Strona 1 z 2
Sprawozdanie 4.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/03
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie J
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Preparacja DNA z grasicy cielęcej
Grupa: IV
Wstęp
DNA to kwas deoksyrybonukleinowy. Pełni rolę nośnika informacji genetycznej organizmów żywych. Na jego podstawie syntezowane są białka złożone z sekwencji aminokwasów. DNA jest liniowym, nierozgałęzionym polimerem. Występuje w postaci dwuniciowej, podwójnej spirali. DNA tworzą dwie antyrównoległe (spolaryzowane) komplementarne łańcuchy.
Łańcuch składa się jest z powtarzających się nukleotydów: deoksyryboza, reszta fosforanowa, jedna z czterech zasad azotowych (kodują informację). Pomiędzy komplementarnymi parami
zasad A i T oraz C i G występują oddziaływania wodorowe, stabilizując strukturę dwuniciową DNA.
Do izolacji DNA wykorzystano materiał biologicznych w postaci grasicy cielęcej. Komórki grasicy charakteryzują się dużą względną zawartością DNA (stosunek objętości jądra zawierającego większość DNA do objętości całej komórki, jej cytoplazmy). Komórki młodych
osobników posiadają więcej materiału genetycznego niż stare. Są to czynniki ułatwiające izolację DNA. DNA izoluje się w celach poznawczych, np. wyznaczenie temperatury topnienia, czy poznanie sekwencji nukleotydów.
W jądrze komórkowych DNA nie występuje w postaci wolnej. Występuje natomiast w postaci
DNP (deoksynukleoproteid), czyli kompleksu białek i DNA. Łańcuch DNA naładowany ujemnie
(przez obecność reszt fosforowych) oddziałuje elektrostatycznie z dodatnio naładowanymi białkami histonami (posiadają aminokwasy, takiej jak arginina czy lizyna, które mają dodatnio naładowane reszty).
Wykonanie preparacji DNA można podzielić na trzy etapy:
I etap – homogenizacja materiału biologicznego; pozbycie się RNA, RNP i zawartości cytoplazmy. Zostaje DNP jako osad w roztworze.
II etap – rozdysocjowanie kompleksu DNA; denaturacja białek; ekstrakcja DNA do fazy wodnej; odwirowanie. Zostaje DNA w roztworze wodnym.
III etap – wytrącanie DNA z roztworu wodnego przez dodanie zmrożonego alkoholu
izopropanolego, mającego właściwości higroskopijne. DNA zostaje nawinięty na bagietkę szklaną.
Materiały
a) Odczynniki:
Zamrożona grasica cielęca (ok. 7 g) – materiał biologiczny,
0,51∙10–3 M ETDA,
SSC (1,5∙10–3 M cytrynian sodowy o pH 7,0 zawierający 0,15 M NaCl),
0,15 M cytrynian sodowy o pH 7,0,
20% SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu),
NaCl,
mieszanina Sevag’a (24:1 chloroform, alkohol amylowy),
95% izopropanol,
b) Szkło laboratoryjne:
zlewki 250 ml (4 szt.), 400 ml (1 szt.),
cylinder miarowy 100 ml (4 szt.), 250 ml (1 szt.),
pipety 10 ml (4 szt.), 25 ml (1 szt.),
bagietki (5 szt.),
Strona 2 z 2
Sprawozdanie 4.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/03
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie J
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Preparacja DNA z grasicy cielęcej
Grupa: IV
c) Aparatura:
Homogenizator/mikser,
Wirówka,
łaźnia wodna o temperaturze 55°C, łaźnia lodowa,
skalpel.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji „J”. Wydłużono czasy wirowania ponieważ zmniejszono liczbę obrotów na minutę. Nie wykonano końcowego
ważenia wyizolowanego DNA.
1. Pokrojono skalpelem grasicę cielęcą na możliwie drobne kawałki.
2. Homogenizowano próbkę przez 3 minuty z 25 ml SSC w łaźni lodowej.
3. Wirowano próbkę: 13 min., 3500 obr./min.
4. Zlano supernatant.
5. Osad przemywano 25 ml SSC.
6. Wirowano próbkę: 13 min., 3500 obr./min.
7. Powtórzono jeszcze dwukrotnie pkt. 5 i 6.
8. Osad przemywano 45 ml cytrynianu sodowego. Dodano 4 ml SDS.
9. Próbkę inkubować przez 15 minut w łaźnie wodnej o temperaturze 55°C, ciągle mieszając.
10. Dodano 4 g NaCl. Próbkę inkubowano dalej przez 10 minut.
11. Dodano 50 ml mieszaniny Sevag’a. Całość przeniesiono do rozdzielacza.
12. Intensywnie wytrząsano przez 10 minut. Pamiętając o wypuszczaniu gromadzących się gazów.
13. Zawartość rozdzielacza przeniesiono do probówek wirowych.
14. Wirowano próbkę: 20 min., 3500 obr./min.
15. Pobrano pipetą wodną (górną) fazę do osobnej zlewki.
16. Dodawano powoli izopropanolu powoli mieszając bagietką.
17. Wytrącający się DNA nawijano na szklaną bagietkę.
Wyniki
Po końcowym odwirowaniu zawiesiny w próbkach wirowych otrzymano roztwór trzyfazowy:
Górna warstwa to faza wodna, zawiera sól sodową DNA. Z tej warstwy wytrąca się DNA za pomocą izopropanol.
Środkową warstwę stanowi biały żel. Są to resztki po denaturowanych białkach przez SDS.
Dolna warstwa to faza organiczna. Nie zawiera DNA.
Wnioski
Uzyskano DNA nawinięty na szklaną bagietkę. DNA ma strukturę liniową. Wyizolowany materiał jest bezbarwny. Oznacza to, że w znacznym stopniu jest pozbawiony zanieczyszczeń
białkowych (w tym histonów).
Ważnym parametrem podczas preparacji jest pH. Odbiałczanie powinno się prowadzić przy obojętnym pH 7. W środowisku zasadowym zachodzi denaturacja DNA, w środowisku
kwaśnym zachodzi zaś adsorpcja na zdenaturowanych białkach.
Skuteczność preparacji zależały od użycia odczynników takich jak EDTA, cytrynian sodowy.
Kompleksują one jony metali takiej jak Mg2+, Mn2+, Co2+. Dezaktywując w ten sposób deoksyrybonukleazy, enzymy katalizujące hydrolityczny rozpad łańcucha DNA.