tych metod stwarza sam charakter śro-

które są stwierdzane jako żywe komórki me-

dowiska (np. bardziej homogeniczne lub he-

todami mikroskopowymi, nie jest w stanie

terogeniczne), właściwy sposób pobierania wyrosnąć na żadnym z obecnie znanych pod-

prób oraz ich transportu do laboratorium.

łoży mikrobiologicznych (liesacK i współaut.

Metody oparte na hodowli mikroorga-

1997). Aby poznać bioróżnorodność tych

nizmów na podłożach są proste, wygodne, organizmów trzeba posłużyć się technikami

pozwalające na równoczesne i szybkie po-

molekularnymi, które stosunkowo niedawno

równanie wielu próbek przy wykorzystaniu wprowadzono do badań nad ekologią mikro-

minimum sprzętu laboratoryjnego. Podsta-

organizmów (cooper i rao 2006).

ŚRODOWISKOWY DNA REPREZENTANTEM METAGENOMU

Ograniczenia metod hodowlanych, któ-

występujące w każdej komórce. Tego typu

re rzutują na niemożność rzetelnej oceny substancjami markerowymi są kwasy nukle-

bioróżnorodności mikroorganizmów w śro-

inowe, DNA oraz RNA, których zróżnicowa-

dowisku mogą być przezwyciężone, jeśli za-

nie sekwencji nukleotydów decyduje o róż-

stosuje się techniki oparte na bezpośrednim nicach strukturalnych oraz funkcjonalnych

wykrywaniu komórek mikroorganizmów, wy-

między poszczególnymi organizmami. Opa-

korzystując do tego celu związki chemiczne nowanie efektywnych sposobów ekstrakcji

142

jaceK Kozdrój

kwasów nukleinowych z komórek mikroor-

nie powinna go zbytnio pofragmentować, a

ganizmów lub bezpośrednio ze środowiska zanieczyszczenia w postaci białek, kwasów

oraz umiejętność właściwego odczytu infor-

humusowych czy metali powinny być zredu-

macji zakodowanej w ich strukturze przez kowane do minimum. Dodatkowo, poszcze-

miliardy lat ewolucji są podstawowymi wy-

gólne grupy mikroorganizmów (bakterie, ar-

mogami przy podejmowaniu próby oceny na cheony, grzyby, pierwotniaki) różnią się po-

tej drodze zróżnicowania organizmów wystę-

datnością na lizę swych komórek z powodu

pujących w środowisku (Milling i współaut. różnic w budowie ich osłon komórkowych.

2005). Teoretycznie trudno o bardziej repre-

W większości mikroorganizmy występują w

zentatywne substancje markerowe do analizy środowisku w postaci form drobnych i me-

bioróżnorodności, jednakże w praktyce także tabolicznie uśpionych, charakteryzujących

i w tym przypadku analiza nie jest pozbawio-

się znaczną opornością na czynniki lityczne.

na różnych ograniczeń. Należy pamiętać, że DNA otrzymywany z tych organizmów ma

DNA powinien być izolowany z możliwie jak małe rozmiary, nieefektywne w dalszych ana-

największej liczby mikroorganizmów obec-

lizach metagenomu (steele i streit 2006).

nych w danym biotopie, i co istotne, izolacja

EKSTRAKCJA DNA ZE ŚRODOWISKA GLEBOWEGO

Pierwszym

podstawowym

wymogiem lekularną mikroorganizmów. Ta oryginalna

większości procedur analizy molekularnej procedura polegała na separacji w pierw-

oraz pierwszym ograniczeniem, które musi szym etapie komórek bakterii z cząstek gle-

być przezwyciężone jest otrzymanie czy-

by przez różnicowe wirowanie, a następnie

stych kwasów nukleinowych po ich ekstrak-

lizie komórek i oddzieleniu DNA oraz RNA

cji, np. z gleby. Wydajność lizy komórek, od materii organicznej na drodze szeregu se-

efektywność i stopień oczyszczenia kwasów paracji chromatograficznych. Jak wszystkie

nukleinowych, a także wielkość uzyskanych tego typu początkowe próby ekstrakcji kwa-

kwasów nukleinowych, razem w zasadni-

sów nukleinowych bezpośrednio ze środo-

czy sposób wpływają na dalsze etapy analiz wiska, metoda Torsvik była mało efektywna

molekularnych. Niektóre grupy bakterii, np. i czasochłonna, wymagała próbek od 60 do

Firmicutes, Actinobacteria, Cyanobacteria 90 g gleby i trwała przynajmniej trzy dni. Od

trudniej ulegają lizie z uwagi na grubą war-

tego czasu metody ekstrakcji uległy znacznej

stwę peptydoglikanu w ścianie komórkowej, poprawie, osiągając stadium pełnej dojrzało-

co ma istotny wpływ na skład izolowanego z ści, dzięki czemu stały się niemal rutynowym

gleby DNA. Metody oparte na PCR są zależ-

narzędziem badawczym w szeregu labora-

ne od stopnia czystości DNA ze względu na toriach mikrobiologicznych zajmujących się

to, że reakcja PCR jest hamowana w obecno-

analizami środowiskowymi.

ści szeregu zanieczyszczeń, np. kwasów hu-

Współczesne metody ekstrakcji kwasów

minowych lub jonów metali. Z kolei szereg nukleinowych z gleby są znacznie uproszczo-

procedur opartych na klonowaniu wymaga ne oraz wymagają mniejszych próbek, przez

względnie dużych fragmentów DNA, zwłasz-

co większa ilość próbek gleby może być

cza gdy wymagana jest ekspresja całego ope-

równocześnie poddawana analizie. Ogólnie

ronu lub sekwencjonowaniu podlega meta-

zastosowanie znajdują dwa schematy ekstrak-

genom. Niekorzystne jest izolowanie dużej cji kwasów nukleinowych: bezpośrednio z

ilości małych fragmentów DNA, gdyż zwięk-

gleby, wprowadzony po raz pierwszy przez

sza to częstotliwość tworzenia różnych arte-

ograM i współaut. (1987), oraz pośrednio

faktów w trakcie PCR (trevors i van elsas z wcześniej uzyskanej frakcji komórkowej,

1995, cooper i rao 2006).

wprowadzony przez Holben i współaut.

Wiele metod izolacji bakteryjnego DNA z (1988). Większość współczesnych procedur

różnego typu gleb opublikowano w różnych opartych jest na bezpośredniej lizie komó-

czasopismach od 1980 r., kiedy to Vigdis rek mikroorganizmów w glebie, a następnie

Torsvik z Uniwersytetu w Bergen (Norwe-

ekstrakcji uwolnionych kwasów nukleino-

gia) opublikowała po raz pierwszy procedu-

wych (DNA lub RNA) i ich dalszym oczysz-

rę izolacji bakteryjnego DNA z gleby (tor-

czaniu. Wysoce krytycznym etapem bezpo-

sviK 1980), zapoczątkowując w ten sposób

średnich procedur jest skuteczność lizy ko-

nową subdyscyplinę naukową, ekologię mo-

mórek w obecności koloidów glebowych,

Izolacja kwasów nukleinowych ze środowiska

143

chociaż rozpuszczenia komórek wszystkich binacji. Procedura zaproponowana przez van

mikroorganizmów występujących w glebie elsas i współaut. (1997), w odniesieniu do

prawdopodobnie nigdy nie uda się uzyskać. gleb o większej zawartości materii organicz-

Stosuje się rozmaite metody lizy komórek nej, wymagała stosowania wspomnianych re-

mikroorganizmów: (i) enzymatyczna liza uży-

agentów z dodatkowym jednym lub nawet

wając lizozymu, proteinazy K lub pronazy, więcej etapami oczyszczania na kolumien-

(ii) chemiczna liza, np. traktowanie siarcza-

kach (np. Wizard firmy Promega) zawiera-

nem dodecylosodowym (SDS), fenolem lub jącymi specjalną żywicę zatrzymującą zanie-

różnymi detergentami, (iii) szok termiczny czyszczenia. Podobne działanie selektywnego

(cykle zamrażania i podgrzewania), (iv) wy-

wiązania lub strącania, np. białek oraz sub-

korzystanie mikrofal, (v) wykorzystanie ul-

stancji humusowych obecnych w surowym

tradźwięków, (vi) mechaniczna liza przez ekstrakcie DNA wykazują kolumny Sephadex

rozbijanie komórek perełkami szklanymi w do filtracji żelowej, kolumny do chromato-

młynie udarowym lub mielenie na sucho, grafii jonowymiennej, mleczko szklane (ang.

albo w obecności ciekłego azotu oraz (vii) glassmilk), elektroforeza w żelu agarozowym

różne kombinacje wspomnianych metod. oraz poliwinylopirolidon (PVP) lub poliwi-

Efektem zastosowanych metod jest uzyska-

nylopolipirolidon (PVPP) (cullen i HirscH

nie kwasów nukleinowych o różnym stopniu 1998). W celu osłabienia efektu nukleaz

zanieczyszczenia białkami, polisacharydami, uwalnianych z komórek podczas lizy, a tak-

kwasami humusowymi, lipidami oraz składni-

że tych obecnych w glebie (zaadsorbowane

kami mineralnymi, a także o różnym stopniu na koloidach glebowych), które w znacznym

pofragmentowania w zależności od tego, jak stopniu mogą wpływać na reprezentatyw-

drastyczna była metoda bezpośredniej lizy ność uzyskanego DNA poprzez jego degra-

komórek, co z kolei zależy od rodzaju gleby dację, dodaje się na początku ekstrakcji ety-

(robe i współaut. 2003). Metody fizyczne, lenodiaminotetraoctan (EDTA) a następnie

jak wspomniane wykorzystanie ultradźwię-

(w niektórych procedurach) fenol. Dodatek

ków, czy rozbijanie komórek w młynie uda-

EDTA wiąże wolne kationy Mg2+ niezbędne

rowym skutkują znacznym pofragmentowa-

dla funkcjonowania nukleaz, podczas gdy fe-

niem DNA do rozmiarów od 5 do 10 kb, a nol inaktywuje wszystkie enzymy obecne w

nawet mniejszych (KusKe i współaut. 1998). ekstrahowanej próbce gleby. Zwiększając stę-

Natomiast, liza komórek oparta na SDS w żenie EDTA w buforze ekstrakcyjnym moż-

połączeniu z mieleniem i cyklem zamrażania na otrzymać większy uzysk DNA, kosztem

i topnienia przynosi większy uzysk DNA o jednakże jego czystości. Dlatego też, wybór

fragmentach od 20 do 40 kb otrzymywanymi odpowiedniego buforu ekstrakcyjnego musi

nawet od większości bakterii gramdodatnich być efektem kompromisu między spodziewa-

(KrseK i Wellington 1999).

ną ilością DNA, a wymaganą czystością tego

Różne typy gleb wymagają stosowania polimeru (robe i współaut. 2003).

odmiennych procedur ekstrakcji kwasów

Poszczególne procedury ekstrakcji DNA z

nukleinowych zarówno na etapie lizy komó-

gleby dają przeciętnie od kilku do kilkudzie-

rek mikroorganizmów, jak i podczas etapów sięciu µg DNA w gramie gleby, a uzyskane

oczyszczania. W zasadzie dobór procedur od-

fragmenty DNA mają na ogół od 10 do 40

bywa się eksperymentalnie przez porówna-

kb. Im procedury oczyszczania są efektyw-

nie ilości uzyskiwanego DNA lub RNA (wy-

niejsze, tym uzyskane DNA jest czystsze, co

dajność ekstrakcji) oraz ich jakości (czystość, pokazują wartości stosunków mierzonej ab-

wielkość fragmentów). Etapy oczyszczania sorbancji A /A (>1,7) oraz A /A (>2,0).

260

280

260

230

DNA są mniej lub bardziej rozbudowane w Spośród różnych metod ekstrakcji DNA me-

zależności od struktury gleby (zawartość tody zawierające etap(y) rozbijania perełkami

frakcji ilastej), ilości substancji organicznych szklanymi (ang. bead-beating) próbek gleby

oraz innych potencjalnych inhibitorów (np. w młynie udarowym dają największe ilości

jony metali) enzymatycznych reakcji moleku-

DNA (najmniej DNA ulega wtórnej adsorpcji

larnych, w których uczestniczyć będzie wy-

na cząstkach ilastych) oraz mało towarzyszą-

izolowane DNA (Milling i współaut. 2005). cych związków humusowych o brązowym

Przykładowe sposoby oczyszczania DNA zabarwieniu, przez co stopień czystości DNA

opierają się na strącaniu octanem potasu, jest zwiększony. Natomiast DNA może być

glikolem polietylenowym (PEG), etanolem, bardziej pofragmentowany, zwłaszcza przy

izopropanolem lub mieszaniną chloroformu nienajlepiej dobranych parametrach rozbija-

z fenolem, stosowanych osobno lub w kom-

nia, chociaż większą fragmentację otrzymuje

144

jaceK Kozdrój

się przy stosowaniu ultradźwięków (KrseK i a także przez stosowanie ultradźwięków

Wellington 1999, robe i współaut. 2003). (robe i współaut. 2003).

Wydajność procedury opartej na rozbijaniu

Metody pośrednie opierają się na różnych

sięga 80% z próbek gleby o wielkości od 250 zjawiskach fizycznych lub chemicznych słu-

mg do 1 g, podczas gdy, np. liza za pomocą żących separacji komórek z cząstek glebo-

wysokiej temperatury oraz SDS (ang. hot-SDS wych. Nie ma najlepszej, uniwersalnej meto-

lysis) prowadzi do strat od 81 do 90 % DNA dy, gdyż gleby są niezwykle zróżnicowane i

(cullen i HirscH 1998). W dużym stopniu na dlatego należy odpowiednie metody, a nawet

ilość oraz jakość uzyskiwanego DNA wpływa ich kombinacje dobierać indywidualnie. Nie-

skład buforu ekstrakcyjnego, a zwłaszcza za-

mniej wydajność ekstrakcji komórek bakterii

wartość EDTA oraz obecność kationów Na+, rzędu od 30 do 50% w przypadku w gleb

które zarówno chronią DNA przed degrada-

torfowych oraz od 20 do 30 % w przypadku

cją, jak i zmniejszają jego zdolność adsorpcji gleb ilasto-gliniastych (uprawne oraz leśne)

do koloidów glebowych. Ta ostatnia cecha można uzyskać stosując wirowanie w obec-

DNA znacznie utrudnia możliwość analizy ności gradientu Nycodenz. Niektóre grupy

maksymalnej liczby populacji mikroorga-

mikroorganizmów są szczególnie trudne do

nizmów występujących w glebie, gdyż tyl-

ekstrakcji z koloidów glebowych. Dotyczy

ko część DNA (od kilku do 25%) może być to, na przykład metanotroficznych bakterii

uwolniona z agregatów glebowych, jak wy-

w torfie, jak również bakterii utleniających

kazały eksperymenty z wprowadzaniem na-

amoniak w glebach ilasto-gliniastych (baKKen

tywnego DNA bakteriofaga lambda do suchej i lindaHl 1995).

gleby (Frostegard i współaut. 1999). Wynika

Wydajną pośrednią metodę ekstrakcji

z tego, że nawet jeśli dojdzie do uwolnienia DNA z gleby, która łączy prostotę z wydaj-

z agregatów glebowych komórek bakterii, nością uzyskiwanego DNA opracowali van

a następnie ich lizy, co samo w sobie jest elsas i współaut. (1997). Procedura ta jest

trudne ze względu na dominowanie (od 50 stosunkowo szybka i łączy skuteczność piro-

do 70%) w glebie form drobnych (< 0,5 µm) fosforanu sodu w rozbijaniu wiązań w agre-

trudno dostępnych, to uzyskanie maksymal-

gatach glebowych ze skuteczną lizą komórek

nie reprezentatywnego bakteryjnego DNA bakteryjnych oraz dalszą ekstrakcją i oczysz-

napotyka znaczne przeszkody.

czaniem DNA według procedury stosowanej

Pomimo ograniczeń metody bezpośred-

oryginalnie podczas ekstrakcji bezpośredniej.

nie przeważają, jeśli chodzi o uzyskiwanie Otrzymany w ten sposób DNA specyficznie

jak największej ilości DNA, który jest też reprezentuje bakterie występujące w glebie,

maksymalnie reprezentatywny dla zespo-

zarówno ich ogół, jak i tę część, która pod-

łów mikroorganizmów występujących w daje się hodowli. Jednakże w większości są

badanych glebach. Metody pośrednie eks-

to populacje lub gatunki dominujące w da-

trakcji DNA, polegające na wstępnym otrzy-

nej glebie, gdyż tylko w odniesieniu do nich

maniu frakcji bakteryjnej a następnie eks-

otrzymuje się podobne rezultaty, jak w przy-

trakcji DNA z komórek i jego oczyszczeniu, padku DNA ekstrahowanego bezpośrednio

są mniej wydajne, choć generują niekiedy z gleby. Bakterie mniej licznie występujące

lepszej jakości DNA (czystszy, większe frag-

w danej glebie mogą być wykryte jedynie

menty) pozbawiony dodatku zewnątrzko-

po bezpośredniej ekstrakcji DNA (saano i

mórkowego DNA, czego nie da się uniknąć współaut. 1995, steele i streit 2006).

podczas ekstrakcji bezpośrednich. Podsta-

Łagodne metody lizy otrzymanej frakcji

wowym ograniczeniem metod pośrednich komórkowej w połączeniu z oczyszczaniem

jest efektywność ekstrakcji frakcji komórko-

DNA poprzez wirowanie w gradiencie CsCl

wej z gleby, którą maksymalizuje się przez pozwalają uzyskać wysokiej jakości DNA o

stosowanie niespecyficznych detergentów wielkości przekraczającej 100 kb (robe i

w połączeniu z glikolem polietylenowym, współaut. 2003). Dalsze zwiększanie wiel-

żywic jonowymiennych (np. Chelex 100), kości DNA (ponad 300 kb) można uzyskać

dyspersji próbek gleby przez homogenizację przez zintegrowanie etapu ekstrakcji komó-

metodą rotacyjnego tłuczka (ang. rotating rek bakterii przez wirowanie z łagodną lizą

pestle) lub w standardowym homogenizato-

zanurzonych w agarozowych korkach komó-

rze Waringa, separacji komórek przez szyb-

rek i rozdziałem DNA przez elektroforezę

koobrotowe wirowanie w obecności gra-

żelową w pulsacyjnym polu elektrycznym

dientu Nycodenz lub wirowanie w gradien-

(PFGE). W ten sposób uzyskano fragmenty

cie sacharozy, Percollu, Ficollu oraz CsCl, DNA umożliwiające skuteczne skonstruowa-

Izolacja kwasów nukleinowych ze środowiska

145

nie fosmidowej biblioteki metagenomu gle-

wanego wspomnianymi metodami (robe i

bowego o wielkości przekraczającej 3,5 Gb współaut. 2003). Wybór jednej bądź drugiej

(robe i współaut. 2003).

metody ekstrakcji DNA z gleby zależy od ce-

Metody pośrednie izolacji DNA z gleby, lów badawczych. Jeżeli pragnie się uzyskać

oparte na wyodrębnianiu frakcji komórko-

względnie dużo DNA o szerokim spektrum

wej bakterii, zapewniają uzyskanie jedynie reprezentatywności mikroorganizmów wy-

od 20 do 50% całości DNA bakteryjnego stępujących w danej glebie, to niewątpliwie

metagenomu glebowego (baKKen i lindaHl należy zastosować metody bezpośredniej eks-

1995). Skuteczniejsze w tym względzie są trakcji. Natomiast, gdy celem jest uzyskanie

metody bezpośredniej ekstrakcji, które po-

DNA wysokiej jakości do procedur moleku-

zwalają otrzymać DNA z ponad 60% wszyst-

larnych czułych na różne inhibitory oraz gdy

kich bakterii występujących w danej glebie potrzebny jest DNA o dużej masie molekular-

(More i współaut. 1994). Jakkolwiek te róż-

nej, to preferowane są metody pośrednie bez

nice są wymowne, to jednak należy pamię-

względu na ich pracochłonność. Ponadto,

tać, że istotny wpływ na otrzymane wyniki DNA otrzymany z wyizolowanej bakteryjnej

mają obecne wspólnie z DNA wyekstraho-

frakcji komórkowej zawiera zaledwie do 8%

wane zanieczyszczenia oraz wrażliwość na te fragmentów eukariotycznego DNA w porów-

zanieczyszczenia dalszych stosowanych pro-

naniu do 61-93% tych sekwencji obecnych w

cedur molekularnych. Przykładem może być bezpośrednich ekstraktach DNA z gleby. W

różna wrażliwość enzymów restrykcyjnych konsekwencji, konstruowane biblioteki me-

na obecne kwasy humusowe ekstrahowa-

tagenomu bakteryjnego odpowiednich gleb

ne w różnej ilości przez metody pośrednie są znacznie lepszej jakości w przypadku ko-

i bezpośrednie. Skutkiem tego jest odmien-

rzystania z pośrednich metod ekstrakcji DNA

ny profil bakteryjnego DNA otrzymywany (gabor i współaut. 2003).

w wyniku analizy restrykcyjnej DNA izolo-

OCZYSZCZANIE EKSTRAKTÓW DNA

Mimo znacznych postępów poczynionych zestawy do ekstrakcji DNA z gleby (np. Ul-

w kierunku zwiększenia efektywności oraz traClean TM Soil DNA, FastDNA R SPIN R, Soil

uproszczenia metod oczyszczania kwasów Master TM DNA Extraction), które znajdują za-

nukleinowych, ten etap w dalszym ciągu stosowanie w przypadku różnych gleb oraz

stwarza problemy przy badaniu różnych gleb. gwarantują otrzymanie czystego DNA w cza-

Dlatego tak trudno jest opracować uniwersal-

sie krótszym niż 30 min. Znaczący postęp na

ną procedurę otrzymywania DNA z gleby, co drodze opracowania systemu automatyzacji

powoduje, że praktycznie dla każdej gleby, lizy komórek i oczyszczania DNA glebowe-

zwłaszcza ze względu na jej zmienność skła-

go, z możliwością przeprowadzania natych-

du materii organicznej, musi być optymalizo-

miast reakcji PCR, dokonano przy udziale

wana specyficzna metoda, która w odniesie-

naukowców z Departamentu Energii Północ-

niu do innej gleby może być mało skuteczna. noatlantyckich Laboratoriów (USA) oraz De-

Różnice między eksperymentatorami także partamentu Obrony (USA) (ograM 2000).

wpływają na zmienność uzysku DNA między Również w Narodowym Laboratorium w Los

laboratoriami, skłaniając do opracowywania Alamos (USA) zespół naukowców opraco-

nowych procedur przez każde laboratorium wał metodę ekstrakcji DNA, która znacząco

z osobna. Nawet w jednym laboratorium uprościła szeroko stosowane metody ekstrak-

uzyskiwane wyniki (ilość DNA, jego jakość) cji DNA, jego oczyszczania oraz ilościowego

mogą być znacząco odmienne. Dlatego też oznaczania w próbkach pochodzących z róż-

znaczne nadzieje wiąże się z opracowaniem nych gleb. W metodzie tej połączono zmo-

jednej metody ekstrakcji DNA, która byłaby dyfikowane protokoły ekstrakcji za pomocą

jednakowo wydajna w każdej glebie, sku-

szoku termicznego i detergentu (SDS) oraz

tecznie rozpuszczałaby wszystkie komórki, rozbijania mieszaniną perełek szklanych o

byłaby szybka oraz mogłaby być zastosowana różnej wielkości, dzięki czemu można było

do wielu próbek równocześnie. Dałoby to wydajnie ekstrahować DNA zarówno z ko-

możliwość automatyzacji procedur oraz ich mórek wegetatywnych, jak i spor różnych

standaryzacji między różnymi laboratoriami. mikroorganizmów. Uproszczono również

Kilka firm opracowało i sprzedaje kompletne etapy oczyszczania DNA, eliminując szkodli-

146

jaceK Kozdrój

we reagenty, takie jak fenol, chloroform, hy-

ści, zależnie od typu gleby, kwasy humusowe

drochlorek guanidyny, CsCl oraz butanol, do mają istotny w tym udział, dodatkowo wcho-

jednego etapu na mikrokolumnach wypeł-

dząc w różne interakcje z reagentami użyty-

nionych Sephadex G200 (KusKe i współaut. mi w trakcie ekstrakcji DNA. Dlatego istotne

1998). Zaletą dodatkową tej metody jest nie znaczenie w wyeliminowaniu tego problemu

tylko prostota i szybkość, ale także możli-

ma opracowanie procedury usuwania kwa-

wość przeprowadzania jej w warunkach po-

sów humusowych jeszcze na etapie poprze-

lowych, wykorzystując podstawowy przeno-

dzającym lizę komórek mikroorganizmów.

śny sprzęt laboratoryjny. W celu osiągnięcia Znaczącym postępem wydaje się być meto-

większej efektywności oczyszczania DNA na da zaproponowana przez peršoH i współaut.

mikrokolumnach oraz większej czułości de-

(2008) do równoczesnej ekstrakcji DNA i

tekcji fragmentów DNA podczas PCR, zapro-

RNA, wykorzystująca różne stężenia Al (SO )

2

4 3

ponowano przeprowadzanie dwukrotnego (od 40 do 90 µM, zależnie od typu gleby) do

oznaczania ilości DNA w trakcie całej pro-

strącania kwasów humusowych obecnych w

cedury jego izolacji z gleby. W pierwszym glebie nawet w ilości większej niż 200 mg w

etapie stężenie DNA należy oznaczać w suro-

przeliczeniu na gram świeżej masy. Również

wym ekstrakcie przed wprowadzeniem go na użycie do ekstrakcji DNA buforu zawierają-

mikrokolumny, dzięki czemu wiadoma jest cego kompleks bromku cetylotrimetyloamo-

ilość DNA podlegającego oczyszczaniu. W niowego z ditiotreitolem (CTAB-DTT) dało

drugim etapie oznaczane jest stężenie DNA możliwość otrzymywania wysokiej jakości

w wycieku z mikrokolumny, przez co znana DNA z różnych gleb, które z sukcesem mo-

jest dokładna ilość DNA wprowadzanego do gło być użyte do analizy różnorodności bak-

mieszaniny reakcyjnej PCR. W obydwu przy-

terii i grzybów (tHaKuria i współaut. 2008).

padkach, oznaczanie ilości DNA, niezależnie Alternatywnym sposobem izolacji DNA w

od obecności kwasów humusowych, doko-

obecności kwasów humusowych i innych za-

nuje się przez pomiar spektrum absorpcyjne-

nieczyszczeń jest wykorzystanie metody wią-

go UV-Vis w połączeniu z pomiarem sygnału zania DNA na zasadzie hybrydyzacji w polu

fluorescencyjnego kompleksu DNA z bar-

magnetycznym, wykorzystując w tym celu

dzo czułym barwnikiem PicoGreen (starK albo jednoniciowe DNA znakowane biotyną,

i współaut. 2000). Połączenie uproszczonej albo specyficzne klamry i oligomery pepty-

procedury ekstrakcji DNA z dwukrotnym dowych kwasów nukleinowych pełniących

oznaczaniem jego ilości pozwala na sprawne rolę sondy w stosunku do izolowanego DNA

przygotowanie wielu próbek z różnych gleb (robe i współaut. 2003). W celu zwiększenia

do kompleksowej analizy genetycznej, redu-

reprezentatywności wyekstrahowanego DNA

kując do minimum prawdopodobieństwo dla całego metagenomu glebowego opraco-

otrzymywania fałszywie pozytywnych (rozbu-

wano procedurę sekwencyjnego izolowania

dowane procedury ekstrakcji) lub fałszywie pozakomórkowego DNA (eDNA) oraz ko-

negatywnych wyników podczas PCR.

mórkowego DNA (iDNA). Wykorzystano do

Pomimo wspomnianych osiągnięć, w dal-

tego metodę alkalicznego przemywania gleby

szym ciągu trwają próby udoskonalania me-

0,12 M roztworem Na HPO (pH 8,0), otrzy-

2

4

tod ekstrakcji DNA z gleby. Bardzo newral-

mując surowy eDNA, a następnie pozostały

giczny dla całości procedury jest etap oczysz-

osad gleby poddawano mechaniczno-che-

czania DNA, w wyniku którego może docho-

micznej obróbce w celu doprowadzenia do

dzić do straty nawet powyżej 50% DNA (car-

lizy komórek mikroorganizmów i uzyskania

rigg i współaut. 2007). Obecne w różnej ilo-

iDNA (ascHer i współaut. 2009).

IZOLACJA DNA ZE ŚRODOWISKA WODNEGO

W porównaniu do gleby, ekstrakcja kwa-

wych lub przez odwirowanie, a następnie

sów nukleinowych z mikroflory wodnej jest poddawane alkalicznej lizie oraz proteolizie

prostsza, gdyż środowisko te jest mniej struk-

lub też mogą być rozpuszczane przez lizo-

turalnie heterogeniczne i nie ma potrzeby zym (soMMerville i współaut. 1989). Surowy

stosowania rozbudowanych procedur eks-

ekstrakt kwasów nukleinowych zostaje uwol-

trakcji i oczyszczania. Komórki mikroorgani-

niony z filtra, a następnie oczyszczany przez

zmów, pochodzące z 300 do 1000 ml próbki wirowanie w gradiencie CsCl lub mieszanie

wody, są zagęszczane na filtrach membrano-

z octanem amonu i wytrącanie etanolem, da-

Izolacja kwasów nukleinowych ze środowiska

147

jąc wystarczająco czyste preparaty chromoso-

plifikuje się DNA, nie usuwając filtra z pro-

malnego i plazmidowego DNA lub różnych bówki reakcyjnej (bej i MaHbubani 1996).

rodzajów RNA (np. 5S, 16S oraz 23S rRNA). Alternatywnym sposobem jest przeprowadza-

Oprócz tego, inne metody ekstrakcji DNA nie lizy wychwyconych komórek bezpośred-

(np. wirowanie w gradiencie CsCl i bromku nio na filtrze poliwęglanowym przy użyciu

etydyny, powtarzalne traktowanie miesza-

lizozymu, a następnie oczyszczanie uwolnio-

niną chloroformu i fenolu) lub rRNA (np. nego DNA przez ekstrakcję mieszaniną chlo-

wielokrotne traktowanie poliwinylopolipi-

roformu i fenolu oraz wytrącanie etanolem

rolidonem, PVPP) znajdują swoje zastosowa-

DNA o wystarczającej czystości dla reakcji

nie (Weller i Ward 1989, paul i współaut. PCR i innych dalszych analiz molekularnych

1990). Komórki mikroorganizmów występu-

(bej i współaut. 1990). Efektywność ekstrak-

jące w wodzie pitnej lub względnie przej-

cji kwasów nukleinowych zwiększa się przez

rzystej wodzie powierzchniowej mogą być optymalizację etapu zagęszczania komórek

także zagęszczane na filtrach membranowych mikroorganizmów, stosując różne filtry oraz

opornych na warunki PCR. W ten sposób, urządzenia filtrujące, a także przez dobór

przeprowadza się lizę komórek, np. metodą optymalnej metody lizy komórek (trevors i

szoku termicznego, a następnie od razu am-

van elsas 1995).

EKSTRAKCJA RNA AKTYWNEJ METABOLICZNIE FRAKCJI METAGENOMU

W porównaniu ze stosunkowo dobrze je się homogenizacji w specjalnym buforze,

opanowanymi metodami ekstrakcji DNA, co prowadzi do mechanicznej lizy komórek

otrzymywanie RNA z populacji mikroorga-

bakterii, a następnie otrzymuje się frakcję

nizmów występujących w środowisku jest rybosomalną przez etapy wirowania, unika-

słabiej opanowane. Niemniej jednak, analiza jąc zanieczyszczenia kwasami humusowymi

RNA znajduje zastosowanie przy ocenie róż-

oraz degradacji RNA. Stosując reagenty (po-

norodności aktywnej metabolicznie frakcji liwinylopirolidon oraz albuminę z osocza

bakterii, co jest o tyle ułatwione, że sekwen-

wołu) blokujące adsorbujące powierzchnie

cje matrycowe są naturalnie amplifikowane minerałów ilastych oraz eliminujące związ-

dzięki temu, że komórki zawierają tysiące ki humusopodobne, a następnie przeprowa-

rybosomów. Ekstrakcja RNA jest procesem dzając ekstrakcję fenolową, otrzymuje się

trudnym z uwagi na znaczną labilność i krót-

oczyszczony rRNA gotowy do dalszych analiz

kotrwałość w przypadku mRNA w warun-

molekularnych (hybrydyzacji oraz RT-PCR).

kach glebowych (rRNA jest bardziej stabil-

Wydajność tej procedury sięga około 0,2 µg

ny), a także wszechobecność rybonukleaz, rRNA z grama różnych gleb, i jest o wiele

które podczas ekstrakcji DNA nie stanowią większa niż w przypadku początkowych pro-

problemu, natomiast w przypadku otrzymy-

cedur opartych na bezpośredniej fenolowej

wania RNA muszą być wyeliminowane. Dla-

ekstrakcji rRNA, które dawały około 10 ng

tego też procedury ekstrakcji RNA wymaga-

rRNA. Metoda bezpośredniej ekstrakcji rybo-

ją większego reżimu laboratoryjnego. Jed-

somów z bakterii glebowych wymaga jednak-

ne metody wymagają kwaśnych warunków że stosowania szybkoobrotowych wirówek

ekstrakcji w celu usunięcia białek, lipidów oraz ultrawirówek, które niekoniecznie są na

i DNA przez rozdział fazowy stosując fenol wyposażeniu każdego laboratorium.

i chloroform (lüdeMann i współaut. 2000).

Alternatywna metoda opracowana przez

Inne metody wykorzystują rozkład enzyma-

duarte i współaut. (1998) pozwala na szybką

tyczny zanieczyszczeń w celu otrzymania i prostą pośrednią ekstrakcję rRNA, która do

czystych preparatów RNA (griFFitHs i współ-

etapów oczyszczania surowego ekstraktu jest

aut. 2000). Pierwsze metody ekstrakcji RNA wspólna z pośrednią ekstrakcją DNA. Metoda

z gleby były mało efektywne z racji częstej opiera się na działaniu pirofosforanu sodu, roz-

obecności DNA oraz zanieczyszczeń pocho-

bijającego wiązania między komórkami a agre-

dzących z gleby (np. kwasy humusowe, mi-

gatami glebowymi, prowadzącego do otrzyma-

nerały ilaste). Rozwiązanie tego problemu nia frakcji bakteryjnej, która następnie podda-

powstało w momencie opracowania meto-

wana jest etapom lizy przy udziale rozbijania

dy bezpośredniej selektywnej ekstrakcji nie-

perełkami szklanymi oraz ekstrakcji gorącym

tkniętych rybosomów z mikroorganizmów kwaśnym fenolem. W rezultacie otrzymuje się

występujących w glebie (FelsKe i współaut. od 0,25 do 1 µg rRNA z grama gleby, co sta-

1996). W tej metodzie próbkę gleby podda-

nowi od 2,5 do 5-krotnie mniejszą ilość niż

148

jaceK Kozdrój

równocześnie ekstrahowanego DNA. Biorąc zakładając bezproblemowy przebieg lizy i uzy-

pod uwagę przeciętną zawartość rybosomów sku kwasów nukleinowych. Porównawcze ba-

w komórkach bakterii oraz liczebność bakterii dania różnych metod stosowanych do ekstrak-

w gramie gleby (np. glinie pylastej) wynoszącą cji rRNA i mRNA z gleby wykazały, że skład

około 109 komórek, wydajność tej procedury aktywnego metabolicznie zespołu mikroorga-

ekstrakcji rRNA wynosi od 10 do 30% (duar-

nizmów oraz udział ilościowy poszczególnych

te i współaut. 1998). Tej wielkości wydajność

członków tego zespołu zasadniczo zależy od

jest do zaakceptowania przy badaniu populacji rodzaju wykorzystanej metody ekstrakcji glebo-

bakterii w glebie, jeśli uwzględni się, jaka jest wego RNA (sessitscH i współaut. 2002).

efektywność ekstrakcji komórek lub DNA oraz

UWAGI KOŃCOWE

Poznawanie metagenomów różnych śro-

metody izolacji DNA/RNA ze środowiska,

dowisk lądowych i morskich jest obecnie

zwłaszcza z różnych gleb, która dawałaby

poważnym wyzwaniem, przed jakim stają

dużą ilość czystego i mało pofragmentowa-

mikrobiolodzy, nie tylko ze względów po-

nego DNA, a w przypadku RNA, dodatkowo

znawczych, ale także z uwagi na zrozumienie

jeszcze odpowiednio stabilnej poza komórką

roli ekologicznej, jaką spełniają zespoły mi-

makrocząsteczki. Pojawiają się coraz to nowe

kroorganizmów w biosferze oraz ze względu

propozycje opracowywane w różnych labo-

na olbrzymi i w znikomym stopniu poznany

ratoriach, które próbują pretendować do tej

potencjał do biotechnologicznego wykorzy-

roli. Niestety, są to tylko próby, gdyż zbyt

stania. Skuteczne zmierzenie się z tym wy-

wiele jest różnych zmiennych oddziałujących

zwaniem jest możliwe pod warunkiem, że

na proces izolacji DNA/RNA w różnych gle-

do dyspozycji badaczy są wydajne metody

bach, utworach geologicznych czy odpadach

ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz odpo-

przemysłowych. W rezultacie, dla każdego

wiednie techniki ich dalszej analizy. Idealną

biotopu czy siedliska należy dobierać odpo-

sytuacją by było opracowanie uniwersalnej

wiednią metodę ekstrakcji DNA/RNA.

ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS FROM THE ENVIRONMENT — THE FIRST STEP IN

METAGENOME ANALYSIS

S u m m a r y

Recently, increasing interest in ecology of micro-

better represents its bacterial or fungal metagenome;

organisms has been associated with the possibility of

hence, this approach has been used more often than

direct analysis of microbial community structure due

the fractionation methods. Although direct extraction

to application of molecular methods based on isolated

of DNA is less labour-intensive and yield more DNA,

metagenome DNA. The metagenome approach can

the recovered DNA fragments are usually smaller than

provide a cultivation-independent assessment of the

those obtained by the indirect approach are. The frac-

largely untapped genetic reservoir of soil or water mi-

tionation method is advantageous for soil samples con-

crobial communities. However, the crucial step in this

taining higher amounts of organic matter or other sub-

approach is efficient extraction of high-quality total

stances that interfere with DNA isolation. This method

DNA representing the metagenome of a habitat. The

is also applied for DNA extraction from water samples.

DNA extraction methods for soil habitats are grouped

Microbial ecologists currently use different commer-

into two major types, i.e. indirect based on the recov-

cially available kits for total DNA isolation from soil

ery of microbes (e.g. bacterial cells) and their subse-

or water. However, it would appear that the most ef-

quent lysis, and direct lysis of cells in the sample fol-

ficient method of DNA extraction from environmental

lowed by DNA purification. The direct extraction of

samples is still far from being established.

total DNA from an environmental sample presumably

LITERATURA

ascHer j., ceccHerini M. t., pantani o. l., agnelli

j. t., van elsas J. D. (red.). Springer-Verlag, He-

a., borgogni F., guerri g., nannipieri p., pietra-

idelberg, 9–27.

Mellara G., 2009. Sequential extraction and ge-

bej K. a., MaHbubani M. H., 1996. Current develop-

netic fingerprinting of a forest soil metagenome.

ment and applications of nucleic acid techno-

Appl. Soil Ecol. 42, 176–181.

logy in the environmental sciences. [W:] Nucle-

baKKen l. r., lindaHl V., 1995. Recovery of bacterial

ic acid analysis. Priciples and bioapplications.

cells from soil. [W:] Nucleic acids in the envi-

dangler cH. a. (red.). Wiley-Liss, Inc., New

ronment: methods and applications. trevors

York, 231–274.

Izolacja kwasów nukleinowych ze środowiska

149

bej K. a., steFFan r. j., diceasre j. l., HaFF l., atlas

More M. i., HerricK j. b., silva M. c., gHiorse W. c.,

r. M., 1990. Detection of coliform bacteria in

Madsen E. L., 1994. Quantitative cell lysis of in-

water by polymerase chain reaction and gene

digenous microorganisms and rapid extraction

probes. Appl. Environ. Microbiol. 56, 307–314.

of microbial DNA from sediment. Appl. Environ.

carrigg c., rice o., KavanagH s., collins g.,

Microbiol. 60, 1572–1580.

o’FlaHerty V., 2007. DNA extraction metod af-

ograM a., sayler g. s., barKay T., 1987. The extrac-

fects microbial community profiles from soils

tion and purification of microbial DNA from se-

and sediment. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77,

diments. J. Microbiol. Methods 7, 57–66.

955–964.

ograM a., 2000. Soil molecular microbial ecology at

cooper j. e., rao j. R., 2006. Molecular approaches

age 20: methodological challenges for the futu-

to soil, rhizosphere and plant microorganism

re. Soil Biol. Biochem. 32, 1499–1504.

analysis. CAB International, Wallingford.

paul j. H., cazares l., tHurMond j., 1990. Amplifi-

cullen d. W., HirscH P. R., 1998. Simple and rapid

cation of the rbcL gene from dissolved and par-

method for direct extraction of microbial DNA

ticulatevDNA from aquatic environments. Appl.

from soil for PCR. Soil Biol. Biochem. 30, 983–

Environ. Microbiol. 56, 1963–1966.

993.

peršoH d., tHeuerl s., buscot F., raMbold g., 2008.

duarte g. F., soares rosado a., seldin l., Keijzer-

Towards a universally adaptable method for

Wolters a. c., van elsas J. D., 1998. Extraction

quantitative extraction of high-purity nucleic

of ribosomal RNA and genomic DNA from soil

acids from soil. J. Microbiol. Methods 75, 19–24.

for studying the diversity of the indigenous

robe p., nalin r., capellano c., vogel t. M., siMo-

bacterial community. J. Microbiol. Methods 32,

net P., 2003. Extraction of DNA from soil. Eur. J.

21–29.

Soil. Biol. 39. 183–190.

FelsKe a., engelen b., nübel u., bacKHaus H., 1996.

saano a., tas e., pippola s., lindströM K., van elsas

Direct ribosome extraction from soil to extract

J. D., 1995. Extraction and analysis of microbi-

bacterial rRNA for community analysis. Appl.

al DNA. [W:] Nucleic acids in the environment:

Environ. Microbiol. 62, 4162–4167.

methods and applications. trevors j. t., van

Frostegård å., courtois s., raMisse v., clerc s., ber-

elsas J. D. (red.). Springer-Verlag, Heidelberg,

nillon d., le gall F., jeannin p., nesMe X., siMo-

49–67.

net P., 1999. Quantitation of bias related to the

sessitscH a., gyaMFi s., stralis-pavese n., WeilHar-

extraction of DNA directly from soil. Appl. Envi-

ter a., pFeiFer U., 2002. RNA isolation from soil

ron. Microbiol. 65, 5409–5420.

for bacterial community analysis: evaluation of

gabor e. M., de vries e. j., janssen D. B., 2003. Ef-

different extraction and soil conservation proto-

ficient recovery of environmental DNA for ex-

cols. J. Microbiol. Methods 51, 171–179.

pression cloning by indirect extraction method.

soMMerville c. c., KnigHt i. t., straub W. l., col-

FEMS Microbiol. Ecol. 44, 153–163.

Well R., 1989. Simple, rapid method for direct

griFFitHs r. i., WHiteley a. s., o’donnell a. g., bai-

isolation of nucleic acids from aquatic environ-

ley M. J., 2000. Rapid method for coextraction

ments. Appl. Environ. Microbiol. 55, 548–554.

of DNA and RNA from natural environments

starK p. c., Mullen K. i., banton K., russotti r.,

for analysis of ribosomal DNA– and rRNA–

soran d., KusKe C. R., 2000. Pre-PCR DNA qu-

based microbial community composition. Appl.

antitation of soil and sediment samples: method

Environ. Microbiol. 66, 5488– 5491.

development and instrument design. Soil Biol.

Holben W. e., jansson j. K., cHelM b. K., tiedje J.

Biochem. 32, 1101–1110.

M., 1988. DNA probe method for the detection

steele H. l., streit W. R., 2006. Metagenomics for

of specific microorganisms in the soil bacterial

the study of soil microbial communities. [W:]

community. Appl. Environ. Microbiol. 54, 703–

Molecular approaches to soil, rhizosphere and

711.

plant microorganism analysis. cooper j. e., rao

Kozdrój J., 2003. Różnorodność mikroorganizmów

J. R. (red.). CAB International, Wallingford, 42–

glebowych w świetle badań molekularnych.

54.

Post. Mikrobiol. 43, 375–398.

tHaKuria d., scHMidt o., Mac siúrtáin M., egan d.,

KrseK M., Wellington E. M. H., 1999. Comparison

dooHan F. M., 2008. Importance of DNA quali-

of different methods for the isolation and pu-

ty in comparative soil microbial community

rification of total community DNA from soil. J.

structure analyses. Soil Biol. Biochem. 40, 1390–

Microbiol. Methods 39, 1–16.

1403.

KusKe c. r., banton K. l., adorada d. l., starK p.

torsviK v., 1980. Isolation of bacterial DNA from

c., Hill K. K., jacKson P. J., 1998. Small-scale

soil. Soil Biol. Biochem. 12, 15–21.

DNA sample preparation method for field PCR

trevors j. t., van elsas J. D., 1995. Nucleic acids

detection of microbial cells and spores in soil.

in the environment: methods and applications.

Appl. Environ. Microbiol. 64, 2463–2472.

Springer-Verlag, Heidelberg.

liesacK W., janssen p. H., rainey F. a., Ward-rainey

van eslsas j. d., Mäntynen v., Wolters A. C., 1997.

n. l., stacKebrand E., 1997. Microbial diversity

Soil DNA extraction and assessment of the fate

in soil: the need for a combined approach using

of Mycobacterium chlorophenolicum strain PCP-

molecular and cultivation techniques. [W:] Mo-

1 in different soils by 16S ribosomal RNA gene

dern soil microbiology. van elsas j. d., trevors

sequence based most-probable-number PCR and

j. t., Wellington e. M. H. (red.). Marcel Dekker

immunofluorescence. Biol. Fertil. Soils 24, 188–

Inc., New York, 375–433.

195.

lüdeMann H., artH i., liesacK W., 2000. Spatial

Weller r., Ward d. M., 1989. Selective recovery of

changes in the bacterial community structu-

16S rRNA sequences from natural microbial

re along a vertical oxygen gradient in flooded

communities in the form of cDNA. Appl. Envi-

paddy soil cores. Appl. Environ. Microbiol. 66,

ron. Microbiol. 55, 1818–1822.

754–762.

Wellington e. M. H., MarsH p., Watts j. e. M., bur-

Milling a., goMes n. c. M., oros-sicHler M., gotz

den J., 1997. Indirect approaches for studying

M., sMalla K., 2005. Nucleic acids extraction

soil microorganisms based on cell extraction

from environmental samples. [W:] Molecular

and culturing. [W:] Modern soil microbiology.

microbial ecology. osborn a. M., sMitH C. J.

van elsas j. d., trevors j. t., Wellington E. M.

(red.). Tylor & Francis, New York, 1–24.

H. (red.). Marcel Dekker, New York, 311–329.